Université Joseph Fourier Département Licence Sciences & Technologie RAPPORT DE STAGE «Analyses de molécules de natures variées par spectrométrie de masse» LECOCQ Chloé Laboratoire d accueil : ICMG Directeur du laboratoire : COTTAZ Sylvain Responsable du stage : FORT Laure Licence Physique-Chimie, 1 ère année Année 2014-2015 1
Sommaire Remerciements :... 3 I. Introduction :... 4 1. Situation du laboratoire... 4 2. Contenu du stage... 4 II. Principe de la spectrométrie de masse... 5 A. Généralités... 5 B. Qu est-ce qu un spectre de masse?... 5 1. Les ions que l on retrouve dans un spectre... 6 2. Massifs isotopiques... 7 3. Reconnaître un multichargé grâce aux massifs isotopiques... 8 III. Les sources d ionisation... 8 A. Source à impact électronique (EI)... 8 B. Ionisation chimique (CI)... 9 C. L électrospray (ESI)... 10 D. La désorption laser (MALDI)... 10 IV. Les analyseurs... 11 A. Analyseur à temps de vol (TOF)... 11 B. Ion trap... 13 V. Couplage chromatographie/spectrométrie de masse... 13 A. Qu est-ce que la HPLC/MS?... 13 B. Lien entre chromatogramme et spectre de masse... 14 VI. Quelques analyses réalisées... 14 A. Analyses par électrospray... 15 1. Analyse d un peptide... 15 2. Analyse d une molécule avec contre-ion... 16 3. Analyse d un complexe métallique... 17 B. Analyse par MALDI... 18 C. Analyses d extraits de champignon par HPLC/MS... 18 1. Détermination des conditions optimales... 19 2. Résultats des analyses... 22 VII. Conclusion... 23 Annexes :... 24 Sources :... 25 2
Remerciements : Je souhaite tout d abord remercier William MONETTA, professeur de chimie organique et inorganique au DLST car sans lui, je pense que je n aurai jamais pût trouver ce stage. Je remercie énormément Laure FORT pour avoir accepté de me prendre en tant que stagiaire et de m avoir aidée durant ce mois. J ai beaucoup appris à ses côtés et je la remercie aussi d avoir pris le temps de regarder ce rapport et de m aider à le finaliser. Je remercie aussi Rodolphe GUERET d avoir répondu à mes nombreuses questions et de m avoir fait confiance pour me laisser faire des analyses. Je remercie enfin Patricia CAJOT pour s être occupée de la partie administrative de ce stage, ainsi que l Université Joseph Fourier de m avoir donné la possibilité de faire ce stage via le dispositif de stage d excellence. 3
I. Introduction : Cette année, j ai eu l opportunité de faire un stage via le dispositif de stage d excellence de l Université Joseph Fourier. La recherche d un stage dans un domaine qui m intéresse (en l occurrence la chimie) n a pas été facile. Mais grâce à mon professeur William MONETTA, j ai pu être mise en contact avec Laure FORT qui travaille au plateau de spectrométrie de masse de l ICMG (Institut de Chimie Moléculaire de Grenoble). 1. Situation du laboratoire Durant un mois, j ai fait mon stage au plateau de spectrométrie de masse (PSM) qui est hébergé dans le bâtiment de Nanobio, situé rue de la Chimie sur le campus de Saint Martin d Hères. Cette plateforme est mise à disposition des départements qui composent l ICMG : le DCM (Département de Chimie Moléculaire), DPM (Département de Pharmacochimie Moléculaire) et le CERMAV (Centre de Recherche sur les Macromolécules Végétales). Le PSM reçoit des demandes d analyses de la part de différents chercheurs venant de plusieurs laboratoires, mais aussi d entreprises privées. A l aide de plusieurs spectromètres, les membres du PSM analysent par spectrométrie de masse les échantillons reçus. 2. Contenu du stage Mon stage a consisté à faire différentes analyses en utilisant des techniques différentes, que j expliquerai dans ce rapport. J ai aussi fait des dilutions des produits que nous amènent les chercheurs afin qu ils puissent être analysés. Mais avant de manipuler, j ai dû faire des recherches sur la spectrométrie de masse car je n avais jamais étudié cette méthode d analyse lors de mes études. Il a fallu que j apprenne les bases, que je comprenne le fonctionnement des spectromètres et les spectres obtenus. De nombreuses recherches documentaires ont donc été nécessaires afin d avoir des connaissances sur le sujet. 4
