En vue de l'obtention du. Présentée et soutenue par Gérard MAILLOT Le 23 octobre 2009

THÈSE En vue de l'obtention du DOCTORAT DE L UNIVERSITÉ DE TOULOUSE Délivré par l'université Toulouse III - Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Biologie Moléculaire Présentée et soutenue par Gérard MAILLOT Le 23 octobre 2009 Titre : Contribution à l étude de l expression et des fonctions des micrornas dans les cancers du sein. JURY Dr Catherine Tomasetto, IGBMC, Illkirch, rapporteur Dr François Dautry, Institut André Lwoff, Villejuif, rapporteur Dr Florence Cabon, Institut André Lwoff, Villejuif, examinateur Pr Gilles Favre, INSERM U563, Toulouse, président du jury Dr Stéphan Vagner, INSERM U563, Toulouse, directeur de thèse Ecole doctorale : Biologie-Santé-Biotechnologies de Toulouse Unité de recherche : INSERM U563, Centre de Physiopathologie de Toulouse-Purpan, Institut Claudius Regaud Directeur de Thèse : Dr Stéphan Vagner 1

ffffffffffffffffffffff 2

REMERCIEMENTS Les personnes qui m ont côtoyé me diront «toi Gérard tu écris des remerciements, toi avec ton caractère, pppffffff», mais du fond du cœur ces mots me viennent confus pour s immortaliser sur ces pages. Je remercie les professeurs Georges Delsol et Gilles Favre pour m avoir accueilli au sein du centre de Physiopathologie de Toulouse-Purpan dans l unité INSERM U563 à l Institut claudius Regaud. J ai bénéficié d un environnement agréable et propice à la science. Merci. Je tiens à remercier les membres du jury et notamment le Dr. François Dautry, le Dr. Catherine Tomasetto et le Dr. Florence Cabon qui m ont fait l honneur de lire et d évaluer mon manuscrit et de participer à mon jury de thèse. Merci. Stéphan, ah Stéphan. Que suis-je censé dire? Mon encadrement n a pas dû être une simple partie de plaisir. Mon impatience à tout, à une recherche rapide, dynamique et des fois «une recherche à ma façon» a dû être canalisée pour aboutir. Tu t y es employé, en posant des garde-fous, en me faisant bénéficier de ton expérience. Tu as su me faire participer à la vie d un laboratoire en me proposant d encadrer Jacobo, Valérie, Nathalie et Margaux, signe je pense d une confiance en moi. Mon exigence à avoir accès à des outils de pointe a été abreuvée par ton dévouement à faire vivre l équipe. Ton pointilleux allait même à nous former à la bonne gestion du matériel et consommables. J ai senti des fois où nous pouvions échanger d égal à égal, la frontière de l encadrement s effritant peu à peu. Signe d une perspicacité et d un sens de l observation digne d un bon chercheur, tu as été le seul a remarqué sur une vidéo personnelle l envol fortuit d un groupe d oiseaux pendant une scène chère à mes proches et à moi-même. Tu fais partie des personnes qui ont su me faire progresser, m apporter énormément. Je crois te rendre hommage en te faisant part de mes phrases favorites si souvent répétées à la paillasse : «arrêtons d e les mouches car la science dans tout ça», «cool calme zen, lexomil». Merci de tout cœur. Stefania, tu as su me donner du courage quand j en ai eu besoin «ma que». Professionnellement mais aussi dans ma vie privée, ton soutien a été et je pense est indéfectible «mais qu est ce que tu souhaites faire, tu veux que je réponde à ta place, non, donc». Les discussions scientifiques s imprègnent d une simplicité au détour de ta voix. Tu as su me guider dans mon apprentissage à la présentation orale, à la maîtrise d un sujet 3

REMERCIEMENTS scientifique complexe. Tu m as apporté énormément, je t en suis reconnaissant. Mon seul regret est de ne pas t avoir entendu chanter en italien au labo. Merci de tout cœur. Un grand merci à Piou, Zad, Sandra (P et BF), Sophie, Loubna, Fred pour avoir été mes acolytes de bureau ou de paillasse. Nous nous sommes connus en tant que collègues et nous nous quittons en tant qu amis, que dire de plus ah oui : Piou, nous avons fait et défait la science autour d innombrables tasses de café, génial. Zad, le plus grand mérite en ta faveur c est d avoir fait croire à Stefania et à Stéphan que tu es un étudiant de thèse. Chapeau, et merci pour toutes ces discussions scientifiques parfois houleuses mais constructives. Sandra P, ton implication dans mes projets, ton envie de réaliser de façon très pointilleuse des expériences même les plus banales t honore. Que de bons moments. Sophie, je n ai jamais entendu cela «poulait». Tu as su te montrer d une aide précieuse à l avancée de nos projets. Pour une fois j ai trouvé quelqu un qui souhaite organiser et ranger plus que moi, c est impressionnant. Loubna, ou plutôt Loubni, tes chansons raisonneront longtemps dans ma tête. Sandra BF, ton sens commun et ta gentillesse font de toi quelqu un d inoubliable. Fred, que de bons moments avec un aussi fin connaisseur des saveurs des îles, «un ti punch». Magali ou «l âne à pattes», «j ai pas le temps là parce que je dois sauver des vies». D un professionnalisme, d une gaieté de cœur, tu es généreuse. Nous avons mené à bâton rompu nos projets. Ton implication m a été bénéfique. Merci. Valérie, «ah non j ai pas le temps j suis pressée, après peut être».tu as un volume de travail impressionnant. Ta progression est à ton honneur et j en suis content. Merci. Anne C, «mon train est à 18h52, j arrive à 19h12 et prends la voiture à 19h14», ton sens de la précision et ta gestion du temps sont incomparables. On se verra peut être sur le morceau de caillou que nous partageons dans nos racines. Anne C bis, nous n avons pas encore eu le temps de bien discuter réellement mais ta présence a été agréable. La place me manque, je ne peux donc qu écourter mes remerciements pour l ensemble des membres de l U563 actuels ou qui sont vers d autres horizons maintenant. Un grand merci à vous qui m ont permis de travailler dans un cadre agréable (secteur culture Caro, Anne, 4

