Réplication de l ADN. Dr Annie M. Bérard Dr Nicolas Sévenet. Avertissement

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1 Année UE 1 Atomes, biomolécules, génome, bioénergétique, métabolisme III-le génome : sa structure, son expression Organisation, évolution et fonction du génome humain Réplication de l ADN Dr Annie M. Bérard Dr Nicolas Sévenet 1 Avertissement Certaines images de ce cours sont tirées de livres et d articles de journaux scientifiques et couvertes par le copyright. Pour la plupart, elles peuvent être utilisées pour l enseignement comme l illustration d un cours, mais ne peuvent pas être reproduites sans autorisation. En conséquence ce fichier est à usage exclusivement personnel. 2 1

2 Réplication de l ADN : plan du cours I. Caractéristiques générales a) Phase S b) Processus semi-conservatif II. Étapes de la réplication a) Initiation b) Élongation-polymérisation III. Particularités de la réplication de l ADN chez les eucaryotes a) Polymérases b) Télomères et télomérases c) Nucléosomes d) ADN mitochondrial 3 Réplication I- Caractéristiques générales a) Phase S C est une nécessité AVANT la division cellulaire (mitose) Elle a lieu une seule fois au cours du cycle cellulaire, en phase S La réplication perpétue l information génétique Elle assure donc le maintien de l intégrité de l information génétique 4 2

3 Réplication I- Caractéristiques générales b) Processus semi-conservatif Processus semi-conservatif : Chaque molécule fille d ADN conserve un brin parental Brin parental 1 Brin parental 1 Brin parental 2 Brin néosynthétisé 2 Brin néosynthétisé 1 Brin parental 2 ADN bicaténaire parental ADN bicaténaire néo-synthétisés Alberts et coll. Fig

4 radient de chlorure de césium Expérience de Meselson-Stahl (1958) 7 Une explication illustrée de l expérience de Meselson et Stahl 8 4

5 a) initiation Origines de réplication Caractéristiques Lieu de modification de la torsion de l ADN par des protéines Séquences spécifiques d ADN (quelques centaines de nucléotides) Sites de fixation de protéines Phase 1 Reconnaissance des Origines de Réplication fixation du complexe ORC (Origin Recognition Complex) + CDT1 + CDC6 Fixation du complexe MCM (minichromosome maintenance proteins) à activité hélicase L ensemble forme le complexe de pré-réplication qui reste inactif jusqu à l entrée en phase S 9 Etapes préliminaires à la synthèse de brins complémentaires 10 5

6 a) initiation Phase S Dégradation de CDT1 et élimination de CDC6 Ouverture du double brin : hélicase Rupture des liaisons hydrogène maintenant les bases appariées deux à deux Stabilisation des brins séparés par RP-A (Replication Protein A) et/ou SSB single strand binding proteins Fixation de l ADN polymérase α (Polα) Synthèse de l amorce ARN-ADN (ARN polymérase-adn dépendante) Activité primase Activité ADN polymérase Détorsion de la chaîne : topoisomérases 11 Hélicase Hexamère avec orifice central pour ADN monocaténaire Progression par hydrolyse d ATP sur de l'adn simple brin Alberts et coll. Fig

7 Figure R5 Formation du complexe de réplication et formation d une fourche de réplication 13 Primase Primase ARN polymérase ADN dépendante Matrice d'adn, Pas d'amorce, rntp, Allonge de 5' vers 3' Amorce (ARN) Primase Alberts et coll. Fig

8 Figure R6 15 Figure R7 25 ans plus tard // exp de MS : découverte des topoisomérases Eucaryotes : -Coupure d un brin de l ADN -Passage à travers le trou de l autre brin d ADN -Ligature par une topoisomérase (Euc : I, II) Ex action topoisomérase = détorsion des spires d ADN 16 8