II. Principe de la spectrométrie de masse A. Généralités La spectrométrie de masse est une méthode d analyse très courante utilisée dans de nombreux domaines : physique atomique, cinétique des réactions, géochronologie, analyses chimique quantitatives et qualitatives comme la biomédecine Elle repose sur le libre déplacement d ions en phase gazeuse. Ainsi les espèces moléculaires ne sont pas gardées en tant que telles, mais sont ionisées. Les ions peuvent ensuite se déplacer grâce à une différence de potentiel, un champ électrique ou bien un champ magnétique. L objet à analyser correspond donc à un flux gazeux ionique généré par la molécule introduite dans le spectromètre. Les ions sont ensuite séparés et détectés selon leur rapport masse/charge pour pouvoir identifier et parfois même quantifier le produit à analyser. Un spectromètre est composé de différents éléments : - Une source qui permet de produire des ions à partir de l échantillon à analyser - Un analyseur qui sépare les ions en fonction du rapport entre leur masse et le nombre de charges, noté m/z qui s exprime en «Thompson» (Th). La masse m s exprime en Dalton (Da) où 1 Da = 1,66. 10-27 kg. - Un détecteur qui mesure la quantité ou l intensité du signal des différentes valeurs de m/z qui leur correspond. Il existe plusieurs sources adaptées pour certaines molécules, que ce soit en fonction de leur taille, stabilité Certaines sont plus douces que d autres. J en décrirai certaines que le laboratoire utilise par la suite. Il y a aussi différents types d analyseurs. Une fois les ions détectés, un spectre de masse est obtenu. B. Qu est-ce qu un spectre de masse? Un spectre de masse est un diagramme qui représente l intensité des différents ions par un signal en fonction de leur rapport masse/charge. En abscisse les valeurs de m/z et en ordonnée l intensité relative du signal. Le pic de plus forte intensité (aussi appelé «pic de base»), a une intensité de 100%. Les autres pics ont une intensité relative par rapport à celui-ci. L intensité d un pic est proportionnelle à la quantité de l ion correspondant. 5
1. Les ions que l on retrouve dans un spectre Dans un spectre de masse, on peut retrouver plusieurs pics significatifs : - Le pic de base qui correspond au pic le plus intense, et donc l ion le plus présent. - Le pic moléculaire qui correspond à l ion moléculaire de la molécule, de la forme d un radical-cation car un électron a été arraché à la molécule initiale. Le pic moléculaire ne correspond pas toujours au pic de base car il se fragmente facilement. Il est caractéristique d une ionisation par impact électronique. - Ou les ions pseudo-moléculaire qui sont de la forme (M+H) + (où M est la molécule étudiée de masse m et H un proton) ou (M-H) - suivant le mode d ionisation. Les pics correspondants sont donc à la masse m+1 dans le cas positif et m-1 pour le négatif. - Il est également possible de trouver des ions adduits correspondant à l ajout d un cation comme le sodium (M+Na) + ou d un anion comme le chlore (M+Cl - ). Parfois, seul l ion adduit est visible et le pseudo-moléculaire ne l est pas. - Les ions pseudo-moléculaires multichargés de la forme (M+zH) z+. La molécule a gagné z protons et aura une charge z+. Le pic correspondant à cet ion sera à la masse (m+z)/z. De la même façon en mode négatif, le pic apparaîtra à (m-z)/z. Ces ions sont visibles en source électrospray surtout et si la molécule peut facilement se multichargé ou non. Voici ci-dessous un exemple de spectre de masse de l Hexane (source EI): Dans ce spectre, on retrouve le pic moléculaire à 86 soit la masse de l Hexane. On remarque que ce n est pas le pic le plus intense car le pic de base est à 57. Tous ces autres pics correspondent à des fragments de la molécule. Un autre exemple de spectre du lysozyme λ (source ESI) : Les pics que l on observe correspondent à des multichargés. Par exemple, prenons le pic de base à 1049.8 (17 charges +, soit (M+17H) 17+ ). Pour retrouver la masse de la molécule on fait : 1049.8*17-17=17829.6 6