REMERCIEMENTS Florence, Lourdès, Christiane ; secteur laverie Marie-Ange, Adeline, Isa ; le secrétariat toujours au top : Jeannine ; la radioc : Anne, Jean-Charles, Isa). Sans vous, mon travail n aurait pas été possible. Merci. Un merci à Nico, Marine, Lolo, Guigui, Flo, Emilie (les deux), Leïla, Cyril.. qui m ont fait apprécier la vie de thésard. Je remercie mes amis, Bruno (les deux), Ludo, Ti Bil. Dès le début, vous avez cru en moi et vous m avez encouragé à me lancer dans de grandes études. Merci les gars. Et c est ici que mes remerciements sont autant de coup de poignard envers vous à qui je dois tout. En effet, mère et père, les quelques mots couchés ici sont bien insuffisants et ne seront d ailleurs qu un pâle reflet de toute la gratitude que je vous exprime. Vous m avez donné envie de décrocher la lune, vous avez juste eu l audace de croire en moi. A mes sœurs, à mon frère qui sont de solides piliers sur lesquels il fait bon s appuyer. Vous, membres de ma famille, votre présence est réconfortante et m est indispensable. Merci. A la génération qui vient et qui souhaite prendre tonton Gé comme exemple car il a quitté sa campagne réunionnaise pour la grande aventure métropolitaine, courage les enfants. A mes grands-parents qui je pense aurait été fiers de me voir soutenir un des diplômes les plus prestigieux de France. A ma belle famille dont le sacrifice aura été grand. Vous m avez permis de connaître votre fille, la plus belle aventure de toute ma vie. Votre soutien est sans faille. Enfin, je tiens à dédier cette thèse à Aurélie pour avoir su me guider, être ma muse tout au long de mes études. Merci de m avoir donné ce qu un père peut rêver de mieux, un joli petit enfant qui me comble de bonheur. Du plus profond de mon cœur, merci. 5

ABREVIATIONS ABREVIATIONS ABL1 c-abl oncogene 1, receptor tyrosine kinase ADN acide désoxyribonucléique Af4 (AFF1) AF4/FMR2 family, member 1 Ago argonaute AIB1 amplified in breast cancer-1 All1 (MLL) myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax homolog, Drosophila) ANXA1 annexin A1 APAF-1 apoptotic peptidase activating factor 1 API5 apoptosis inhibitor 5 ARN acide ribonucléique ARNm acide ribonucléique messager BAK1 BCL2-antagonist/killer 1 BCL2 B-cell CLL/lymphoma 2 BCL-W (BCL2L2) BCL2-like 2 BMPR2 bone morphogenetic protein receptor, type II (serine/threonine kinase) CCND1 cyclin D1 CCNE1 cyclin E1 CD71 (TFRC) transferrin receptor (p90, CD71) CDC34 cell division cycle 34 CDK6 cyclin-dependent kinase 6 CLOCK circadian locomoter output cycles kaput protein CRK v-crk sarcoma virus CT10 oncogene homolog (avian) CTSD cathepsin D DAXX death-domain associated protein DCL1 Dicer-Like 1 DCP1 decapping protein 1 DCP2 decapping protein 2 DGCR8 DiGeorge syndrome critical region gene 8 dsrbd double stranded RNA Binding domain E 2 17-β-œstradiol E2F3 E2F transcription factor 3 EFNA3 ephrin-a3 EGFR epidermal growth factor receptor eif4e eukaryotic initiation factor 4E EMT epithelial mesenchymal transition ERBB2 (HER2) v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2, neuro/glioblastoma derived oncogene homolog (avian) ERK extracellular-regulated kinase ESR1 estrogen receptor 1 EWS ewing sarcoma exp5 exportine-5 FOXO3 forkhead box O3 FZD3 frizzled homolog 3 (Drosophila) GAX growth arrest-specific homeo box GLS glutaminase 6

ABREVIATIONS GW182 (TNRC6A) glycine-tryptophan protein of 182 kda; trinucleotide repeat-containing gene 6A HBV Hepatitis B Virus HCV Hepatitis C Vivus HES1 hairy and enhancer of split 1, (Drosophila) HER3 (ERBB3) v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3 HIV-1 Human immunodeficiency virus type 1 HMGA2 high mobility group AT-hook 2 hnrnp A1 heterogeneous ribonucleoprotein A1 hnrnp K heterogeneous ribonucleoprotein K HOXA5 homeobox A5 HOXD10 homeobox D10 HSPB1 heat shock 27kDa protein 1 HYL1 Hyponastic leaves 1 ITGA5 integrin, alpha 5 ITGB3 integrin beta 3 IRS1 insulin receptor substrate 1 JMY junction mediating and regulatory protein, p53 cofactor KRT19 keratin 19 KSRP KH-type splicing regulatory protein LATS2 large tumor suppressor, homolog 2 lin-4 cell lineage-4 (C. elegans) lin-14 cell lineage-14 (C. elegans) lin-28 cell lineage-28 homolog (C. elegans) LNA locked nucleic acid Loqs loquacious Lsm1-7 LSM1 homolog, U6 small nuclear RNA associated (S. cerevisiae) 1 à 7 Mcl1 myeloid cell leukemia sequence 1 (BCL2-related) MERTK c-mer proto-oncogene tyrosine kinase mirna microrna mirisc mirna-rna-induced Silencing Complex mirnp mirna-ribonucleoproteins MITF microphthalmia-associated transcription factor MMP16 matrix metallopeptidase 16 MOV10 Moloney leukemia virus 10, homolog (mouse) MYB v-myb myeloblastosis viral oncogene homolog (avian) MYCN v-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived (avian) NF45 (ILF2) interleukin enhancer binding factor 2, 45kDa NF90 (ILF3) interleukin enhancer binding factor 3, 90kDa NTR non traduit (région 5 ou 3 non traduite d un ARNm) ORF Open Reading Frame P-bodies Processing bodies P27kip1 (CDKN1B) cyclin-dependent kinase inhibitor 1B p57kip2 (CDKN1C) cyclin-dependent kinase inhibitor 1C (p57, Kip2) p68 (DDX5) DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 5 p72 (DDX17) DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 17 PACT (PRKRA) protein kinase, interferon-inducible double stranded RNA dependent activator PAK1 p21 protein (Cdc42/Rac)-activated kinase 1 7

