La PCR en temps réel frederic.gevaudant@bordeaux.inra.fr

La PCR en temps réel frederic.gevaudant@bordeaux.inra.fr INRA Centre de recherche de Bordeaux UMR Biologie du Fruit et Pathologie

Historique 1985 : Invention par Kary Mullis de la technique de (PCR). 1991 : première utilisation de sonde (sonde d hydrolyse) en PCR publiée par Holland PM et collaborateurs. 1992 : première détection du produit de PCR en temps réel à l aide d un marquage au BET publiée par Higuchi R. et collaborateurs.

Principe de la PCR conventionnelle Amorces, ADN, dntps, Taq Pol Dénaturation du double brin d ADN et hybridation des amorces 95 C 72 C 72 C Elongation x 35 cycles 55 C Séparation électrophorétique

PCR en temps réel ou en point final?

Tableau comparatif

Coût de la RT-qPCR Une extraction d ARN revient à 1,5 au minimum/échantillon (en fonction des types d extraction, solutions ou Kit). Un traitement DNase c est 0,38 /échantillon(dnase Promega) ou 2,5 /échantillon (DNAse Turbo). Une RT c est 3 /échantillon et je ne compte pas l inhibiteur de Rnase. Une plaque de Q-PCR (3,1 la plaque + 1,1 le film) puis le mix PCR (0,275 *96 puits = 26,4 ), sans compter les primers.soit 30,5 euros la plaque remplie. Bilan: Une RT sur un échantillon c est de 5 à 7, une RT-qPCR c est 35 pour une plaque (une RT fournissant des ADNc pour une plaque). Sachant qu une machine simple de PCR temps réel : CFX connect real-time PCR detection system c est 20 000 euros).

Principe de la PCR en temps réel Marquage du produit au cours de sa synthèse Chimies de marquage en temps réel Matériel de détection Intensité de fluorescence proportionnelle quantité de produit formé Phase plateau Fluorescence Phase linéaire Phase exponentielle Temps (nombre de cycles)

Principe de la PCR en temps réel PCR en temps réel, «Quantitative PCR», «Real time PCR», «Kinetic PCR», «Real time RT PCR» (sur ADNc), «FRET PCR» (Förster resonance energy transfer ) Formation du produit PCR suivie au cours du temps via l émission de fluorescence in situ (nombreuses approches possibles). Détermination du nombre de cycle à partir duquel le produit PCR est détectable : nombre de cycle seuil = «Cycle threshold» (ou «crossing point» = Cp. Moment d apparition du signal seuil (=Ct) dépendant de la quantité de matrice initialement présente dans l échantillon amplifié. Linéarité sur 5 à 7 ordres de magnitude. quantification de la matrice de départ et/ou calcul de ratios entre deux conditions Référence : The MIQE Guidelines. 2009. Clinical Chemistry 55 611-622

Chimies de détection On distingue plusieurs approches de Q-PCR selon les mécanismes conduisant à l augmentation de la fluorescence au cours de l amplification :

Chimies de détection Lecture de la fluorescence : - Après l élongation : SYBR Green, technique Taqman - A l étape d hybridation : Molecular Beacons, LightCycler hybridization probes

SYBR Green I: chimie non spécifique, liaison à l ADN double brin

Sondes d hydrolyse (Taqman)

Principe de la méthode TaqMan Cette sonde contient un colorant fluorescent ``Reporter et un colorant (extincteur) ``Quencher. A l extrémité 5, le colorant de fluorescence 6-FAM : 6-carboxyfluorescein, émission λmax = 518 nm A l extrémité 3, le colorant extincteur TAMRA : 6-carboxytetramethylrhodamine, émission λmax = 582 nm L'extincteur peut seulement éteindre la signal de fluorescence quand les deux colorants sont près l'un de l'autre.