On peut utiliser d autres pics de la même façon comme par exemple le 1486.6 : en adaptant la formule précédente on retrouve aussi la bonne masse. 2. Massifs isotopiques Dans la nature, un élément peut avoir des isotopes (même nombre de protons mais pas de neutrons). On appelle abondance isotopique la répartition dans la nature de ces isotopes. La spectrométrie de masse prend en compte ces isotopes. En effet dans une solution d un élément, prenons par exemple une solution de chlore qui peut exister sous deux formes 35 Cl et 37 Cl, on a une certaine probabilité d avoir du chlore 35 ou du chlore 37. Si l on regarde le spectre de masse du chlore, on observe deux pics l un correspondant au chlore 35 et l autre au chlore 37 (voir ci-contre). Ces deux pics sont espacés de deux unités car on approxime la masse d un neutron par 1 et il y a deux neutrons de différences entre ces isotopes. D après l abondance isotopique du chlore, il y a 75.8% de 35 Cl et 24.2% de 37 Cl. En ramenant ces proportions en abondance relative, cela fait 100% de 35 Cl et 32.5% de 37 Cl, car je rappelle que le pic le plus intense (et donc l ion en plus grande quantité) est fixé à 100% en spectrométrie de masse. Ainsi, le pic correspondant au 37 Cl a une intensité qui correspond à environ 1/3 du pic du 35 Cl. Cela donne donc un profil particulier au chlore que l on peut identifier dans des molécules plus complexes. Voici un autre exemple avec du brome : Le brome est présent sous deux formes : 79 Br et 81 Br qui ont des abondances relatives très proches, l un est à 100% et l autre à 98% car dans la nature ils existent quasiment dans les même proportions. Dans le spectre de masse du bromobenzène ci-contre, on remarque deux pics à 156 et 158 qui ont des intensités très proches. Cela est dû à la présence de Brome dans la molécule qui donne ce profil particulier. En connaissant les massifs isotopiques des éléments, on peut facilement les identifier dans la molécule à analyser. On peut aussi savoir s ils ont été perdus suite à l ionisation si on savait que l échantillon en contenait. Les abondances isotopiques des principaux éléments que l on retrouve en spectrométrie de masse sont mises en annexes. 7
3. Reconnaître un multichargé grâce aux massifs isotopiques Quand on a un pic qui apparaît à l écran, il faut avoir une idée de quoi il s agit. Pour reconnaître un multichargé, il faut faire un zoom sur le pic et identifier le massif isotopique. Le plus souvent, les isotopes ont un neutron de différence entre eux (exemple l oxygène : 16,17 et 18). Alors dans leur massif isotopique, chaque pic est séparé d une unité, soit la masse d un neutron. Mais dans le cas de multichargé, cet écart sera diminué : il sera divisé par la charge de l ion auquel il correspond : - Pour un di-chargé (2+ ou 2-), l écart entre les pics sera de ½, soit 0.5 - Un tri-chargé aura ses pics de son massif écartés de 1/3 soit environ 0.3 - Et ainsi de suite Lorsque les pics du massif isotopique seront séparés de très peu car la charge du multichargé est grande, un seul pic large apparaît car la résolution n est pas assez élevée pour séparer les pics. III. Les sources d ionisation A. Source à impact électronique (EI) Le principe de l ionisation des molécules par une source à impact électronique (dite EI) est relativement simple à comprendre. anode Schéma du fonctionnement d une source EI Un filament chauffé à haute température (2000 C) par passage d un courant produit des électrons d énergie de 70eV (énergie qui permet un meilleur rendement). Ils sont dirigés vers une anode par une différence de potentiel. Ils vont rentrer en collision avec les molécules de l échantillon et former des ions suite à la réaction suivante : M + e M.+ + 2e M.+ correspond à l ion moléculaire et qui est aussi un radical cation. Celui-ci va se fragmenter pour former d autres ions. On obtient alors un spectre comme l exemple ci-dessous, qu on analyse grâce à une banque de données : 8