ABREVIATIONS PDCD4 Programmed cell death protein 4 PEI polyethylenimine PGR progesterone receptor PHB prohibitin PIK3R2 phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 2 (beta) PPIF peptidylprolyl isomerase F pré-mirna précurseur de mirna pri-mirna primary transcript of mirna PTEN phosphatase and tensin homolog PTMA prothymosin, alpha PTPRN2 protein tyrosine phosphatase, receptor type, N polypeptide 2 R2D2 dsrna-binding domains (R2) and is associated with DCR-2 (D2) RARA retinoic acid receptor, alpha RBP RNA Binding protein RCK/p54 (DDX6) DEAD box-6; DEAD/H (Asp-Glu-Ala-Asp/His) box polypeptide 6 (RNA helicase, 54kD) RdRp RNA-dependent RNA polymerase RDX radixin RE récepteur des œstrogènes RECK reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs RHA ATP-dependent RNA helicase A RISC RNA-induced silencing complex RNAse ribonucléase RNAi RNA interference RSV virus respiratoire syncytial RTKN rhotekin shrna short interfering RNA SILAC stable-isotope labeling by amino acids in cultured cells sirnas small interfering RNAs SIRT1 sirtuin 1 SNALP stable nucleic acid lipid particles SNIP1 Smad nuclear interacting protein 1 SOX4 SRY (sex determining region Y)-box 4 SUFU suppressor of fused homolog (Drosophila) TAF15 TAF15 RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)- associated factor, 68kDa TFF1 trefoil factor 1 TGFBR2 transforming growth factor, beta receptor II (70/80kDa) TGIF2 TGFB-induced factor homeobox 2 TIMP3 tissue inhibitor of metalloproteinase 3 TLS/FUS fusion (involved in t(12;16) in malignant liposarcoma) TOPORS topoisomerase I binding, arginine/serine-rich TP53BP2 tumor protein p53 binding protein, 2 TP53INP1 tumor protein p53 inducible nuclear protein 1 TP73L (TP63) tumor protein 63 TPM1 tropomyosin 1 TRBP TAR (HIV) RNA binding protein TRIM25 tripartite motif-containing 25 TRKC (NTRK3) neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3 TTP tristetraprolin 8

ABREVIATIONS TUSC2 tumor suppressor candidate 2 UBC9 (UBE2I) ubiquitin-conjugating enzyme E2I (UBC9 homolog, yeast) VEGF vascular epithelial growth factor Xrn1 5'-3' exoribonuclease 1 ZEB1 zinc finger E-box binding homeobox 1 ZEB2 zinc finger E-box binding homeobox 2 9

SOMMAIRE SOMMAIRE INTRODUCTION...15 I- Généralités sur les mirnas...17 I-1- Mise en évidence des mirnas...19 I-1-1- mise en évidence chez le nématode...19 I-1-2- caractérisation des mirnas dans de nombreuses espèces et de nombreux génomes...20 I-1-3- conservations, origines et implications potentielles des mirnas au cours de l Evolution...21 I-2- La nomenclature des mirnas...22 I-3- Les similitudes et les différences entre les mirnas et les sirnas dans le processus de l interférence à l ARN ou RNAi...25 II- Mode de synthèse et régulations de l expression des mirnas...29 II-1- Localisation génomique des transcrits contenant les mirnas...29 II-2- transcription des transcrits primaires de mirnas...31 II-3- Maturation des transcrits ARN contenant les mirnas...33 II-3-1- libération du pré-mirna à partir du transcrit primaire dans le noyau...33 II-3-1-1- libération du pré-mirna par la voie canonique du «microprocessor» Drosha/DGCR8...33 II-3-1-2- libération du pré-mirna par la voie non canonique des mirtrons...37 II-3-2- export du pré-mirna vers le cytoplasme...37 II-3-3- excision du mirna mature du pré-mirna au niveau du cytoplasme...38 II-3-4- Chargement du mirna mature dans le complexe RISC...41 III- Les mécanismes de régulation de l expression post-transcriptionnelle des gènes par les mirnas...46 III-1- Reconnaissance des ARNm ciblés par RISC, importance de la complémentarité de séquence mirna::arnm...46 III-2- inhibition de la traduction et/ou dégradation des ARNm par les mirnas...50 III-2-1- répression de l initiation de la traduction par les mirisc...51 III-2-2- inhibition de la post-initiation de la traduction...53 III-2-3- cas particulier de l activation de la traduction par les mirnas...54 III-2-4- régulation de la dégradation des ARNm ciblés par mirisc...55 IV- mirnas et cancers...57 IV-1- Perturbations de l expression des mirnas dans les cancers...57 IV-1-1- Les évidences de dérégulation d expression des mirnas dans les cancers...57 10

SOMMAIRE IV-1-2- Perturbations d expression des mirnas par réarrangement chromosomique...58 IV-1-3- Perturbations d expression des mirnas par régulation transcriptionnelle...59 IV-1-4- Perturbations d expression des mirnas par des défauts d expression des facteurs de maturation des pri/pré-mirnas...60 IV-1-5- Perturbations d expression des mirnas par des polymorphismes de nucléotides...60 IV-1-6- Expression des mirnas comme outils de pronostic des cancers...61 IV-2- Dérégulation de la liaison mirna::arnm cible...61 IV-2-1- Dérégulations liées aux réarrangements chromosomiques...61 IV-2-2- Dérégulations liées aux polymorphismes sur les ARNm...62 IV-2-3- Dérégulations liées aux polymorphismes sur les mirnas...62 IV-3- Fonction des mirnas dans le cancer...63 IV-3-1- Les mirnas oncogènes...63 IV-3-2- Les mirnas suppresseurs de tumeur...64 IV-3-3- Les mirnas régulateurs de la prolifération, de l apoptose et du cycle cellulaire...65 IV-3-4- Les mirnas régulateurs de l angiogenèse...67 IV-3-5- les mirnas régulateurs des processus métastatiques...67 PRESENTATION ET OBJECTIF DE L ETUDE...87 RESULTATS...89 I- Régulation œstrogénique de l expression et des fonctions des mirnas...90 I-1- Introduction...90 I-1-1- Les récepteurs des œstrogènes...90 I-1-2- Mécanismes d action des RE...91 I-1-3- Les gènes cibles régulés par les RE...94 I-1-4- Les RE dans les cancers du sein...95 I-2- La répression œstrogéno-induite de l expression de mirnas est impliquée dans la prolifération des cellules tumorales mammaires...97 I-2-1- stratégie expérimentale...98 I-2-1-1- étude des variations d expression des mirnas sous E2...98 I-2-1-2- étude des fonctions des mirnas candidats dans la prolifération œstrogénoinduite des MCF-7...99 I-2-1-3- Etude in vivo des effets de l œstradiol sur l expression des mirnas dans les cancers du sein...99 I-3- Article...99 I-4- Conclusion/Discussion...145 II- Expression et fonctions mirnas dans la progression métastatique des cancers du sein...149 11

SOMMAIRE II-1- Introduction...149 II-2- Matériel et méthode...150 II-2-1- Culture cellulaire...150 II-2-2- Cellules et infection virale...151 II-2-3- Formation de tumeurs et de métastases chez la souris...151 II-2-4- Analyse de l expression des mirnas par puces à mirnas...152 II-2-5- Test de migration et d invasion...152 II-2-6- Caractéristiques des tumeurs de patientes...153 II-3- Résultats...154 II-3-1- Caractérisation de l expression des mirnas dans les tumeurs primaires du modèle 4T1...154 II-3-2- Confirmation des données d expression des mirnas issus des cribles à grande échelle...154 II-3-3- Effets de l expression de mir-31, -125b ou -223 sur la migration et l invasion des cellules 67NR...155 II-3-4-Effets de la sous-expression de mir-31 ou -125b sur la colonisation métastatique pulmonaire chez la souris...156 II-3-5- Analyse du taux d expression de mir-31 et -125b dans des tumeurs primaires mammaires de patientes atteintes de métastases...156 II-4- Discussion...157 DISCUSSION ET PERSPECTIVES...167 I- Identification des ARNm cibles de mirnas...169 II- Régulation de l expression des mirnas par les exosomes...171 III- Expression des mirnas comme outils diagnostic/pronostic potentiel des cancers...174 IV- Utilisation d oligonucléotides comme outils thérapeutiques potentiels des pathologies humaines...176 REFERENCES...181 ANNEXES...213 ANNEXES PROTOCOLES...216 SOMAIRE DES ANNEXES PROTOCOLES...217 12

