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- Denise Duquette
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2 Polymorphismes de l'adn Polymorphismes de restriction variation de séquence Polymorphisme de taille répétition de larges motifs minisatellites Polymorphisme de taille répétition de courts motifs CA repeat ADN (Chromosome pat) Amorce+ 18 répétitions CACACA...CA ADN Amorce+ (Chromosome mat) 19 répétitions CACACA...CA Amorce- Amorce- 2
3 Comparaison des profils alléliques entre ADN constitutionnel et ADN tumoral d'un même patient C T C T C T Profil homozygote Profil hétérozygote avec rétention d'hétérozygotie Profil hétérozygote avec perte d'hétérozygotie (LOH) 3
4 Série étudiée Carcinomes colorectaux : 40 polype : 1 métastases : 4 Histologie :Adénocarcinomes Lieberkuhniens 24 H / 16 F Age moyen : 58.9 extrêmes : 34a - 81a Localisation : rectum : 17 côlon G : 14 côlon D : 9 4
5 1 p Nombre de marqueurs étudiés : 8 Informativité (1 marqueur au moins) : 39T/40 Délétions : Tum. : 13/29 Méta. : 1/4 Points de cassure : 8 T Régions délétées communes : D1S243/D1S468 D1S199/D1S p Nombre de marqueurs étudiés : 3 Informativité (1 marqueur au moins) : 36T/40 Délétions : Tum. : 23/36 Méta. : 2/4 Points de cassure : 4 T Régions délétées communes : D17S796/D17S953 5
6 18 q Nombre de marqueurs étudiés : 2 Informativité (1 marqueur au moins) : 36T/40 Délétions : Tum. : 18/36 Méta. : 1/2 Points de cassure : 3 T Région délétée commune : D18S q Nombre de marqueurs étudiés : 2 Informativité (1 marqueur au moins) : 36T/40 Délétions : Tum. : 18/36 Méta. : 1/2 Points de cassure : 3 T Région délétée commune : D18S487 6
7 Corrélations 17p, 18q, 1p, Kras, p53 18qLOH 1pLOH Kras p53 mutation accumulation 17pLOH p: p: p: 0.32 p: qLOH p: p: 0.68 p: pLOH p: 0.47 p: 0.30 Kras mutation p:
8 8
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10 Syndrome H.N.P.C.C. HISTORIQUE AS Warthin: Description d une forme «héréditaire» de cancer colo-rectal dans une grande famille (famille G.) HT Lynch: «cancer family syndrome» à propos de deux grandes familles HT Lynch: Famille G CR Boland: introduction du sigle HNPCC pour: «hereditary non polyposis colo-rectal cancer» Critères d Amsterdam 10
11 Syndrome H.N.P.C.C. Critères d Amsterdam Agrégation familiale d au moins 3 cas de cancer colo-rectal (révision 99: tumeurs du spectre étroit) prouvés histologiquement liés deux à deux au 1er degré polypose colo-rectale exclue touchant 2 générations distinctes Diagnostiqué avant 50 ans dans au moins un cas. Syndrome HNPCC Spectre tumoral étroit : Cancer colo-rectal (colon droit, peu différencié, composante mucineuse, instabilité micro-satellitaire) Cancer de l endomètre Cancer intestin grèle Carcinome urothélial voies urinaires supérieures Spectre tumoral élargi : Adénocarcinome gastrique Cholangio-carcinome Cancer de l ovaire (AK endométrioïde) Glioblastome (synrome de Turcot) Carcinome sébacée (Syndrome de Torre-Muir) 11
12 HNPCC - Lynch, MSH2 E698X. Côlon 47 ans Utérus 47 ans Utérus 50 ans Larynx 47 ans Utérus 47 ans Côlon 40 ans Rectum 47 ans HNPCC - Lynch, MSH2: IVS10 +1 G>A. Côlon 71 ans Estomac 47 ans 69 ans 68 ans Côlon 38 ans AK Côlons 40 ans 42 ans RER+ 12
13 1300 personnes à haut risque membres de 23 familles d HNPCC (Lynch 1992) Localisations Observées Attendues Rapport O/A Côlon-rectum 287 Endomètre 53 Estomac (p<0.001) Intestin grêle (p<0.001) Système hépato-biliaire (p<0.05) Rein (p<0.01) Uretère (p<0.001) Vessie NS Ovaire (p<0.001) Bronche (p<0.05) Pancréas NS Sein NS Système hématologique NS Peau NS Larynx NS Cerveau NS HNPCC - Maladie héréditaire? Problème des phénocopies Concordance avec un mode de transmission mendelien : Études de ségrégation? Fréquence génique Classes de pénétrance Localisation génique : Étude de liaison génétique 13
14 Les études de liaison génétique Principe : comparaison de la ségrégation de deux locus à l intérieur d une généalogie Le locus maladie : identifié par son phénotype un locus marqueur : dont on identifie le génotype Difficulté : concordance génotype/phénotype pour le locus maladie Phénocopies - pénétrance incomplète 14
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17 Hétérogénéité inter-familiale - HNPCC (Lynch 1992) AdenoK de l endomètre p<0.01 K uretère et rein p<0.01 K de l ovaire p< 0.04 K estomac K système hépato-biliaire K intestin grêle NS NS NS Idéalement : 1 seule famille Pour être significatif Cumul de familles en tenant compte d une éventuelle hétérogénéité génétique Sélection de familles particulières : spectre tumoral : syndrome sein - ovaire âge moyen d apparition des tumeurs < 45 ans 17