Spectre de masse d un ester obtenu par ionisation électronique (source EI) La masse de l ion moléculaire est de 136. La perte de OCH 3 de masse 31 fait apparaître un pic à 105. De la même manière, la perte de CO laisse alors le pic à 77 qui est caractéristique d un cycle benzénique. Vous pouvez alors voir grâce à cet exemple que cette source permet d avoir des informations sur la structure de la molécule en la fragmentant. Néanmoins il ne faut pas utiliser cette source pour des molécules trop fragiles car elles risquent de trop se fragmenter et le spectre contiendrait trop de pics ce qui est inexploitable. Elle est utilisée pour des molécules stables, nécessitant beaucoup d énergie pour se fragmenter. De plus, la plupart du temps l ion moléculaire n est plus visible et il est alors difficile de déterminer la masse de la molécule analysée. B. Ionisation chimique (CI) Nous avons vu qu avec la source à impact électronique l ion moléculaire a tendance à se fragmenter. La source par ionisation chimique évite ce problème : le spectre qu elle fournit permet de plus facilement reconnaître l ion moléculaire. Le principe de cette source est similaire à l EI mais au lieu d avoir des collisions molécule/électron, les ions sont produits par une collision molécule/ions primaires qui sont déjà présents dans la source. Ces ions primaires sont produits à partir d un gaz réactif par impact électronique puis par collision avec d autres molécules de ce même gaz (exemple avec le méthane) : CH 4 + e CH 4.+ + 2e CH 4.+ + CH 4 CH 5 + + CH 3. L ion produit va alors entrer en collision avec les molécules de l échantillon et s ensuit un transfert de proton dans une réaction de type acide base : M + CH 5 + MH + + CH 4 9
Le choix du gaz réactif dépend de l affinité protonique (AP) des molécules. Pour que le transfert du proton ai lieu, il faut que AP gaz <AP M (cf annexes). C. L électrospray (ESI) Schéma expliquant le principe d une source ESI Voici ci-contre le schéma d une interface ESI. L électrospray est produit par application d un fort champ électrique sur un liquide traversant un tube capillaire à un faible débit (de l ordre de 1-10 µl/min). Ce champ provoque une accumulation de charges à la surface du liquide, située à l extrémité du capillaire, qui va se rompre pour former des gouttelettes et donner ainsi un «spray». Ces gouttelettes vont rencontrer un flux d azote chaud qui va permettre l évaporation du solvant et ainsi diminuer leur taille. Cela entraîne aussi une augmentation de la densité des charges et ainsi la répulsion coulombienne excède les forces de cohésion des gouttelettes qui vont exploser et en former des plus petites. Après plusieurs fissions, le champ électrique local est si intense qu il y a désorption des ions. Ces ions peuvent être porteurs de plusieurs charges. L un des problèmes majeur en spectrométrie de masse est la limite des masses mesurées. En effet, il est très difficile de mesurer de très grosses masses, à partir de 20kDa, en ayant une bonne résolution. L avantage de la source électrospray est qu elle produit des ions multichargés et la spectrométrie de masse mesure le rapport m/z. Ainsi, une molécule à 50 000 Da qui a un ion chargé 50 fois en positif apparaîtra à la masse 1001 ((50000+50)/50). Cela marche en théorie mais en pratique il est difficile d excéder plus de 20 charges D. La désorption laser (MALDI) La source MALDI (Matrix Assisted Laser Desoption Ionisation) consiste à mélanger la substance à analyser avec une matrice, une solution de petites molécules organiques, qui possède une forte absorption à la longueur d onde du laser. Cette matrice a pour particularité de pouvoir donner un proton à l échantillon afin de faciliter son ionisation, car tout comme en CI, l affinité protonique de la matrice doit être inférieure à celle du produit. Cette source se combine très bien avec un analyseur à temps de vol (TOF pour Time Of Fly). Fonctionnement d une source MALDI 10