SOMMAIRE FIGURES Figure 1 : maturation des mirnas dans les cellules animales...18 Figure 2 : exemple de nomenclature de la famille mir-181 (humain)...24 Figure 3 : similitudes et différences entre les mirnas et les sirnas...26 Figure 4 : localisation génomique des mirnas...30 Figure 5 : reconnaissance des tige-boucles par le «microprocessor»...34 Figure 6 : clivage des pré-mirnas par Dicer...40 Figure 7 : Etapes de la formation du complexe RISC chez l homme...42 Figure 8 : Asymétrie dans la sélection d un des deux brins d un double brin de mirna en tant que mirna mature...43 Figure 9 : interaction des mirnas avec les ARNm dans les cellules animales...47 Figure 10 : mécanismes moléculaires de la régulation de la traduction et/ou de la dégradation des ARNm...52 Figure 11 : domaines fonctionnels des récepteurs des œstrogènes REα et β...91 Figure 12 : modes d action des récepteurs des œstrogènes...93 Figure 13 : Effet du 17-β-œstradiol sur l expression d un gène rapporteur sous contrôle du promoteur du mir- 21...146 Figure 14 : Analyse des effets du 17-β-œstradiol sur le recrutement des ARNm au niveau des polysomes dans les cellules MCF-7...148 Figure 15 : caractérisation de l expression des mirnas dans le modèle murin 4T1...160 Figure 16 : Analyse supervisée de l expression des mirnas dans le modèle murin 4T1...161 Figure 17 : l expression de mir-31, 125b ou 223 corrèle avec les capacités métastatiques de lignées cancéreuses mammaires...163 Figure 18 : mir-31 et 125b auraient des propriétés pro-métastatiques dans les cellules cancéreuses mammaires...164 Figure 19 : expression des mir-31 et -125b dans une série de tumeurs primaires du sein...165 Figure 20 : effet de mir-31 et 125b sur la migration et l invasion des cellules MCF-7...166 Figure 21 : effet des exosomes dans la maturation des pri-mirnas chez Arabidopsis thaliana...173 Annexe figure 1 : modèle d ARNm bicistronique...214 Annexe figure 2 : profil polysomique des cellules MCF-7...215 TABLEAUX Tableau 1 : outils bioinformatiques de prédiction des ARNm cibles des métazoaires...49 Tableau 2 : Différences d expression des mirnas dans les cancers...70 Tableau 3 : fonctions des mirnas dans les processus clés dérégulés dans les cancers...85 13

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INTRODUCTION INTRODUCTION 15

INTRODUCTION Chez les eucaryotes, le contrôle dynamique de l expression des gènes permet de générer une diversité protéique et fonctionnelle nécessaire à la survie cellulaire et à l adaptation à l environnement. Jusqu aux années 1980, l idée prévalait que la majorité des régulations des gènes se faisait à l étape transcriptionnelle. Récemment, d autres niveaux de régulation ont été mis en évidence au cours d évènements post-transcriptionnels. Pour être fonctionnels, les ARNm eucaryotes doivent contenir, en plus d'un cadre de lecture, des informations qui définissent leur maturation, leur export nucléaire, leur localisation, leur traduction et leur stabilité. Une notion apparue ces dernières années est que la plupart de ces informations est portée par des protéines de liaison aux ARNm et des micrornas (mirnas). Ces molécules s'associent aux transcrits pour former des complexes ribonucléoprotéiques dynamiques qui influencent leur fonction et devenir à travers le contrôle qu'elles exercent sur des étapes spécifiques de l'expression post-transcriptionnelle des gènes. Dans cette introduction, nous présenterons dans une première partie les généralités sur les mirnas, leur appartenance au processus d interférence à l ARN, leurs mises en évidence dans les génomes, leurs degrés de conservation ainsi que la nomenclature appliquée. Dans une deuxième partie nous détaillerons la localisation, l organisation des mirnas sur les génomes et verrons comment ils sont exprimés et maturés. Dans une troisième partie, nous décrirons les mécanismes mis en jeu par les mirnas pour contrôler l expression post-transcriptionnelle des gènes. Enfin, dans une quatrième partie, nous nous intéresserons à l implication des mirnas dans les cancers. 16

INTRODUCTION I- Généralités sur les mirnas L intérêt que porte la recherche scientifique sur les mirnas a connu un essor à partir des années 2000. Une simple recherche bibliographique pour le terme «microrna» montre une apparition quasi exponentielle de publications scientifiques entre 2000 et 2008. 2000 nombre de publications 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 années Les mirnas sont des petits ARN non codant d environ 22 nucléotides répandus dans de très nombreux génomes (référencés dans mirbase, (Griffiths-Jones et al., 2006)). En régulant l expression post-transcriptionnelle des gènes, les mirnas sont impliqués dans de très nombreux processus physio(patho)logiques tels que le contrôle du développement des organismes, la régulation de la prolifération, l apoptose, la différentiation cellulaire ou encore dans divers processus oncogéniques (Kim, 2005). Trois étapes clés aboutissent à la production d un mirna mature dans les cellules animales (Bartel, 2004; Bartel, 2009; Filipowicz et al., 2008; Winter et al., 2009) (figure 1) : (i) l excision d une tige-boucle de 60~70 nucléotides d un transcrit primaire d ARN (ou pri-mirna) par la RNAse III Drosha associée à son cofacteur DGCR8. Il est à noter qu il existe également une production minoritaire de mirnas par la machinerie d épissage où l intron excisé constitue le pré-mirna (appelé prémirtron) (ii) l export de la tige-boucle (ou pré-mirna) vers le cytoplasme par l exportine-5 17

