METHODOLOGIE EN ANATOMIE PATHOLOGIE SESSION 2008-2009 HIBRYDATION IN SITU Dr Mokrane Yacoub. AHU Histologie Faculté de médecine de Poitiers Service d anatomie pathologique
PLAN I- Définition et principes de l hybridation in situ II- Matériel A - Les sondes B - Marquages C - Détection du signal III- Contrôles de la spécificité d hybridation lv- Méthodes et Protocoles V- Références
I- Définition et principes de l hybridation in situ
Définition et principes de l hybridation in situ
II- Matériel
A- Les sondes
B- Marquages
Les marquages Selon la nature de la sonde : ADNc : nick-translation ou random priming ou PCR ARN : transcription in vitro Oligonucléotide : 3 tailing
1. Marquage des sondes ADN
1. Marquage des sondes ADN
1. Marquage des sondes ADN
1. Marquage des sondes ADN
2. Marquage des sondes ARN
2. Marquage des sondes ARN
3. Marquage des Oligonucléotides
3. Marquage des Oligonucléotides
C- Détection du signal
III- Contrôles de la spécificité d hybridation
IV- Méthodes et Protocoles
Nature des tissu Tissu frais Tissus congelés -80 Tissu fixé dans le formaldéhyde à 4% pendant 12 h et mis dans le sucrose pendant 24-48h Fixé et inclus en paraffine (sensibilité moins bonne)
ABut : Pré Traitement - permettre à la sonde marquée d atteindre l acide nucléique - réduire le bruit de fond, et les liaisons non spécifiques 6) Post fixation : Inactiver les Rnases Endogènes 8) Perméabilisation et déprotéinisation : (les liaisons covalentes de la PFA empêchent l accès aux sondes dans la cellule) - Pérméabilisation: destruction partielle des membranes cellulaires Détergent (Triton, saponine ), éthanol, enzymes (lipases) - Déprotéinisation: protéines endogènes associées aux acides nucléiques 3) Acétylation : élimine le bruit de fond en se fixant sur des site de fixation non spécifique (masque les fonctions amines) 4) Préhybridation: saturer les sites de fixation non spécifiques Incubation du tissu avec le tampon d hybridation
B- Hybridation Incubation les coupes avec la sonde marquée en présence du tampon d hybridation à une température permettant une HIS spécifique Température de fusion: stabilité énergétique de l hybride (Tm) Tampons d hybridation - Formamide désionisée : abaisse Tm (moins agressives pour la morphologie) déstabilise les liaisons hydrogènes - Tampon SSC ph7 : abaisse Tm, les ions Na+ interviennent dans la concentration en cation (force ionique), stabilité de l hybride - DiThioThréitol (DTT): pour les sondes marquées au soufre 35 - Sulfate de dextran: HIS sur lame (aug la concentration de sonde) - ARNt de levure, ADN de sperme de saumon, solution de Denhardt s: sature des liaisons non spécifiques par compétition avec des macromolécules - DiEthylPyroCarbonate (DEPC): inhibiteur des RNases
C- Lavages Eliminer l excès de sonde non hybridée et dissocier les hybrides illégitimes (diminuer le bruit de fond) -Lavages successifs : bains en Tampon SSC de concentration décroissante -TRT par RNase A : dégrader les sondes non hybridées Protocoles doivent être adaptés au système matériel/sonde utilisé
D- Détection du signal Révélation de l haptène incorporé dans les Hybrides - Méthode - Soit immunologique basés sur des réactions AG-AC - Soit enzymatique basés sur des réactions ligand-anti ligand - Visualisées par le produit d une réaction enzymatique (peroxydase, phosphatase alcaline) ou par émission de fluorescence (fluorescéine.) - Les conjugués enzymatiques sont révélés par des chromogènes de différentes couleurs :. Pour la phosphatase alcaline (NBT-BCIP bleu foncé, INT/BCIP rouge). Pour la peroxydase (DAB marron, AEC rouge) E- MONTAGE Préférable d utiliser un montage aqueux de type Mowiol
F- Visualisation
V- Références
V- Références - Sites CHU Pitié salpêtrière Paris http://www.chups.jussieu.fr/polys/histo/histop1:poly.tdm.html - In situ Hybridization Protocols. Darby A and Tim D. Hewiston. (2006) Third Edition. Methods in Molecular Biology. Humana press. - Histological detection of messenger RNAs With biotinylted synthetic oligonucleotide probes. A.F.Guitteny (1989). J.Histochem.Cytochem.36,PP; 563571 - Hybrydation In Situ. O.Devergne, M.Peuchemaur et D.Emilie.(1991) Société Française d Immunologie, Les Editions INSERM.
Fin