On dépose sur une plaque métallique le mélange matrice-analyte. Il y a deux méthodes pour faire le dépôt : la goutte sèche qui consiste à mélanger analyte et matrice et on fait le dépôt sous la forme d une goutte que l on dépose puis que l on sèche, soit en couche mince dit «sandwich» (on dépose la matrice, puis l analyte et on remet de la matrice). Chaque technique a ses avantages ainsi que ses défauts mais je n en sais pas plus, le laboratoire utilise couramment les deux. L échantillon cristallise avec la matrice et forme ainsi un dépôt sec. On dépose aussi des calibrants (références), qui sont des mélanges de peptides et/ ou protéines, sur un endroit proche du dépôt de l échantillon. On connaît leur spectre et ainsi on peut attribuer une masse à chacun de ses pics caractéristiques ce qui permet de calibrer les spectres des échantillons. En effet, les plaques métalliques ne sont pas uniformes et pour le TOF, les ions ne parcourent pas tout à fait la même distance d un endroit à l autre de la plaque. Il faut bien choisir les calibrants en fonction des masses des échantillons attendues car certains calibrent une gamme de masse comprise entre 1000 et 4000 Da, parfois au-delà On insère la plaque dans le MALDI-TOF et on effectue des tirs de laser sur les échantillons. La matrice absorbe l énergie du laser et cela entraîne une désorption. La matrice chargée positivement se détache de la plaque dans un gaz avec les échantillons qui ont cristallisés avec elle. S ensuit alors un transfert de proton de la matrice vers l analyte (ionisation) pour donner les ions moléculaires. Cette technique a pour avantage de conserver l ion moléculaire et ainsi identifier l élément analysé rapidement. Mais des fragmentations peuvent avoir lieu. IV. Les analyseurs Comme les sources, les analyseurs sont très variés et ont chacun leurs avantages comme leurs inconvénients. Certains sont adaptés pour des molécules particulières tandis que d autres le seront pour d autres molécules. Voici deux types d analyseurs couramment utilisés par le plateau : A. Analyseur à temps de vol (TOF) Le concept de cet analyseur est simple à comprendre. Le TOF (Time of Fly) consiste à séparer les ions par leur rapport masse sur charge en fonction du temps qu ils ont mis à parcourir une certaine distance d. Il est très souvent associé à une source MALDI, d où le nom du spectromètre MALDI-TOF que le plateau de spectrométrie de masse utilise couramment. Le schéma ci-dessous représente un MALDI-TOF : 11
Schéma d un analyseur à temps de vol Après un temps appelé «délai d extraction» de quelques nanosecondes, les ions sont accélérés par une différence de potentiel et expulsés dans le TOF (Time Of Fly). Ils parcourent une distance d pour arriver au détecteur. On utilise alors les formules usuelles de l Energie cinétique: Ec = zeu = mv² 2 Où z est le nombre de charges, e la charge élémentaire de l électron, m la masse de l ion, U la différence de potentiel qui permet l accélération des ions. Les ions parcourent une distance d en un certain temps t : En utilisant ces deux équations, on trouve : t = d v t 2 = m ze (d2 2U ) Ainsi, la mesure du temps nous permet de déduire m/z car les termes entre parenthèses sont constants. Dans une machine MALDI-TOF, il peut également y avoir un réflecteur (ou miroir électrostatique). Au lieu que les ions atteignent le premier détecteur en ligne droite (mode linéaire), ils sont réfléchis (mode réflectron) vers un autre détecteur. Il y a plusieurs réflecteurs plus ou moins puissants qui peuvent repousser des ions de plus en plus rapides. 12
Ainsi, un ion rapide parcourra plus de distance qu un ion plus lent qui sera réfléchi plus tôt. Les ions ressortent du réflecteur au même moment car les ions les plus lents rattrapent les plus rapides, et sont détectés par un autre détecteur. L avantage de ce mode est qu il permet une meilleure résolution mais il n est pas adapté à de grosses molécules qui peuvent trop se fragmenter si le temps de vol augmente, et alors l ion moléculaire ne sera plus visible. B. Ion trap Le principe de la trappe à ions, ou plus communément appelé ion trap, est de capturer les ions produits par la source dans l analyseur, par application d un champ électrique dans la trappe qui entraîne une oscillation stable des ions à l intérieur. Une tension alternative est appliquée dans la trappe dont l amplitude