INTRODUCTION Figure 1 ADN transcription transcription // exon intron exon // pré-mirtron pri-mirna machinerie d épissage m 7 GpppN AAAAAA // // Drosha DGCR8 pré-mirna exportine-5 noyau cytoplasme Dicer double brin de mirna (sélection d un des brins pour incorporation à RISC cf. figure 7) Ago1-4 mirisc ou mirnp Figure 1 : maturation des mirnas dans les cellules animales. Le schéma indique les deux voies de production des mirnas dans les cellules animales. Le panel de gauche représente la voie de production majoritaire des mirnas. Dans cette voie, les tige-boucles des transcrits primaires (pri-mirnas) sont excisées par le complexe Drosha/DGCR8. Drosha, une RNAse III, est recrutée par la protéine de liaison aux ARN DGCR8 aux structures en tige-boucle et clive celle-ci, libérant alors le prémirna. Le panel de droite représente la voie de production minoritaire des mirnas. Dans cette voie, la machinerie d épissage libère l intron qui se structure en tige-boucle pour former le pré-mitron. Les prémirnas/pré-mirtrons sont alors exportés par l exportine-5 (vert), maturés au niveau du cytoplasme par Dicer (violet) pour fournir un double brin de mirna. L un des deux brins est alors incorporé dans RISC (RNAinduced silencing complex). Dans notre cas, le brin (en rouge) constitue le mirna mature et interagit directement avec une des quatre protéines Argonaute (Ago1-4, en jaune) pour former le cœur minimaliste de RISC (mirisc : mirna-risc, mirnp : mirna-ribonucleoprotein). m 7 GpppN : coiffe, avec N pour un des quatre nucléotides (A, T, C, G), m : méthyl ; AAAAA : queue polya. 18

INTRODUCTION (iii) l excision de la boucle par la RNAse III Dicer et le choix d un des deux brins de la tige pour constituer le mirna mature. Chez les plantes, cette maturation diffère en partie. En effet, le pré-mirna généralement plus long (90~120 nucléotides) est maturé dans le noyau ; le double brin de mirna généré est alors exporté vers le cytoplasme où l un des deux brins est choisi pour former le mirna mature (Shabalina and Koonin, 2008). Les mirnas matures sont alors incorporés au sein de complexes ribonucléoprotéiques appelés RISC (RNA-Induced Silencing Complex). Au travers de ce complexe ils interagissent avec leurs ARNm cibles, la plupart du temps dans les régions 3 non traduites (3 NTR), et entraînent l inhibition de la traduction et/ou de la dégradation des ARNm. Une estimation chez l homme suggère que les mirnas cibleraient environ 30% des gènes du génome (Lewis et al., 2005). Les protéines de la famille Argonaute (Ago), qui interagissent directement avec les mirnas, sont l une des composantes majeures de la répression exercée par RISC. Il existe quatre protéines Ago encodés par quatre gènes distincts dans le génome humain (Ago1-4), 26 chez Caenorhabditis elegans, deux chez Drosophila melanogaster, dix chez Arabidopsis thaliana (Hutvagner and Simard, 2008). I-1- Mise en évidence des mirnas I-1-1- mise en évidence chez le nématode Plusieurs éléments vont amener à la caractérisation des mirnas, le premier découvert étant lin-4 : (i) le gène lin-4 fait partie de la famille des gènes hétérochroniques qui contrôlent la coordination temporelle du développement larvaire du nématode (division, différentiation, migration et mort cellulaires) (Ambros, 1989). Le produit du gène est requis dans presque toutes les transitions des différents stades larvaires (Ambros, 1989; Chalfie et al., 1981), et notamment il est requis pour la sousexpression de la protéine lin-14 à partir du milieu du stade larvaire L1 et subséquemment (Ruvkun et al., 1991) (ii) l (es) élément(s) régulateur(s) négatif(s) nécessaire(s) à la répression temporelle de la protéine lin-14 au cours du développement se situe dans le 3 NTR de l ARNm lin-14 (Wightman et al., 1991) 19

INTRODUCTION (iii) il a été suggéré que lin-4 puisse être l élément en trans capable de se lier à la région régulatrice du 3 NTR de lin-14 (Ruvkun et al., 1991). Ainsi, en 1993, le groupe d Ambros détermine le produit du gène lin-4 non pas comme une protéine mais comme étant compris de deux petits ARNs : lin-4s le plus abondant d une longueur de 22 nucléotides, et lin-4l de 61 nucléotides (Lee et al., 1993). Les auteurs suggèrent que lin-4s soit le produit final provenant de lin-4l, et que, lin-4l formerait une tige-boucle avec lin-4s dans l un des bras de la tige. Cet article caractérise pour la première fois ce que l on appellera plus tard les précurseurs de mirnas (l ARN de 61 nucléotides) ainsi que le mirna mature (22 nucléotides). Ces deux petits ARN contiennent des séquences complémentaires à des éléments répétés situés dans le 3 NTR de l ARNm lin-14 (spécifiquement dans la région régulatrice mise en évidence par (Ruvkun et al., 1991; Wightman et al., 1991)). Leur modèle propose alors une régulation de la traduction de lin-14 par lin-4 via une interaction ARN-ARN antisens. Parallèlement, un autre article démontre aussi que le 3 NTR de l ARNm lin-14 est nécessaire et suffisant pour conférer la régulation de lin-14 par lin-4 par des expériences de gènes rapporteurs (Wightman et al., 1993). Ils proposent également un mécanisme par lequel lin-4 interagit par appariement complémentaire sur le 3 NTR de l ARNm lin-14 pour en inhiber sa traduction. Ce modèle de régulation de la traduction sera en partie validé en 1999 (Olsen and Ambros, 1999). La découverte de lin-4 chez le ver fut considéré comme une singularité jusqu en 2000 avant la découverte d un second ARN de 21 nucléotides, let-7 (Reinhart et al., 2000). Ce petit ARN, tout comme lin-4 (i) fut mis en évidence par crible génétique en réalisant des mutations du génome de C. elegans, (ii) est un petit ARN régulé de manière temporelle et dont la fonction est essentielle au cours du développement, (iii) intervient dans la transition du stade larvaire L3/L4 vers les cellules adultes en partie en réprimant l expression de lin-41 (Reinhart et al., 2000). I-1-2- caractérisation des mirnas dans de nombreuses espèces et de nombreux génomes L observation que la séquence de let-7 soit conservée au cours de l évolution amène à la découverte de ce petit ARN dans plusieurs tissus humains mais aussi chez Drosophila melanogaster (Pasquinelli et al., 2000). Plusieurs laboratoires vont par la suite décrire une multitude de petits ARNs dans des lignées cellulaires humaines, chez la mouche, le ver, les poissons, les plantes (Ambros et al., 2003; Aravin et al., 2003; Dostie et al., 2003; Grad et al., 2003; Houbaviy et al., 2003; Lagos-Quintana et al., 2001; Lagos-Quintana et al., 2003; Lagos- 20