Absorbtion Absorbtion Le mécanisme de quenching Excitation FAM Fluorescence Le spectre d émission du Rapporteur recouvre le spectre d absorption de l extincteur 475 550 nm TAMRA FRET Émission Fluorescence FRET 550 600 nm

Sondes d hybridation (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

Sondes d hybridation (Balises moléculaires) "Molecular Beacons"

Sondes d hybridation (Scorpions) "Scorpions"

TaqMan versus SYBR Green TaqMan SYBR Green Spécificité -fixation des amorces, -hybridation de la sonde, -conditions PCR -fixation des amorces, - -conditions PCR Flexibilité -multiplexe, -détection de SNP, - - - -utilisation d amorces dégénérées Optimisation -standardisée -dépend du gène ciblé -vérifier la formation de dimère d amorces

TaqMan versus SYBR Green Nature des fluorochromes reporters : - FAM : bleu Meilleur quenching - VIC : vert - NED : noir - PET : rouge Avantages de la Q-PCR avec sondes : - très spécifique (car cette PCR nécessite l utilisation de deux amorces et d une ou plusieurs sondes spécifiques) - possibilité de faire des multiplexes i.e. plusieurs PCR dans le même tube : détection de fluorochromes différents indicateurs de PCR différentes dans le même tube quantification relative directe, meilleure normalisation. Limites : coût des sondes (surtout si nombreux gènes à différents à quantifier)

TaqMan versus SYBR Green Limite de la technique SYBER-green : risque de détection des dimères d oligonucléotides ou d un produit PCR non spécifique contrôle lors de la mise au point par dépôt sur gel de la présence d une seule bande contrôle à chaque réaction de la présence d un seul produit PCR par évaluation du Tm du produit PCR à l aide de la courbe de fusion (contrôle qu il n y a bien qu un seul produit, avec le bon Tm)

La courbe de fusion Réalisée après la PCR en temps réel sur le produit PCR final. F df/dt Dérivée 55 C 95 C 55 C 95 C T C T C Tm Tm Détection de la variation de fluorescence en fonction de la température (montée en température de 65 C à 85 C à 0,1 C/sec lecture en continue de la fluorescence).

Applications de la PCR en temps réel Utilisée pour quantifier de : - l ADN génomique : par exemple, détection/quantification de microorganismes dans un tissu - ou des ADNc produits à partir des ARNm Aussi utilisée pour mettre en évidence de mutations ponctuelles (homo/hétérozygotie, résistance aux antibiotiques dans des gènes) à l aide de sondes taqman très spécifiques ou l interprétation des courbes de fusion, par exemple.

Comparaison de 3 techniques de quantification des ARNm Microarrays Dot-blot PCR-Q Réverse transcription + - + Hybridation + + - Amplification - - + Quantité ARN totaux 10µg (1-25) 5 µg par gène 200ng/réaction

Stratégie - Application Utilisation des sondes d hybridation

Stratégie - Application Exemples de résultats 1

2 Stratégie - Application

Les différents appareils de PCR temps réel

Le CFX de BioRad Plaque des échantillons de 96 ou 384 puits

Description d un appareil L appareil est doté d un détecteur sensible qui surveille la florescence dans chaque puits de la plaque à chaque cycle d amplification. ancien Optical Detection System nouveau

Les sources de variabilité expérimentales

Choix du standard en fonction de la problématique

La PCR un procédé d amplification Représentation de la quantité d ADN double brin à différents cycles d amplification Représentation graphique Échelle logarithmique

La PCR un procédé d amplification

Comment on va mesurer la concentration d ADN initial? On peut tracer les valeurs de Ct en fonction de la concentration d ADN. La courbe est une droite (R = 0,990).

Comment on va mesurer la concentration d ADN initial? On peut déduire la quantité d ADN qu on a amplifié par PCR d un échantillon en extrapolant sa valeur Ct sur cette droite. Pour une valeur Ct = 25 cycle on a log q = 4 donc q = 10000 copies d ADN.

L effet de l efficacité sur la PCR Voici une série de calcul du taux d ADN qui sera théoriquement amplifié à différentes efficacités. Une petite différence dans l efficacité de 10% induit une grande perte de 80% d ADN amplifié après 30 cycles.

Calcul de l efficacité de la PCR

Exemples

Comment on va mesurer la concentration d ADN initial?