augmente progressivement. L oscillation des ions est alors perturbée et en fonction de leur rapport m/z, ils sont expulsés de la trappe séparément vers le détecteur. Cet analyseur est utilisé avec une source ESI par le plateau. L avantage de cet analyseur est qu il permet de faire de la spectrométrie de masse en tandem (cf annexes) en sélectionnant un ion pour ensuite le fragmenter. V. Couplage chromatographie/spectrométrie de masse En spectrométrie de masse, il est courant d utiliser un couplage chromatographie/ spectrométrie de masse, où la chromatographie va séparer les différents éléments d un mélange avant qu ils ne soient analysés par un spectromètre. Lors de mon stage, j ai eu l occasion de faire de la HPLC/MS. A. Qu est-ce que la HPLC/MS? HPLC signifie High Performance Liquid Chromatography et MS Mass Spectrometry. Le but de la HPLC est de séparer les composants d un mélange, comme la chromatographie en couche mince que l on a déjà pratiqué au collège et au lycée. Un éluant, que l on appelle phase mobile, passe dans une colonne HPLC grâce à une pompe à haute pression. Dans cette colonne, se trouve aussi une phase dite stationnaire qui a pour objectif de retenir les molécules. L échantillon, dilué préalablement dans un solvant, est entraîné par l éluant dans la colonne et en fonction de l affinité qu elles ont avec la phase stationnaire, les molécules ne sortent pas en même temps de la colonne. Les molécules vont ensuite dans le spectromètre de masse. La source ESI est un choix judicieux car l échantillon peut être introduit sous forme liquide. Chaque élément qui a été séparé va être analysé par le spectromètre de masse et ainsi, on obtient un spectre de masse par élément détecté. 13
L avantage de ce couplage est qu il permet d obtenir des spectres plus propres, notamment lorsque les échantillons sont complexes. Par traitement des données il est possible de supprimer le bruit de fond et de mieux identifier les pics intéressants. B. Lien entre chromatogramme et spectre de masse La chromatographie nous donne un chromatogramme. Après une analyse en HPLC/MS, on obtient un chromatogramme et un spectre de masse. Sur un chromatogramme, on obtient des pics qui correspondent à la détection d un composé à un temps t. A chacun de ces pics, on attribue un spectre de masse qui correspond à celui du composé détecté. Pour visualiser mieux cela, voici un exemple lors d une analyse réalisée (présentée en VI. partie C.) (la fenêtre du haut correspond au chromatogramme en bleu, les deux du bas aux spectres de masse associés aux pics) : VI. Quelques analyses réalisées Dans cette partie, je vais vous présenter quelques analyses que j ai réalisées lors de mon stage. Nous devions retrouver une masse précise afin d identifier la molécule qui a été synthétisée et ainsi vérifier si elle est présente ou non. Les molécules à analyser sont principalement des peptides, des oligonucléotides, protéines et même des complexes métalliques. J ai utilisé principalement les spectromètres ESI-ion trap (Esquire 3000+, Bruker Daltonics) et MALDI- TOF (Autoflex Speed, Bruker Daltonics). 14
A. Analyses par électrospray Protocole : avant d introduire l échantillon dans le spectromètre, il faut le diluer. Pour cela on dilue d abord le produit à une concentration de l ordre de 10-3 dans un solvant préconisé par le demandeur de l analyse. On dilue à nouveau le produit à 1/100 pour obtenir une concentration à 10-5. Les solvants utilisés couramment sont l acétonitrile, le méthanol et l eau. On peut aussi rajouter de l acide formique (pour le mode positif) ou de l ammoniaque (pour le négatif) à 0.1% pour favoriser l ionisation de la molécule. Le produit désormais dilué est introduit en infusion directe dans l électrospray par une seringue poussée par un pousse-seringue. 1. Analyse d un peptide Voici ci-dessous, le spectre de masse d un peptide en utilisant une source ESI en mode positif : Spectre de masse d un peptide par électrospray 15
