ADN et protéines au service du contrôle des denrées alimentaires problématiques, solutions et limitations Journées scientifiques du CCCTA 2004 Les Diablerets (VD) Marcel KOHLER, Claude CORVI Service de Protection de la Consommation 22 quai Ernest Ansermet, 1211 Genève-4 www.geneve.ch/consommation
Objectif de la présentation Illustrer au travers de 2 exemples l utilisation de techniques issues de la biologie dans le cadre du contrôle de composition des denrées alimentaires Comment maîtriser les attentes d analyses quantitatives 2
Plan de l exposé Introduction Le SPCo Les analyses de contrôle des denrées alimentaires Les organismes génétiquement modifiés Quelques mots sur les OGM Quantification des OGM par real-time PCR Les allergènes alimentaires La problématique des allergènes alimentaires Leur détection et/ou quantification: ELISA, PCR ou real-time PCR 3
Le Service de protection de la consommation (SPCo) Institut d hygiène laboratoire cantonal service du chimiste cantonal service de protection de la consommation Contrôle des denrées alimentaires commercialisées à Genève Protection de la santé publique Lutte contre la tromperie 43 personnes :scientifiques, administratifs et inspecteurs 4
Le contrôle des denrées alimentaires Matrices variables et souvent inconnues Analyses très variées Evolution des besoins parfois très rapide Appréciation des résultats selon des critères juridiques Contrôle de composition dosage d une substance 5
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Le contrôle des denrées alimentaires Matrices variables et souvent inconnues Analyses très variées Evolution des besoins parfois très rapide Appréciation des résultats selon des critères juridiques Contrôle de composition dosage d une substance 7
Le contrôle de composition Abundance 8000000 7000000 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 Time--> TIC: 2903013.D 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 SCREENING 35S, GEL D AGAROSE 2%, 80v, 100 min 207 bp Blanc Blanc STD 0.1 % SOJA RR TOFU BIO 8
Les techniques «biologiques» Microbiologie Techniques immunologiques (Vidal, ELISA, immuno-affinité) PCR, real-time PCR (OGM) RFLP-PCR (Détermination d espèces) Examen visuel/microscopiques (contrôle vétérinaire des viandes) Exemples choisis: OGM par real-time PCR Allergènes par ELISA 9
Les organismes génétiquement modifiés Un organisme vivant dont on a modifié l ADN afin de lui conférer des propriétés particulières Une technologie adoptée par 5.5 Mio d agriculteurs 52.6 Mio d hectares cultivés dans le monde (env. la surface de la France) Exemples d OGM Maïs résistant à la Pyrale Soja résistant à un herbicide Tabac résistant au froid Fraises résistantes à la moisissure Tomates à mûrissement retardé Saumon à croissance rapide 10
Les OGM dans le monde 2 types d OGM représentent à eux seul 99% des cultures mondiales: La résistance à l herbicide Roundup La synthèse de toxine Bt USA Chine Argentine Canada % de la surface Cultivée totale 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Maïs Soja USA Canada Argentine 22% 3% 6% 1% Autres 68% 11
Les OGM en Suisse et en Europe Europe, Suisse USA, Chine, Argentine Principe de précaution, connaissances actuelles considérées comme insuffisantes. Innocuité admise en fonction des connaissances actuelles Surveillance postérieure à la commercialisation obligatoire et autorisations de culture limitées à 10 ans (UE) Etiquetage et traçabilité doivent être garantis. OGM considérés comme équivalents, voire plus sûrs que les cultures non-ogm Refus d imposer un label, position de l UE vue comme une entrave au commerce 12
La législation en matière d OGM 4 OGM autorisés dans les denrées alimentaires en Suisse Maïs Bt-11 Maïs Bt-176 Maïs Mon-810 Soja Roundup Ready Condition: Si un ingrédient d une denrée en contient plus de 1% Mention obligatoire sur l emballage 13
L ADN d un maïs Bt à la loupe Protéine Bt Maïs OGM P Gène Bt T P sélection T INV 35S gène NOS INVERTASE d intérêt Gène de référence (quant.) Maïs non OGM INV 14
La recherche d OGM, protéines ou ADN? Recherche de la protéine exprimée Simple (ELISA ou bandelettes) Pas d équipement coûteux Quantitatif possible Pas forcément exprimée dans tous les organes Pas de screening possible Pas applicable aux denrées complexes ou traitées technologiquement Recherche de la séquence d ADN modifiée Méthode de screening Event specific Quantitatif possible ADN plus stable Plus complexe 15
La méthodologie appliquée au SPCo Screening 35S ou NOS L échantillon contient-il un organisme ayant subi une manipulation génétique PCR spécifique (4 OGM admis en CH) S agit-il d un OGM autorisé en Suisse Quantification Si autorisé en Suisse, quelle est sa teneur 16