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20 90 tumeurs colorectales microsatellites testés : 5q, 17p, 18q, 15q Décalage de migration dans 25 tumeurs (28%) Corrélation positive avec le siège proximal Corrélation inverse avec la présence de délétion (12tum/14 sans L.O.H. montrant une instabilité) Perucho et al (juin 1993) Thibodeau et al (mai 1993) Résultats semblables 12% de tumeurs colorectales montrent une instabilité des séquences micro-satellites Nette prédominance des formes localisées au côlon droit Les systèmes de réparation de l ADN (E. Coli) Anomalies conformationnelles (ex: dimère thymine) Mésappariements Altération de l ADN ex: désamination de 5 méthyl-cytosine Erreurs d incorporation nuléotisique lors de replication (ou de réparation) Hétéroduplex par recombinaison Aboutissent le plus souvent à un phénomène d excision-resynthèse. 20
21 Les systèmes de réparation des misappariements (E. Coli) Le système Mut HLS responsable du phénotype «mutator» reconstituable in vitro Mut S Mut H Mut L Uvrd (Mut U) DNA pol + DNA ligase Le système VSP Le système Mut Y reconnaît et se fixe sur le mésappariement nucléotidique identifie le brin à corriger (GATC non méthylé) fonction activatrice assure l excision (non spécifique du brin non méthylé Les systèmes de réparation des mésappariements : S. Cerevisiae Mut S MSH 1 (mitochondrial) MSH 2 MSH 3 rôle mineur MSH 4 Mut L MLH 1 PMS 1 Mut H 0 Mutants msh2, pms1 et mlh1 montrent chez S. Cerevisiae un taux élevé de contraction et d expansion des séquences «CA repeat». 21
22 Localisation chromosomique hmsh 2 Hybridation sur «panel» d hybride somatique homme/hamster Localisation sur le chromosome 2 Localisation fine chez la souris sur le chromosome murin 17 dans une région d homologie avec la région 2p21 humaine Gène HNPCC lié à D2S23-2p16 Hmsh 2 gène Clonage par PCR dégénéré Amorces MSH 2 dans une région conservée cdna humain issue poly(a)+ RNA 1 clone 81% homologie avec MSH 2 Utilisé comme sonde pour cribler une banque de cdna humain Un insert de 3111pb contenant un cadre de lecture ouvert de 2727pb hmsh2cdna 22
23 Mutations hmsh 2 Familles liées non disponibles 7 tumeurs coliques avec instabilité des microsatellites Dans 2 tumeurs : mutations au niveau de sites d épissage 9 petites familles HNPCC Dans 2 familles : les patients atteints sont hétérozygotes pour une mutation C>T 29 familles HNPCC Analyse de liaison Mutation hmsh 2 non liaison exclusion Total informative de liaison Mutation * Mutation non détectée Total
24 Modèle de Knudson conservé Mutation à l état hétérozygote Tissus normaux Mutation à l état homozygote Tissu tumoral Pas d évidence d instabilité Instabilité Prédisposition génétique de type HNPCC Déficience des systèmes de réparation des misappariements Instabilité du matériel génétique avec hypermutabilité 24
25 La maladie de Lynch La maladie de Lynch Le phénotype RER «REplication ERrors» ou instabilité micro satellitaire «profils MSS MSI» 25
26 Novembre 1993 Localisation par liaison génétique d un 2ème locus impliqué dans une partie des familles d HNPCC sur le bras court du chromosome 3. Mars 1994 Identification du gène responsable : hmlh 1 : human Mut L homologue Septembre 1994 Identification et localisation de 2 gènes impliqués dans une partie des familles d HNPCC hpms 1 (homologue de Mut L) - 2q31 hpms 2 (homologue de Mut L) - 7p22 Phénotype RER+ = Décalage de mobilité électrophorétique observé pour au moins 2 micro-satellites/7 Tumeurs coliques Phénotype RER+ HNPCC n = tumeurs (79%) Sporadiques n = 46 6 tumeurs* (13%) * siège tumoral : côlon droit 26
27 Phénotype RER+ Tumeurs coliques Cancers sporadiques : 8/49 (16%) Cancers HNPCC : mutation constitutionnelle : 9/9 (100%) mutation non identifiée : 16/20 (80%) Adénomes sporadiques : 1/33 (3%) Adénomes HNPCC : 8/14 (57%) Spectre tumoral HNPCC Carcinome gastrique : 6/33 (18%) Carcinome endomètre : 4/18 (22%) Tumeurs HNPCC : 6/6 (100%) Autres tumeurs Cancer broncho-pulmonaire : 0/85 Cancer sein : 0/84 Cancer testicule 0/86 Exemples d instabilité microsatellitaire pour chacun des marqueurs testés. BAT25 BAT40 D16S512 Blood Blood Blood Tumor BAT26 Tumor LmycVpA Tumor D16S515 Blood Blood Blood Tumor Poly A Tumor Tumor Poly CA 27
28 TUMEURS RER+ Autour de 10% des carcinomes colorectaux Mutation germinale d un des gènes MMR Mutation somatique d un des gènes MMR Aucune mutation MMR retrouvée Maladie de Lynch 20% des CRC-MSI Cancer colorectal de type MSI (15% de l ensemble des CRC) CpG island methylator phenotype: «CIMP» (voie des adénomes festonés) 80% des CRC-MSI Atteintes précoces: risque cumulé à 60 ans supérieur à 40% chez l homme Constitue 50% des CRC survenant après 90 ans 28
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30 Clinical Benefit of Pembrolizumab Treatment According to Mismatch-Repair Status. Le DT et al. N Engl J Med 2015;372:
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