INTRODUCTION Quintana et al., 2002; Lau et al., 2001; Lee and Ambros, 2001; Lim et al., 2003a; Michael et al., 2003; Mourelatos et al., 2002). Si en 2000, lin-4 et let-7 furent appelés strna (small temporal RNA ; (Pasquinelli et al., 2000)) car ils sont régulés au cours du développement, ils sont renommés mirnas en 2001 car nombre d entre eux sont exprimés sans relation avec les étapes du développement (Lagos-Quintana et al., 2001). La plupart des mirnas décrits proviennent de techniques de séquençage par clonage préalable. Des approches informatiques se basant sur (i) la détection des tige-boucles de 60~70 nucléotides caractéristique des prémirnas (Lim et al., 2003a), (ii) une conservation des mirnas au sein des espèces ont également été utilisées pour définir de nouveaux mirnas. Il est à noter qu à leur mise en place, les logiciels de prédiction ont démontré leur efficacité chez les animaux mais une inefficacité de détection des mirnas chez les plantes car les structures en tige-boucles de leurs précurseurs sont plus longues (Lim et al., 2003a). Par la suite, des logiciels plus perfectionnés ont permis de détecter ~97% des pré-mirnas de la plante après «entraînement» sur le génome humain (Kadri et al., 2009). En 2009, la base de données mirbase ((Griffiths-Jones, 2004), http://www.sanger.ac.uk/software/rfam/mirna/) recense 885 mirnas dans le génome humain, 689 chez la souris, 153 mirnas chez Drosophila melanogaster, 207 mirnas chez Arabidopsis thaliana. Pas moins de 105 génomes (comprenant plus de 8000 mirnas) répartis entre Métazoaires, Mycétozoaires, Viridiplantae et Virus possèdent au moins un mirna. De manière intéressante et mis à part les virus, les mirnas se retrouvent dans des génomes d organismes multicellulaires. Un des seuls exemples connus maintenant d organisme unicellulaire possédant des mirnas est Chlamydomonas reinhardtii (Zhao et al., 2007). Aucune littérature ne fait état de la présence de mirna chez des bactéries ou chez les eucaryotes inférieurs tels que Saccharomyces cerevisiae. I-1-3- conservations, origines et implications potentielles des mirnas au cours de l Evolution Chez les animaux comme chez les plantes, les mirnas semblent exister depuis plus de 400 millions d années (Floyd and Bowman, 2004; Pasquinelli et al., 2000). Chez les plantes, il a été montré que de nombreuses familles de mirnas sont conservées chez les mousses, gymnospermes, monocotylédones et eucotylédones (Zhang et al., 2006a). De même chez les animaux, de nombreux mirnas sont conservés entre espèces apparentées et certains le sont même entre invertébrés et vertébrés (Hertel et al., 2006; Lau et al., 2001; Lee and 21

INTRODUCTION Ambros, 2001; Pasquinelli et al., 2003; Pasquinelli et al., 2000). S il apparaît que les mirnas soient conservés au sein des deux règnes, il existe très peu de conservation croisée entre les deux. Une seule étude fait état d une conservation entre les mir854 et 855 de la plante (Arabidopsis thaliana) et des animaux (homme, souris, nématode) (Arteaga-Vazquez et al., 2006). Du fait de cette conservation de mir854 et 855, et, du fait que les mirnas soient retrouvés chez les plantes mais aussi chez les métazoaires, il a été suggéré que ces petits ARNs étaient déjà présents chez leur ancêtre commun (Bartel, 2004). Cependant, on ne peut exclure une apparition indépendante des mirnas au sein des deux règnes car de nombreuses différences structurales ainsi qu une différence de maturation sont observées entre les plantes et les animaux (pour revue (Shabalina and Koonin, 2008)). L origine des mirnas reste encore hypothétique ; néanmoins, il a été suggéré que les mirnas dérivent d éléments transposables (Piriyapongsa and Jordan, 2007; Piriyapongsa and Jordan, 2008; Piriyapongsa et al., 2007; Shabalina and Koonin, 2008). Plusieurs études ont fait ressortir une implication potentielle des mirnas dans la complexification morphologique des organismes. Ces observations se basent sur le fait que l augmentation du nombre de gènes codant des protéines (par duplication) soit impliquée dans les processus de complexification des organismes, mais elle ne peut à elle seule expliquer ces phénomènes, notamment dans l acquisition de nouvelles morphologies et de nouveaux caractères (Donoghue and Purnell, 2005; Heimberg et al., 2008). De manière intéressante, il a été observé que plusieurs évènements d acquisition de nouveaux mirnas dans les génomes de certaines espèces corrèlent avec des innovations du développement (Hertel et al., 2006; Prochnik et al., 2007; Zhang et al., 2008b). De plus, trois publications ont suggéré que l innovation et l ajout de nouveaux mirnas est un processus en cours dans les génomes de métazoaires, et, lorsqu ils sont intégrés à un réseau de gènes subiraient peu de mutations et seraient rarement perdus suite à leurs acquisitions (Heimberg et al., 2008; Hertel et al., 2006; Wheeler et al., 2009). I-2- La nomenclature des mirnas Devant le nombre croissant de mirnas découverts, la base de données mirbase a été créée pour les recenser et uniformiser leurs nomenclatures ((Griffiths-Jones, 2004; Griffiths- Jones et al., 2006)). Seuls les mirnas qui font l objet d une publication scientifique sont nommés, à savoir démonstration par clonage, par étude d expression et/ou de maturation. Il est impératif que le 22

INTRODUCTION mirna mature soit retrouvé dans une structure en tige-boucle (5 et/ou 3 du bras de la tige). Les mirnas détectés par homologie de séquence peuvent être nommés sans évidences expérimentales mais en respectant le repliement en tige-boucle sur le génome détecté (Griffiths-Jones et al., 2006). La nomenclature des mirnas se fait selon plusieurs critères. Historiquement, le produit mature des gènes codant les mirnas est écrit «mir» alors que les précurseurs ou les gènes eux-mêmes sont écrits «mir» (Griffiths-Jones et al., 2006). Le préfixe des mirnas se constitue de trois lettres indiquant l organisme d origine (hsa-mir-21 : homo sapiens ; mmumir-24 : mus musculus) et est suivi d un suffixe chiffré. Un pré-mirna est capable de donner en théorie deux mirnas matures qui constituent soit le bras 5 (5p) de la tige soit le bras 3 (3p) de la tige. Une sélection est réalisée entre les deux bras de la tige pour n en garder qu un seul. Si un pré-mirna ne fournit qu un seul mirna mature il sera nommé mir-x, X étant le chiffre. Si le pré-mirna fournit deux mirnas matures, la nomenclature devient : - mir-x-5p mir-x-3p (exemple : mir-17-5p et mir-17-3p), ou, - mir-x et mir-x* (exemple : mir-17 et mir-17*). La nomenclature (*) représente le mirna le moins abondant par rapport aux deux brins de la tige - mir-x-s (bras 5 ) ou mir-x-as (bras 3 ) (Griffiths-Jones, 2004). Il est suggéré de favoriser la nomenclature mir-x-5p ou mir-x-3p pour un prémirna fournissant deux mirnas matures jusqu à ce que les données soient suffisantes pour utiliser la nomenclature mir-x et mir-x* relatif à l abondance des deux brins (Griffiths- Jones, 2004). Une étude a cependant révélé que certains mir-x* sont retrouvés en plus grande quantité que le mir-x correspondant, complexifiant cette appellation mir-x et mir- X* (Okamura et al., 2008). On retrouve également des familles de mirnas matures, à savoir possédant une homologie de séquence. Ce sont des mirnas qui diffèrent de un à trois nucléotides. Leur nomenclature est alors par exemple mir-181a et mir-181b, a et b marquant leurs différences (figure 2). Des loci différents qui fournissent un même mirna mature sont indiqués par un suffixe chiffré. La séquence du mirna mature doit être identique. La nomenclature est par exemple mir-181a-1 et mir-181a-2, 1 et 2 soulignés indiquant la provenance de deux régions chromosomiques différentes (figure 2). Nous devons noter que mir-181a-1* et a-2* sont relativement proches, avec trois bases différentes. Cependant, il est difficile de les classer en famille car même s ils ont trois bases de différences, deux d entre elles se situent dans la région 5 du mirna (figure 2). Cette 23