Le seuil des 1% et ses conséquences Rendre la PCR quantitative PCR compétitive Real-time PCR Disposer de standards d OGM fiables 17
La PCR conventionnelle Multiplication exponentielle du gène cible En théorie: On double le nombre de copie à chaque cycle En pratique:le rendement des cycles n est pas constant... Nombre de copies Pas de proportionnalité entre le nombre de copies avant et après PCR 18 Cycles
Le principe de la real-time PCR 1) hybridation 2) Polymérisation et clivage de la sonde fluorescence 3 5 3 5 PRIMER 1 PRIMER 1 F Q PROBE F Q PRIMER 2 PRIMER 2 5 3 5 3 F Q 1)Polymérisation terminée fluorescence 3 5 PRIMER 1 PRIMER 2 5 3 19
Le principe de la real-time PCR 2 Fluorescence blanc 10000 copies 5000 copies 1 000 copies Ct = f(copies initiales) Treshold fixé blanc 10 20 30 40 Cycle PCR Ct Ct Ct 20
La quantification par real-time PCR Quantifier Oui mais par rapport à quoi? Ou comment rapporter un nombre de copies d ADN à un % de transgène dans le maïs Approximation: Une unité de masse de maïs contiendra le même nombre de copies d ADN qu elles soit transgénique ou non 21
Le gène de référence ou le «standard interne» de la real-time PCR On effectue 2 PCR en parallèle Maïs OGM P Gène Bt T P sélection T INV 35S gène NOS INVERTASE d intérêt Gène de référence (quant.) Maïs non OGM INV 22
La conversion: copies d ADN % pondéral Quantification relative Copies ADN OGM Copies ADN maïs Qantité maïs OGM Quantité maïs = % maïs OGM dans l ingrédient Suppose que: Pas de différence d amplifiabilité des deux ADN Dégradation équivalente pour les deux ADN lors de traitements technologiques 23
La quantification en pratique:la mesure Plaque PCR 96 puits invertase gène Bt 3 contrôles négatifs 5 standards (triplicat) Échantillons (triplicat) Blancs d extraction (triplicat) 24
La quantification en pratique: l évaluation Ct = f (conc en OGM [%]) Fluorescence Treshold fixé gène cible invertase DCt blanc DCt 0.8 Calibration de 0.1 à 5 % 0.6 0.4 0.2 0 y = 3.637x - 9.045 R 2 = 0.9959-0.2-0.4 log conc. % -0.6-0.8-7 -8-9 -10-11 -12-13 -14 10 20 30 40 Cycle PCR Ct Ct 25
Quelques résultats > 1 % 0.1 < x < 1 % < 0.1 % 85 produits 2003 0 1 6 77 produits 2004 2 2 3 satisfaisant Taux de contamination constant depuis 2-3 ans 26
Caractéristiques de la méthode Les performances Sélectivité supérieure à la PCR traditionnelle grâce à l utilisation des sondes spécifiques Rapide (2 h), résultats directs (pas d électrophorèse) LOD fixée à 0.1% en pratique Les points faibles Mise en jeu de 2 systèmes logarithmiques incertitude élevée, de l ordre de 25% 27
Quelques cas limites La représentativité Exemple: Echantillonnage: 0.1 % = 1 grain de maïs parmi 1 000 Problèmes liés aux échantillons pauvres en ADN 100 ng d ADN de maïs correspondent à 37 000 copies de génome Dans ce cas: 0.1 % d OGM représentent 37 copies prudence Les incertitudes liées au génome Insertions multiples du gène? Gene-stacking 28
OGM par real-time PCR - Conclusion Real-time PCR permet le dosage d une variété transgénique par rapport à l ingrédient (maïs, soja, ). Quantification par rapport à l aliment complet serait beaucoup plus difficile Méthode peut être très spécifique Facile à mettre en oeuvre Possibilité de détecter plusieurs séquences cibles simultanément (multiplex-pcr) 29
Les problèmes, besoins futurs Standards: disponibilité, répétabilité 1 probe par OGM, actuellement 4 OGM en CH Solution partielle: real-time PCR multiplex Futur? Systèmes d extraction d ADN dédiés aux aliments Aliments ayant subi un traitement technologique drastique, p. ex Corn-Flakes peu d ADN+ fragmenté Nouvelles générations OGM, transformations chloroplastiques 30
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Les allergies alimentaires, quelques données Prévalence : 1-2% des adultes, 5-8% des enfants 10 Mio personnes en UE Cas : 120-150 décès/an et 29 000 traitements d urgence aux USA Comparable en UE Responsables : 8 aliments causent >90 % des allergies Mesures possibles : Eviter les aliments allergènes!! 32
Définition de l allergie Adverse reaction to food Observé chez tous les individus ayant consommé l aliment Aversion Observé chez certains Individus suceptibles Microbiologie Hypersensibilité non allergique Allergie alimentaire Toxicité Pharmacologie Mecanisme inconnu Anormalie métabolique Médiation IgE immédiat Médiation non- IgE retardé 33
Les signes d allergie Cutanés: Démangeaisons Rougeurs Eczema Conjonctivite Gastro-intestinaux: Gonflement ou démangeaisons orales Nausée, vomissements Douleurs et crampes abdominales Diarrhée Respiratoires: Ecoulement nasal Asthme Enflement du larynx Systémique: Choc anaphylactique 34