La molécule à retrouver a une masse de 2572. L analyse a été concluante car l on retrouve bien cette masse dans ce spectre. En effet, le pic qui apparaît à la masse 1287 correspond au di-chargé de la molécule que l on doit retrouver : 1287 = m + 2 2 m = 1287 2 2 = 2572 De la même façon, les pics à 859 et 644 correspondent respectivement au tri-chargé et au tétra-chargé de la molécule. 2. Analyse d une molécule avec contre-ion Il arrive parfois que les produits à analyser soient des molécules déjà chargées, et accompagnées d un ou plusieurs contre-ion préservant ainsi l électroneutralité en solution. La molécule à identifier ne sera pas souvent complète, on trouvera une masse inférieure à celle attendue correspondant à la masse de la partie intéressante sans le contre-ion. 16
Dans cette analyse dont le spectre est montré-ci-dessus, la molécule à analyser est C 48 H 46 NI de masse 763. La molécule se sépare en deux ions en solution : C 48 H 46 N + de masse 636 et I - le contre-ion de masse 127. Le spectre affiche un pic très intense à la masse 636. Cela correspond à l ion positif de la molécule, qui est donc présente dans l échantillon. 3. Analyse d un complexe métallique Voici un exemple d analyse d un complexe métallique de Fer, de formule brute C 49 ClFeH 63 N 3 O 2 de masse 816. Un contre-ion est présent en solution de formule C 6 H 15 N qui a une masse de 101. En enlevant le contre-ion de la molécule, le pic à 716 pourrait correspondre au reste du complexe. Pour vérifier cela, un zoom sur ce pic accompagné d une simulation ont été réalisés pour identifier les similitudes du massif isotopique : 17
En haut, le zoom et en bas, la simulation. On remarque que les profils de ces massifs isotopiques sont identiques malgré un décalage de 1 entre les deux. Le complexe métallique doit sûrement être présent dans l échantillon. B. Analyse par MALDI Ci-dessous, vous pouvez voir le spectre de masse d un autre peptide fait avec le MALDI- TOF : Spectre de masse d un peptide par source MALDI La masse attendue est de 2295 Da. Comme on peut le voir ci-dessus un seul pic est très intense et vraiment visible. Normalement on devrait voir un pic à 2296 ((M+H) + ) mais cette analyse a été réalisée en mode linéaire, la résolution est donc moins bonne et donc la calibration un peu moins précise. C est pourquoi ce pic est affiché à la masse 2295. Mais l analyse reste quand même concluante. C. Analyses d extraits de champignon par HPLC/MS Une étude a pour projet d extraire un composé particulier à partir de champignons. Le composé est un anticancéreux utilisé en chimiothérapie dans le traitement de nombreux 18
cancers notamment celui des poumons et du sein. Plusieurs échantillons d extraits de champignons nous ont été donné dans lesquels nous devions rechercher ce composé. 1. Détermination des conditions optimales Pour repérer le composé dans les échantillons, il faut déjà savoir quel est son spectre de masse. Il a déjà été réalisé en amont de cette analyse par infusion directe et le voici : Ci-dessus se trouvent les spectres de masse du composé en mode positif et négatif ainsi que la MS² du pic caractéristique du composé afin de l identifier en cas d isobare. En mode positif, un pic apparaît à la masse 876. Pour déterminer les conditions optimales dans lesquelles ce composé ressort bien (et donc ce pic intense), le composé pur a été analysé par LC/MS. J ai dût faire plusieurs essais en changeant les paramètres du spectromètre de masse et de la chromatographie, comme la vitesse à laquelle l éluant passe dans la colonne HPLC, le temps d acquisition, la tension du capillaire dans la source ESI 19
Dans tous les cas, nous sommes en mode positif, la colonne utilisée est une C18 et les solvants sont l eau et le méthanol. Avant d obtenir les spectres de masses ci-dessous, on obtient un chromatogramme : Le composé sort à 11 minutes. Le pic correspondant est indiqué par la flèche. Le chromatogramme ne change pas quand on change les paramètres de l analyse. Mais le spectre de masse si. Voici les différents spectres obtenus en fonction de différents paramètres jusqu à l obtention d un spectre où le pic intéressant est intense : Energie du capillaire : 2000V, Solvants :à 0s 95% eau et 5% méthanol, 20min 100% méthanol 20