INTRODUCTION Figure 2 issu du chromosome 1 issu du chromosome 9 5 3 5 pri-mir-181-1 pri-mir-181-2 3 indication de deux chromosomes différents mirnas matures produits mir-181a 5 AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU 3 (issu des chromosomes 1 et 9) mir-181b 5 AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU 3 (issu des chromosomes 1 et 9) mir-181a-1* mir-181a-2* 5 ACCAUCGACCGUUGAUUGUACC 3 (issu du chromosome 1) 5 ACCACUGACCGUUGACUGUACC 3 (issu du chromosome 9) Figure 2 : exemple de nomenclature de la famille mir-181 (humain) La famille des mir-181 est encodée sur deux loci distincts qui produisent potentiellement deux pri-mirnas, le pri-mir-181-1 (chromosome 1) et le pri-mir-181-2 (chromosome). La distinction chromosomique est marquée par les -1 ou -2 soulignés. Quatre mirnas peuvent être produits à partir de ces loci, mir-181a (rouge), mir- 181b (vert), mir-181a-1* (rose) et mir-181a-2* (bleu). * indique le mirna le moins abondant par rapport aux deux brins de la tige. Trois bases différencient mir-181a de mir-181b ou mir-181a-1* de mir-181a-2* (bases soulignées). Néanmoins seuls les mir-181a et -181b sont considérés comme faisant partie d une même famille car les bases différentes se situent hors de la région 5 d ancrage des mirnas (nucléotides 2-7), région nécessaire pour la reconnaissance des ARNm cibles. région 5 est cruciale pour la reconnaissance des ARNm cibles (cf. III-1), et, dans le cas de ces deux mirnas il s avère que les cibles seraient trop différentes. Ainsi, la notion de famille entre mirnas tient de plus en plus compte de l ensemble commun d ARNm cibles que ces derniers pourraient réguler. Lors de la mise en place du consensus, il a été proposé que les noms des mirnas ne devaient porter que peu d informations (homologie/paralogie/orthologie, localisation chromosomique) (Griffiths-Jones et al., 2006). Au cas par cas, l attribution du nom lorsqu il s avère complexe (5p, 3p, *) est laissé à l appréciation de l auteur de la soumission. Aussi, cette nomenclature 24

INTRODUCTION est susceptible d être modifiée, notamment pour le degré de conservation des mirnas entre eux (Griffiths-Jones et al., 2006). Il est à noter qu il existe quelques entorses aux règles pour certains mirnas, par exemple pour let-7, lin-4 ou bantam. En effet, leurs noms sont de type hsa-let-7, cel-lin-4 ou encore dme-bantam. I-3- Les similitudes et les différences entre les mirnas et les sirnas dans le processus de l interférence à l ARN ou RNAi Les mirnas font partie de la famille des petits ARN impliqués dans le processus de l interférence à l ARN, appelé RNAi (RNA interference). Ce mécanisme est conservé au cours de l évolution et se retrouve dans divers organismes uni- et pluricellulaires (Shabalina and Koonin, 2008). Il est impliqué dans les défenses contre les virus, les éléments transposables mais également dans la régulation post-transcriptionnelle de l expression des gènes (pour revue (Bartel and Bartel, 2003; Carthew and Sontheimer, 2009; Umbach and Cullen, 2009)). Le RNAi est activé par la reconnaissance d ARN double brin exogènes (virus) ou endogènes (pré-mirnas, éléments transposables, transcription d ARN antisens) qui sont maturés en petits ARN de 20~25 nucléotides par Dicer afin d être incorporé à RISC (Bernstein et al., 2001; Fire et al., 1998; Hamilton and Baulcombe, 1999; Hammond et al., 2000) (figure 3). Il est à noter que chez les plantes, le ver ou certaines levures, les RdRp (RNA-dependent RNA polymerase) peuvent transformer des ARN simple brin (considérés comme aberrants) en ARN double brin pour amplifier le RNAi et réguler l ARN amplifié (Petersen and Albrechtsen, 2005; Sijen et al., 2001; Wassenegger and Krczal, 2006). Au sein de RISC, le petit ARN assure la spécificité de l ARN à cibler par complémentarité de séquence et permet ainsi à Argonaute d amorcer la répression de l ARN ciblé. Deux classes principales de petits ARN provenant d ARN double brin, les mirnas et les sirnas (small interfering RNAs), interviennent dans le RNAi. Les sirnas et mirnas sont relativement similaires (pour revue (Adams et al., 2007; Bartel, 2004; Carthew and Sontheimer, 2009; Tang, 2005), figure 3) : - ils dérivent d ARN double brin et font à peu près 21 nucléotides - ils peuvent être produits de façon endogène - ils sont maturés par Dicer et utilisent RISC pour induire la répression de leurs cibles. 25