9 b) Élongation-polymérisation Déroulement de l ADN des nucléosomes Décompaction des super-tours négatifs : topoisomérases I, II Mise en place de la fourche de réplication Reconnaissance du complexe matrice-amorce Remplacement de la Polα par δ ou ε 2 Polymérases participent à l élongation : synthèse ADN complémentaire à partir de l amorce ARN ADN pol δ : élongation du brin principal. Fixation grâce au PCNA. Elle possède une activité de correction ADN pol δ ou ε : sur le brin secondaire, formation des fragments Okazaki mais plusieurs fragments formés 17 3 La fourche de réplication Le complexe de réplication (simplifié) Brin ancien Avancée du complexe Brin nouveau ADN Polymérase 3 3 Clamp PCNA Fragments d Okazaki Amorce Protéines SSB Primase Hélicase Alberts et coll. Fig 5-28 Polymérase Chargeur de clamp = RF-C Disposition asymétrique 18 9

10 Figure R10 19 Figure R11 Brin continu / direct / précoce F1 F2 Brin discontinu / indirect / tardif ou retardé (longueur brin = 100 à 200 bases) F3 3 Amorce 20 10

11 La synthèse est semi-discontinue Au niveau de chaque fourche de réplication - Brin continu (direct, précoce) : la synthèse s effectue dans le même sens que la propagation de la fourche (synthèse -3 ) - Brin discontinu (indicrect, tardif, retardé) : la synthèse s effectue en sens inverse de la propagation de la fourche fragments d OKASAKI - Fourche de réplication asymétrique 21 La synthèse est semi-discontinue Allongement FAUX! 22 11

12 La synthèse est semi-discontinue Allongement VRAI! 23 b) Elongation-Polymérisation Formation et allongement d un nouveau brin d ADN (brin néosynthétisé) Par fixation des désoxyribonucléosides triphosphates les uns aux autres Dont l ordre est défini selon un brin modèle (matrice, parental) par complémentarité des bases (A=T; C) Le brin nouveau est synthétisé toujours dans le sens -3 Le brin matrice (modèle, parental) est «lu» dans le sens 3 - Les deux brins (néo-synthétisé et parental) sont anti-parallèles La polymérisation concerne donc les brins en cours de synthèse Elle est catalysée par une ADN polymérase (ADN-dépendante) 24 12

13 b) Elongation - Polymérisation Complémentarité des bases 25 La polymérisation s effectue TOUJOURS dans le sens -3 Brin matrice 3 - Sens de lecture 3-3 C T A T C Brin néosynthétisé -3 C A P P P OH 3 P P P T OH La polymérisation est unidirectionnelle 3 C T A T C C A T P P P Sens de synthèse -3 P OH 3 P P 26 13

14 Figure R12 27 La réplication est bi-directionnelle O = origines de réplication R = réplicons Temps Photographie en microscopie électronique d un brin d ADN en cours de réplication Fourches de réplication 28 14

15 Figure R11 Brin continu / direct / précoce F1 F2 Brin discontinu / indirect / tardif ou retardé (longueur brin = 100 à 200 bases) F3 3 Amorce 29 Élongation du brin discontinu Fragments d Okazaki ADN Pol δ ADN Pol δ 30 15

16 ADN ligase Fragments d Okazaki Amorces (Primase) 3 3 Nouveau brin (ADN polymérase) Raboutement des fragments d'okazaki 31 Figure R13 16

17 III- Particularités de la réplication de l ADN chez les eucaryotes a) Polymérases ADN pol α β δ ε γ Sous-unités 4, dont primase et polymérase Localisation Nucléaire Nucléaire Nucléaire Nucléaire Mitochondriale Fonction Réplication BER Réplication BER, NER Réplication BER, NER Réplication et réparation Activité exonucléase Processivité faible faible non non oui oui oui élevée (PCNA) élevée (PCNA) élevée Fidélité élevée faible élevée élevée élevée 33 III- Particularités de la réplication de l ADN chez les eucaryotes b) Télomères et télomérases Les télomères : Fragments terminaux des chromosomes. Extrémité 3 plus longue Non codants mais servent à maintenir l intégrité du matériel génétique. Séquences répétitives en tandem riches en : TTA 3 3 C A T A T T A C C C T T A A T T Repliement en épingle du fragment 3 simple brin protection contre les DNases T T A A T T 34 17