Quels sont les aliments allergènes Les principaux, par ordre d importance: Chez l enfant: Chez l adulte: Lait de vache Œufs Soja Arachides Noix Poisson et crustacés Arachides (50% des décès liés aux allergies alimentaires) Noix Crustacés Poisson Oeufs Mais aussi: moutarde, céleri et sésame, fruits 35
Les substances mises en cause 2 exemples Protéines ou glycoprotéines, souvent sous forme d oligomères (5-200 kda) Noisette Lait de vache Principaux allergènes: Doses seuil: Stabilité thermique: Reactions croisées Principaux allergènes: Doses seuil: Stabilité thermique: Reactions croisées Cor A 1 1 à 1000 mg de protéines ou 6.4 à 6400 mg de farine de noisette Mauvaise Pollens de bouleau, orme Caséine, α et β-lactoglobulines, BSA, les immunoglobulines sériques 1 µg à 6 g de protéines Excellente, peut augmenter l allergénicité - 36
Que veut on vérifier? L absence d allergènes cachés non déclarés contamination au niveau de la production, du stockage ou du transport Ingrédients inattendus ou illicites Quelques exemples de conséquences graves ou létales: Caséine dans le saumon Protéines de soja dans des steak hachés Copeaux d amandes = arachides désodorisées 37
Quel seuil faut-il fixer? SUISSE: EUROPE: Avis d experts: Déclaration obligatoire si la denrée contient plus de 1 g/kg d ingrédient allergène Les ingrédients allergènes doivent être déclarés, pas (encore) de limite fixée. Limite à fixer entre 1 et 100 mg/kg 38
Que va-t-on rechercher? Selon la base légale: Analytiquement: Les choix: La présence de l ingrédient allergène (noisette, oeuf, ) Une substance spécifique de l ingrédient Teneur la plus constante possible La protéine allergène Une autre protéine L ADN de l ingrédient Une substance chimique 39
Protéines ou ADN? Protéines Les allergènes sont des protéines Quantitatif Moins stable que l ADN ADN Le risque de faux négatifs L ADN n est pas spécifique à «l organe»: œuf ou viande de poulet? Temps d analyse plus long 40
Les méthodes à disposition- protéines RAST/EAST inhibition SDS-PAGE immunoblotting Cell response factor release assays Rocket immuno-electrophoresis DOT immunoblotting Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) Mass spectrometry techniques 41
Les méthodes à disposition - ADN PCR real-time PCR Biosensors PCR-ELISA 42
Principe du sandwich-elisa AC Protéines Rinçage Rinçage 2ème AC Substrat 43
Quantification de noisette par ELISA Calibration ELISA noisette 2.5 2 y = 0.0231x + 0.2454 R 2 = 0.9982 Abs (450 nm) 1.5 1 0.5 0 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 100.0 Concentration [ppm de noisette] Répétabilité de la procédure : 4% (n=6) (extraction+elisa) 44
Calibrer en noisette, pas si simple 0.9 Réponse [abs. Norm.] 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 120.0 Concentration [ppm de noisette] Calibration du fabricant Noisettes fraîches A Noisettes fraîches B Noisettes fraîches A chauffées à 200 C 45
Les pièges Les effets de matrice lors de l extraction Exemple du chocolat (tanins) Effet thermique sur l allergénicité: solubilité modifiée des protéines dénaturées par la chaleur Dégradation thermique peut varier fortement entre les protéines d un même aliment allergène choix de l AC Différence de reconnaissance/d affinité entre AC et protéines de différentes espèces végétales ou provenances géographiques 46
ELISA - Conclusion Actuellement méthode de choix pour le contrôle en routine des denrées alimentaires Disponible pour la plupart des allergènes majeurs Quantitatif possible. Difficile si l on ne dispose pas de l ingrédient contaminant. Travail de normalisation et de validation 47
La PCR de noisettes PCR du gène mitochondrial nad 1 Pourrait servir de méthode de screening ou de confirmation Complément aux méthodes basées sur les protéines 48
Et la quantification? La real-time PCR est-elle applicable? Problèmes: Quantification relative (type OGM) pas possible par l absence de gène de référence Quantification absolue? Complexité de la matrice STD préparés dans la matrice à analyser 49
Les allergènes:besoins et perspectives Besoin de normalisation et d uniformisation Que faut-il détecter et comment exprimer le résultat. Besoin d une valeur limite protégeant les personnes allergiques et applicable en industrie Ingrédient ou protéine allergène? Techniques de screening multi-allergènes 50
Conclusion Analyse de protéines et ADN apportent une très grande sélectivité La quantification reste souvent délicate Grand potentiel, prendra probablement une place croissante dans les labos d analyse. 51