Coloration de Perls 1. Technique et interprétation générale Met en évidence les complexes insolubles contenant du fer: hémosidérine, granules de Pappenheimer, mitochondries surchargées en fer. La ferritine et l hémoglobine ne sont pas révélés par cette méthode La technique : voir en fin de chapitre 2. Résultats et interprétation Le fer insoluble apparaît en bleu-vert (ferrocyanure ferrique). Faible grossissement (X10) : pour apprécier le fer des «réserves», dans les macrophages (grumeaux de moelle, régions bien étalées des frottis) Fort grossissement (X63 ou X100) : pour apprécier le fer dans les érythroblastes (et dans les hématies éventuellement) Fer des réserves ou fer macrophagique Une semi quantification est possible avec un peu d expérience, mais en pratique il faut savoir avant tout séparer : - fer des réserves absent ou à l état de traces - fer des réserves en quantité normale ou augmentée Quelques exemples : Grumeaux de moelle sur frottis coloré au MGG (en bas) et Perls (en haut) Grumeau de moelle au faible X : absence de fer ( = pas de coloration verte) MAJ : juin 2005 Page 1 sur 8
Grumeau de moelle au grossissement intermédiaire : absence de fer (= pas de coloration verte) Grumeau de moelle au grossissement moyen : fer en quantité normale Grumeau de moelle au faible grossissement: fer en quantité normale Grumeau de moelle au grossissement intermédiaire : fer en quantité augmentée Grumeau de moelle au grossissement moyen : fer en quantité augmentée Grumeau de moelle au grossissement moyen : fer en quantité augmentée ; la coloration verte dessine plus ou moins les histiocytes MAJ : juin 2005 Page 2 sur 8
Grumeau de moelle au grossissement moyen : fer en quantité très augmentée Grumeau de moelle au grossissement moyen : fer en quantité très augmentée ; les histiocytes sont très riches en fer Même image au plus fort grossissement : les histiocytes sont très surchargés en fer (coloration verte intense qui remplit la totalité du cytoplasme) (voir également en fin de document : «quelques images complémentaires» Remarque: il faut impérativement voir les macrophages (fort grossissement) ou les deviner au sein des grumeaux de moelle, et dans les situations de doute (= frottis partiellement dilués) on signalera que «l appréciation de la richesse en fer macrophagique est impossible» Fer des érythroblastes Sidéroblaste = érythroblaste dont le cytoplasme contient un ou plusieurs grains bleu-vert ou «en anneau» (ring cell pour les anglo-saxons) = présence de granules de fer collées autour du noyau et sur au moins 1/3 du pourtour Pour le décompte : on regarde chaque érythroblaste (un peu plus difficile de repérer les érythroblastes immatures que les matures), et on compte le nombre de grains bleu-vert ; on dénombre 100 érythroblastes comme suit : Valeurs normales Erythroblastes sans grain 60 90 % Erythroblastes (sidéroblastes) avec 1-3 grains* (sidéroblaste type I) 10 40 % Erythroblastes (sidéroblastes) avec > 3 grains* (sidéroblaste type II) 0 Erythroblastes (sidéroblastes) en couronne 0 MAJ : juin 2005 Page 3 sur 8
* Pour certains auteurs le seuil est de 5 grains et non de trois (l interprétation générale est par ailleurs identique), et le % d érythroblastes avec 1-3 grains et de 10-30% ou de 10-50% On mentionne la présence de sidérocytes quand on les observe. Coloration de Perls :quelques exemples d érythroblastes et de sidéroblastes Erythroblaste sans granule de fer Erythroblaste sans granule de fer Erythroblaste sans granule de fer 2 érythroblastes sans granule de fer 3 érythroblastes sans granule de fer Erythroblaste avec 1 granule de fer (sidéroblaste type I) Erythroblaste avec 1 granule de fer (sidéroblaste type I) Erythroblaste avec 2 granules de fer (sidéroblaste type I) Erythroblaste avec plus de 3 granules de fer (sidéroblaste type II) Erythroblaste avec plus de 3 granules de fer (sidéroblaste type II) Erythroblaste avec plus de 3 granules de fer (sidéroblaste type II) Erythroblaste avec nombreux granules de fer qui s organisent +/- près du noyau (sidéroblaste type II) Erythroblaste avec nombreux granules de fer qui s organisent +/- près du noyau (sidéroblaste type II) Erythroblaste avec nombreux granules de fer qui s organisent +/- près du noyau (sidéroblaste type II presque en couronne) MAJ : juin 2005 Page 4 sur 8