INTRODUCTION Figure 3 infection virale, transposon, transcrits d ARN endogènes complémentaires (transcription antisens) 5 gène contenant un mirna pri-mirna 5 long double brin d ARN 5 pré-mirna 5 Dicer 5 double brin de sirna 5 double brin de mirna 5 5 5 5 sirisc sirisc mirisc / mirnp ARN viraux de transposons de transcriptions antisens dégradation endonucléolytique défense antivirale, inhibition de la propagation des éléments transposables, régulation génique (par autoinhibition du gène produisant le sirna) Cibles ARNs Mécanismes d action Fonctions ARNm - inhibition de la traduction - dégradation exonucléolytique voire endonucléolytique inhibition post-transcriptionnelle de l expression génique (autre que le locus produisant le mirna luimême) Figure 3 : similitudes et différences entre les mirnas et les sirnas Le panel de gauche indique la production de sirnas, provenant soit du génome (transcription antisens ou transposons) soit d infections virales, à partir de longs doubles brins d ARN parfaitement appariés. Dans le cas présenté, deux doubles brins des sirnas peuvent être produits (en vert/bleu et rouge/violet). Le panel de droite indique la production de mirnas à partir de pri-mirnas. Seul un seul double brin de mirna (vert pâle/orange) est produit à partir de la tige-boucle de pré-mirna (cf. figure 1). Les deux voies de maturation convergent vers la protéine Dicer qui réalise le clivage de doubles brins d ARN. Les sirnas ou mirnas sont alors chargés avec une protéine Ago (en jaune) pour former des sirisc (sirna-risc) ou des mirisc/mirnp. Les cibles respectives, les mécanismes d action mis en jeu par les sirisc et mirisc ainsi que les fonctions des sirnas et des mirnas sont indiqués. RISC : RNA-Induced Silencing Complex ; RNP :ribonucleoproteins. 26

INTRODUCTION Quelques différences permettent néanmoins de les caractériser. - les mirnas sont conservés au cours de l évolution alors que les sirnas ne le sont pas ou moins. - les sirnas sont issus de longs ARN double brin parfaitement appariés pouvant être endogènes ou exogènes (issus de la transcription antisens (Watanabe et al., 2008; Yelin et al., 2003), d éléments transposables, de virus, de synthèse d ARN double brin par les RdRp à partir de matrice simple brin (Petersen and Albrechtsen, 2005; Sijen et al., 2001; Wassenegger and Krczal, 2006)). Les mirnas, étant exclusivement produits façon endogène, sont issus d ARN double brin se repliant en tige-boucle (pré-mirnas) et l appariement dans la tige est en général imparfait. - Un seul double d ARN est généré à partir de pré-mirnas alors qu une multitude de sirnas sont générés à partir des précurseurs. - les sirnas régulent les gènes qui les produisent alors que les mirnas sont impliqués dans le contrôle post-transcriptionnel de gènes autres que les loci les produisant. - les sirnas s hybrident parfaitement à leurs cibles et induisent la dégradation de l ARN ciblé par clivage endonucléolytique. Néanmoins, chez les mammifères, le clivage endonucléolytique n est possible que si les sirnas sont associés à Ago2 car elle seule possède cette activité (Liu et al., 2004). Les mirnas en fonction du degré d appariement ARN cible::mirna induisent une répression traductionnelle et/ou une dégradation de l ARNm ciblé. Chez les plantes la distinction entre sirnas et mirnas dans le mécanisme de régulation de l ARN ciblé est minime. En effet, ces mirnas s hybrident de façon quasi-parfaite à l ARNm cible pour le dégrader (Bartel, 2004). Toutefois, il a été montré que les mirnas de plantes peuvent également réguler la traduction (Brodersen and Voinnet, 2009). - la fonction des sirnas est dévolue au maintien de l intégrité des génomes contre des acides nucléiques invasifs (suppression des virus, des transposons) mais également dans la régulation post-transcriptionnelle de l expression des gènes (pour la transcription antisens). Les mirnas sont plutôt spécialisés dans la gestion du transcriptome et du protéome d une cellule (Carthew and Sontheimer, 2009). Récemment une autre classe de petits ARN de 25~30 nucléotides, les pirnas (piwirnas), ont été découverts chez les animaux et interviennent dans le processus du RNAi. Ils ne sont 27

INTRODUCTION pas produits à partir d ARN double brin. Leur maturation n est pas totalement comprise mais certains éléments semblent indiquer qu ils dérivent de précurseurs simples brins. Les pirnas sont exprimés dans les lignées germinales. Ils se lient à une famille d Ago ne pouvant lier que les pirnas, au nombre de quatre dans le génome humain, et différent du complexe AgosiRNAs ou Ago-miRNAs. Au travers des pirisc, les pirnas servent à la mise en silence d éléments transposables afin de préserver l intégrité du génome et éviter la prolifération des transposons dans les cellules germinales (pour revue (Malone and Hannon, 2009)). 28

INTRODUCTION II- Mode de synthèse et régulations de l expression des mirnas II-1- Localisation génomique des transcrits contenant les mirnas Le clonage extensif des mirnas ainsi que leur positionnement sur divers génomes étudiés, en particulier chez l homme, nous révèlent que les unités géniques contenant les mirnas se situent soit dans des régions intergéniques indépendantes (figure 4A, cas n 1) soit dans des unités géniques codant des pré-arnm (figure 4A, cas n 2). Dans les deux cas, les mirnas peuvent se regrouper sur certains transcrits primaires en «cluster» de pré-mirnas, suggérant pour ces derniers une possible unité transcriptionnelle polycistronique (figure 4A). En général, les mirnas issus de polycistrons ont une expression similaire (Liang et al., 2007; Ozsolak et al., 2008), mais des stratégies peuvent exister pour découpler l expression des mirnas d un même «cluster» (Sun et al., 2009). Une estimation faite via la base de données mirbase (706 pré-mirnas sur le génome humain, en avril 2009), suggère qu il y aurait autant de mirnas dans des gènes codant des protéines que dans des unités géniques indépendantes chez l homme (341 dans des introns et/ou exons alors que 365 sur 706 sont dans des unités géniques indépendantes ; données personnelles et (Saini et al., 2008)). Chez Drosophila melanogaster 65% (99 sur 152) seraient dans des unités géniques indépendantes (données personnelles, mirbase). Il est à noter que chez les plantes, la majorité des mirnas seraient dans des unités géniques indépendantes (Shabalina and Koonin, 2008). Un faible pourcentage des mirnas situés dans des unités géniques indépendantes se retrouve dans une orientation antisens par rapport à un gène codant une protéine (14% pour la drosophile, 13% pour l homme et aucun pour Arabidopsis). Parmi ces mirnas, quelques uns peuvent être retrouvés en antisens d un exon d un gène et pourraient dégrader l ARNm par effet sirna (figure 4B). Par exemple, il a été montré que mir-136 et mir-127 étant orientés en antisens du rétrotransposon Rtl1 entraînent le clivage de l ARN de ce dernier (Seitz et al., 2003). Il en serait de même pour mir-220a et LOC402422, mir-220b et TUBB4, mir-662 et MSLNL, mir-1538 et NFAT5, ou encore mir-1184 et F8A1 (données personnelles). Chez l homme, parmi les mirnas situés dans des unités géniques codant des protéines, 88% des mirnas seraient dans des introns, 10% dans des exons (dont 12% dans les régions 5 non traduites (5 NTR), 52% dans les cadres de lecture ouvertes (ORF : Open 29