Energie du capillaire : 2000V, Solvants: 0s 95% eau et 5% méthanol, 10min 100% méthanol Energie du capillaire : 4000V, Solvants : 0s 50% eau 50% méthanol, 10 min 100% méthanol 21
Sur le dernier spectre, le pic à 876 est bien plus intense que sur les deux précédents. Ainsi, les conditions optimales sont celles utilisées pour ce spectre et sont notées ci-dessus. 2. Résultats des analyses Les extraits de champignons ont été analysés dans les mêmes conditions que celles que j ai cherché à déterminer précédemment. Ainsi, si le composé est présent, un pic à 876 devrait être identifiable facilement. Voici les résultats des analyses de quelques extraits : Comme vous pouvez le voir, nous ne retrouvons aucun pic à 876. L analyse n a pas été concluante car le composé n a pas été retrouvé. 22
VII. Conclusion Ce stage fût une expérience très enrichissante. J ai découvert une autre méthode d analyse, différente de la RMN et de l infrarouge qu on étudie au lycée. La spectrométrie de masse est tout aussi intéressante et j ai apprécié le travail de déchiffrer les spectres obtenus. J ai pût découvrir ce qu est le monde de l analyse, très utile à la recherche. Cependant, ce travail est assez répétitif et quand les analyses ne sont pas concluantes, c est assez démotivant. Après, cela ne m a pas empêché d apprécier pleinement ce stage, même il m a conforté dans l idée de travailler dans le domaine de la chimie sans pour autant devenir chercheuse. 23
Annexes : Tableau des principaux isotopes rencontrés en spectrométrie de masse (masses en Da, abondances relatives en %) : % Masse Elément isotope % Masse isotopique isotope % Masse isotopique isotope % Masse isotopique Masse moyenne C H N O S F Cl Br 12 C 100 12.000 13 C 1.1 13.0033 12.011 1 H 100 1.0078 2 H 0.015 2.0140 1.0079 14 N 100 14.0031 15 N 0.37 15.0001 14.0067 16 O 100 15.9949 17 O 0.04 16.9991 18 O 0.20 17.9992 15.9994 32 S 100 31.9721 33 S 0.789 32.9715 34 S 4.44 33.9679 32.066 19 F 100 18.9984 35 Cl 100 34.9688 37 Cl 31.98 36.9659 35.453 79 Br 100 78.9183 81 Br 97.28 80.9163 79.904 7883 81Br 97.28 80.9163 79.904 Affinité protonique : l affinité protonique correspond à la basicité (au sens de Bronsted) en phase gazeuse d une espèce chimique. La réaction M + H + MH + ne peut se produire que si elle est exothermique. La valeur de l affinité protonique de M correspond à l énergie produite par cette réaction. Par convention, elle est toujours notée positivement. En spectrométrie de masse, l affinité protonique est utilisée pour le choix du gaz réactant pour une source CI. Voici quelques exemples d AP de gaz couramment utilisés en CI : Matrices : Voici quelques matrices souvent utilisées par le laboratoire pour des analyses avec le MALDI-TOF : 24
Le laser du MALDI est réglé à 355nm. Ces molécules absorbent à cette longueur d onde. Elles cristallisent aussi très facilement et sont solubles dans les solvants organiques. MS/MS (ou MS²) : La spectrométrie de masse en tandem ou MS/MS consiste à isoler un ion parent déjà analysé et de le fragmenter. Ces fragments peuvent être des ions ou bien des neutres. Ils sont analysés par un autre analyseur. Cette technique permet de bien identifier les ions grâce à leurs fragments et aussi de reconnaître les fragments qu il y avait déjà dans le premier spectre de masse. Rien n empêche de répéter cette technique plusieurs fois en isolant un ion fragment qui devient un ion parent et ainsi de suite Elle sera alors appelée MS/MS/MS n fois ou MS n. Sources : Livres : SPECTROMÉTRIE DE MASSE, E. DE HOFFMAN, J. CHARRETTE et V. STROOBANT, éditions MASSON, 1994 Sites internet : http://atechimie.univ-lille1.fr/chromatographie-phase-liquide/detecteurs/electrospray- Spectrometre+de+masse/ http://www.icsn.cnrs-gif.fr/img/pdf/chapitre1.pdf http://www.iut-acy.univ-savoie.fr/fileadmin/dut/mph/fichiers/semestre3/techniquesspectroscopiques/spectrometrie-de-masse.pdf http://bts.chimie.encpb.free.fr/11_12/cours/orga/0i-03/co-03_cours_spectro_masse.pdf http://biotech.spip.ac-rouen.fr/spip.php?article9 25