Sidérocyte (hématie contenant des grains de fer) Sidérocyte (hématie contenant des grains de fer) Interprétation générale des résultats Problèmes de lecture: - Les précipités de colorant ne doivent pas être interprétés comme du fer macrophagique (formes polyédriques et non arrondies) - Les érythroblastes sans grains sont plus difficiles à repérer, surtout les plus immatures - Les lymphocytes ne doivent pas être confondus avec les érythroblastes matures - Le sidéroblaste en «n est pas toujours aisé à définir, surtout qu il y a souvent association à un excès de sidéroblastes à plus de 3 grains. - A l état normal, le nombre de sidérocytes est très faible dans la moelle et ils sont absents du sang. Anémies inflammatoires (anémies des maladies chroniques ; voir document correspondant) et tous les états inflammatoires chroniques: fer macrophagique normal ou augmenté, et peu ou pas de sidéroblastes (souvent 0%) Anémie par carence martiale: absence de fer dans les macrophages et dans les érythroblastes Anémies sidéroblastiques primitives ou secondaires (voir les documents se rapportant aux syndromes myélodysplasiques et aux anémies sidéroblstiques): présence d un nombre variable de sidéroblastes en couronne (au moins 15% pour évoquer une Anémie Réfractaire Sidéroblastique Idiopathique ou ARSI) Anémies en pathologie générale: toutes les dysérythropoïèses (sauf la carence martiale) peuvent s accompagner d une petite augmentation du nombre de sidéroblastes avec > 3 grains, sans apparition de couronnes De nombreux médicaments entraînent une dysérythropoïèse (pas uniquement les chimiothérapies) avec excès de sidéroblastes > 3 grains Le fer macrophagique est augmenté dans les thalassémies, toutes les grandes dysérythropoïèses, les syndromes myélodysplasiques (en général en parallèle de la ferritinémie) MAJ : juin 2005 Page 5 sur 8
Quelques images complémentaires : Histiocyte de la moelle d un patient en rémission d une LAM (MGG) Même patient que précédemment (MGG) Coloration de Perls montrant une surcharge en fer majeure (même patient que précédemment) Coloration de Perls montrant une surcharge en fer majeure (même patient que précédemment) Ilot érythroblastique (MGG) Ilot érythroblastique (Perls ; même patient) MAJ : juin 2005 Page 6 sur 8
Lors de l aspiration puis de l étalement de la moelle, les îlots érythroblastiques sont souvent rompus, mais des fragments d histiocytes peuvent rester adhérents aux érythroblastes (MGG) Des fragments d histiocytes peuvent rester adhérents aux érythroblastes (MGG), après rupture des îlots érythroblastiques Dans les grands états inflammatoires ou les surcharges en fer, la coloration de Perls visualise ces fragments cytoplasmiques Ces fragments cytoplasmiques ne doivent pas être confondus avec du fer intra érythroblastique Histiocyte au cours d une ARSI (MGG) Histiocyte après coloration de Perls (même patient que précédemment) : surcharge ferrique nette MAJ : juin 2005 Page 7 sur 8
Histiocyte au cours d une ARSI : MGG Histiocyte surchargé en fer (même patiente que l image précédente) Histiocyte «inflammatoire» au cours d un myélome multiple (MGG) Après coloration de Perls la surcharge en fer est manifeste (même patient que précédemment) 3. Aspects techniques - Frottis de sang ou de moelle séchés à l air [des étalements vieux de plusieurs années conservés à température ordinaire (ou congelés) sont utilisables. On peut également «laver» des frottis de moelle colorés au MGG (placer les lames dans une fiole remplie d eau du robinet, et laisser couler un fin filet d eau le temps de la décoloration complète, soit une à 24 heures: les lames sont utilisables telles que, car déjà fixées par le méthanol du MGG) - Fixer 10 minutes avec du méthanol absolu, puis sécher à l air sans rincer. - Recouvrir les lames ou les immerger dans un mélange préparé extemporanément: HCl 1N = 10ml, eau distillée = 40 ml, solution de ferrocyanure de potassium à 2% = 50 ml. Incuber le flacon avec couvercle posé, non fermé, 20 minutes à 37 C - Rincer à l eau courante puis sécher à l air - On peut contre-colorer les noyaux avec de l éosine diluée ou de l hématoxyline (quelques minutes maximum), ou 20 minutes avec une solution de nuclear fast red (sulfate d alumine = 5g, eau distillée = 100 ml ; après dissolution ajouter 0.2 g de nuclear fast red) Rincer à l eau distillée et sécher à l air. La coloration résiste à l huile à immersion et aux solvants des résines de montage NB: toujours mettre dans le bain de coloration une lame témoin «positive» (M Zandecki, juin 2005) MAJ : juin 2005 Page 8 sur 8