18 III- Particularités de la réplication de l ADN chez les eucaryotes b) Télomères et télomérases Importance des télomères La réplication exige une amorce d ARN qui est ensuite dégradée et non remplacée la réplication des extrémités des chromosomes est incomplète perte de 50 à 200 nucléotides par cycle 35 III- Particularités de la réplication de l ADN chez les eucaryotes b) Télomères et télomérases La longueur des télomères est le reflet du nombre de mitoses horloge du vieillissement cellulaire 30 mitoses 10 mitoses 10 mitoses Sénescence : Cellule vivante, métaboliquement active mais absence de division 36 18

19 III- Particularités de la réplication de l ADN chez les eucaryotes b) Télomères et télomérases Il y a une érosion des télomères si pas d activité télomérase Phénomène normal dans l organisme adulte Sénescence et mort cellulaire (télomères < 5-6 kb) Horloge du vieillissement cellulaire Prévient les phénomènes cancéreux Activité télomérase (synthèse de télomère) lors de l embryogenèse, les multiplications cellulaires sont massives mise en place d une activité de maintien des télomères Après la naissance diminution et perte de cette activité sauf dans certaines cellules : cellules souches adultes, cellules germinales Pathologies : les cellules cancéreuses (sur)expriment les télomérases (facteur d immortalité) Les télomères sont donc re-synthétisés par une transcriptase inverse : la télomérase 37 III- Particularités de la réplication de l ADN chez les eucaryotes b) Télomères et télomérase La télomérase : synthèse des télomères Constituée de 2 sous-unités d une sous-unité catalytique (htert) : ribonucléoprotéine, transcriptase réverse spécialisée d un ARN-matrice qui présente la séquence complémentaire AATCCC (htr) Stabilise les télomères en ajoutant des séquences TTA aux extrémités des chromosomes : compense le raccourcissement télomérique lié aux mitoses. Élongation du télomère à partir d une matrice de ARN incluse dans la télomérase

20 III- Particularités de la réplication de l ADN chez les eucaryotes b) Télomères et télomérase ARN structurel Doigts Télomérases = Enzymes riboprotéiques = Sous-unité protéique + cœur catalytique ARN ARN guide Paume Alberts et coll. Fig 5-42 ADN allongé Pouce 39 III- Particularités de la réplication de l ADN chez les eucaryotes b) Télomères et télomérase 3 Allongement de l extrémité 3 par recopiage de «l amorce» d'arn interne Télomérase Alberts et coll. Fig 5-43 ADN polymérase 40 20

21 Notion de base Quantité d ADN nucléaire en fonction du cycle cellulaire 4c chromatides = 92 chromatides 2n chromosomes = 46 chromosomes à 2 chromatides 2c chromatides = 46 chromatides 2n chromosomes = 46 chromosomes à 1 chromatide Voir diapositive 26 cours UE2 Edith Chevret Chromatine et Chromosomes Voir diapositive 6 cours UE2 JB Corcuff Contrôle moléculaire du cycle cellulaire 41 Figure R15 : Redistribution des nucléosomes pendant la réplication 21

22 Réplication de l ADN mitochondrial Mitochondries Organites auto-réplicatifs Taille de bp ( fois plus petit que génome nucléaire) énome circulaire (brins H, L complémentaires) Réplication du génome mitochondrial Relâchement de l ADN par des topoisomérases 2 origines de réplication bien définies (orih, oril) Pas de fourche de réplication Réplication unidirectionnelle des 2 brins dans des directions opposées Super enroulement par des gyrases 43 Réplication de l ADN mitochondrial aj.org/html/eukaryotic_d NA_Replication6- Replication_of_Organelle_ DNA.htm 44 22

23 Conclusion Régulation de la réplication permet une réplication fidèle Dérégulation accumulation progressive de mutations génomiques/chromosomiques/ponctuelles prolifération cellulaire non contrôlée cancer Cibles thérapeutiques inhiber la réplication de l ADN Inhibiteurs de topoisomérases Agents intercalants Agents alkylants (dérivés du platine) 45 23