Quantification relative o pas besoin de courbe de standard o calcul des résultats pas comparaisons des Ct o nécessité de définir : - un gène cible servant de contrôle endogène, - un gène cible servant de standard. le contrôle endogène : - donne une image de la quantité de matrice apportée (ADN ou ADNc), - est présent en quantité constante dans tous les échantillons, - normalise : - les biais d extraction et de contaminations par des inhibiteurs (ADN) - les variations d éfficacité de transcription inverse

Quantification relative

Traitement des résultats Technique des 2-Δ (ΔCt) -[(Ctgène1-Ctref1) (Ctgène2-Ctref2)] R = N 1 /N 2 = 2 où N 1 est la quantité normalisée d ADNc du gène d intérêt dans la condition 1 N 2 est la quantité normalisée d ADNc du gène d intérêt dans la condition 2 Ct gène1 est le Ct obtenu lors de l amplification du gène d intérêt dans la condition 1 Ct gène2 est le Ct obtenu lors de l amplification du gène d intérêt dans la condition 2 Ct ref1 est le Ct obtenu lors de l amplification du gène de référence dans la condition 1 Ct ref2 est le Ct obtenu lors de l amplification du gène de référence dans la condition 2

Démonstration de la formule Posons N = No x 2 n où N est la quantité d amplicons au seuil, No la quantité de matrice cible initiale et 2 l efficacité de la PCR d un gène donné. Pour le gène d intérêt : N seuilgène = N gène1 x 2 Ctgène1 = N gène2 x 2 Ctgène2 (équation 1) où N seuilgène est la quantité d amplicons au seuil de la Q-PCR du gène d intérêt, N gène1 la quantité initiale d ADNc du gène d intérêt dans l échantillon de la condition 1 et N gène2 la quantité initiale d ADNc du gène d intérêt dans l échantillon de la condition 2. De même pour le gène de référence : N seuilref = N ref1 x 2 Ctref1 = N ref2 x 2 Ctref2 (équation 2) R = N 1 /N 2 = (N gène1 /N ref1 )/(N gène2 /N ref2 ) = (N gène1 x N ref2 )/(N ref1 x N gène2 ) D où R = (N gène1 /N gène2 ) x (N ref2 /N ref1 ) L équation 1 nous donne : N gène1 /N gène2 = 2 Ctgène2 / 2 Ctgène1 = 2 L équation 2 nous donne : N ref2 /N ref1 = 2 Ctref1 / 2 Ctref2 = 2 (Ctref1 Ctref2) D où R = 2 (Ctgène2 Ctgène1) x 2 (Ctref1 Ctref2) = 2 (Ctgène2 Ctgène1 + Ctref1 Ctref2) R = N 1 /N 2 = 2 [(Ctgène2 Ctref2) (Ctgène1 - Ctref1)] = 2 (Ctgène2 Ctgène1) [(Ctgène1 Ctref1) (Ctgène2 Ctref2)]

IIlustration de la formule

Il est à noter que la formule du 2 -DDCt suppose que l efficacité des PCR du gène d intérêt et du gène de référence ont une efficacité de 2. Cette hypothèse n est pas toujours vérifiée et peut entraîner une source d erreur importante. Il convient en pratique de calculer l efficacité des PCR puis d utiliser une formule similaire à celle du 2 - DDCt mais tenant compte des efficacités réelles des PCR qui est la suivante : R = N 1 /N 2 = E (Ctgène2 Ctgène1) / F (Ctref2 Ctref1) où E est l efficacité de la PCR du gène d intérêt et F l efficacité de la PCR du gène de référence (les autres termes ayant été définies au préalable pour la formule du 2 -DDCt ) Références dans M. Pfaffl, Nucleic Acids Research (2001) 29 (9) : 2002-7

Quantification relative d ADNc : exemple de démarche 1. Choix des amorces Tm de 60 C, taille 50-150 pb (pour que l élongation ne soit pas une étape limitante), GC% 30-60%, localisation proche des amorces ayant servis à la rétrotranscription (RT) Utilisation à 300-900 nm 2. Mise au point sur ADNg - Analyse de la spécificité des amorces : - analyse sur gel - analyse de la courbe de fusion - Calcul de l efficacité de la PCR (et vérification de la linéarité : 3,3 Ct de différence quand 10 fois moins de matrice) 3. Quantification relative sur ADNc - Q-PCR d un ou plusieurs gènes de référence - Q-PCR du gène d intérêt - Exploitation des résultats

La normalisation

Le choix des séquences de normalisation

Le choix des séquences de normalisation

Avantages de la PCR en temps réel sur la PCR classique

Bilan de la PCR en temps réel

Des exigences Bilan de la PCR en temps réel

Domaines d application de la PCR en temps réel Détecter / Quantifier

Détecter / Identifier Champs d application