T BTK AT de biotechnologies Contrôles des traitements thermiques du lait L objectif de la séance est de réaliser une pasteurisation du lait avec différents protocoles de chauffage. Au cours du chauffage des prélèvements seront réalisés à différents temps pour suivre l efficacité du traitement. On réalisera : -un contrôle direct de la pasteurisation, par numération des germes totaux au cours du temps. à la fin de la pasteurisation, on étudiera la cinétique de décroissance des germes afin de proposer un barème de pasteurisation temps / température efficace pour chaque protocole. -un contrôle indirect de la pasteurisation : La phosphatase alcaline est une enzyme naturellement présente dans le lait non thermisé. Lorsque le lait est chauffé suffisamment, la phosphatase alcaline est progressivement dénaturée, donc devient inactive. En conséquence, si la pasteurisation d un lait a été réalisée correctement, on ne doit donc pas pouvoir mesurer dans ce lait une activité PAL significative. La détermination de l activité phosphatasique permet donc indirectement de savoir si la pasteurisation a été réalisée correctement. I-Contrôle direct de la pasteurisation d un lait cru 1-Réalisation de la pasteurisation (jour 1) On dispose d un lait cru dont la contamination bactérienne est estimée à environ 10 6 bactéries / ml. On réalisera 3 essais de pasteurisation : -50 C / 30 min (quadrinôme 1), -60 C / 30 min (quadrinôme 2), -70 C / 30 min (quadrinôme 3). La pasteurisation sera réalisée en incubant un flacon en verre à large ouverture contenant 50 ml de lait à traiter dans un bain Marie préalablement réglé à la température de l étude. Mode opératoire : Lorsque la température est correctement réglée dans le bain Marie : Par quadrinôme : -introduire le flacon de lait à pasteuriser, et laisser pré-incuber maximum 1 minute, -déclencher le chronomètre à t=0, Puis pour chaque binôme : -en condition aseptique, réaliser immédiatement à t=0, un premier prélèvement de lait de 1 ml, qui sera immédiatement introduit dans un tube d eau physiologique stérile de 9 ml. ce tube représente la première dilution décimale du lait traité. Documents de travail Lycée Senghor Evreux - http://biotech.spip.ac-rouen.fr 1
-d autres prélèvements seront à réaliser et traiter de la même façon au différents temps de l étude (t=10 min, 20 min et 30 min) : en condition aseptique, réaliser le prélèvement de lait de 1 ml, qui sera immédiatement introduit dans un tube d eau physiologique stérile de 9 ml. A t=30 min, un prélèvement supplémentaire de 3 ml sera à réaliser : le prélèvement sera immédiatement placé dans un tube à hémolyse conservé au froid dans l attente de réaliser le contrôle de l activité phosphatasique (voir suite au II). 2-Etude cinétique de la décroissance bactérienne (jour 1) Pour chaque prélèvement (t=0, 10, 20 et 30 min), à partir de la première dilution décimale du lait, réaliser le nombre de dilutions décimales nécessaires pour permettre le dénombrement des germes en masse en gélose nutritive. II-Contrôle indirect de la pasteurisation d un lait cru 1-Principe de la méthode de détermination La détermination de l activité phosphatasique du lait est réalisée selon la norme européenne AFNOR ISO 3356:2009. On fait agir le lait traité sur un substrat synthétique, le phénylphosphate, en respectant les conditions permettant une mesure d activité : - concentration en substrat saturante permettant d obtenir une Vi m, - ph et température constant, et proche de l optimum (ph 10 et 37 C). La réaction d hydrolyse du phénylphosphate catalysée par la PAL est la suivante : Phénylphosphate + H 2 O Phénol + phosphate La réaction évolue pendant 1 heure, puis on l interrompt par dénaturation thermique. On mesure ensuite la quantité de phénol libéré au cours du temps. Cette méthode deux points est nécessaire car le phénol n ayant pas de propriétés spectrales particulières, on ne peut pas suivre en continu la réaction. Après arrêt de la réaction on ajoute un réactif de coloration (réactif de Gibbs) permettant la formation d un complexe coloré à partir du phénol. L absorbance du complexe coloré, qui est proportionnelle à la quantité de phénol, est mesurée à 610 nm. Les essais seront comparés à une gamme d étalonnage de phénol et l activité sera exprimée en µg de phénol libéré par heure et par g de lait (à ph 10 et à 37 C). 2-Mode opératoire 2.1-Détermination de l'activité PAL par méthode deux points (jour 1) Remarque : Les essais sur seront réalisés à l aide du prélèvement supplémentaire de 3 ml réalisé précédemment à t = 30 min de chauffage. Documents de travail Lycée Senghor Evreux - http://biotech.spip.ac-rouen.fr 2
Dans une série de tubes à essais plastiques, introduire : Tubes Essai 1 Essai 2 Témoin 1 Témoin 2 Lait traité (après 30 min de pasteurisation) (ml) 1 1 - - Lait non traité (sans pasteurisation) (ml) - - 1 - Lait UHT (ml) - - - 1 Phénylphosphate à 1 g/l (ml) tamponné à ph 10 et préincubé à 37 C 10 Homogénéiser et incuber au bain Marie à 37 C pendant 1 heure exactement en homogénéisant régulièrement. Arrêter la réaction en portant les tubes à 100 C pendant 2 minutes environ. Refroidir sous un filet d eau froide. Remarque : chaque membre d un binôme réalisera un essai et un témoin au choix. 2-Défécation des échantillons de lait (jour 1) La couleur du lait rend les tubes opaques et empêche d y mesurer une absorbance. Cette opacité provient de protéines lactiques (caséines) et d émulsions de matières grasses. On élimine ces composés parasites par défécation Pour cela, ajouter dans les tubes 1 ml de solution défécante. Homogénéiser le précipité obtenu puis filtrer. Les filtrats seront collectés dans des flacons de 40 ml annotés et conservés au froid en attente du dosage colorimétrique en jour 2. Remarques sur la sécurité biologique : Le lait testé est contaminé : il est donc nécessaire d éliminer dans une poubelle DASRI le matériel jetable en contact avec le lait (tubes plastiques, filtre ). Le matériel non jetable devra être placé dans un sac à autoclave en prévision d une décontamination à l autoclave (entonnoirs). 3-Dosage du phénol apparu dans les mélanges réactionnels (jour 2) Dans une série de 4 tubes, introduire : - 5 ml de filtrat (essai 1, essai 2, témoin 1, témoin 2) - 5 ml de solution de métaborate de sodium - 0,04 ml de réactif de Gibbs Homogénéiser et laisser la coloration se développer 30 minutes à l'obscurité. Lire l'absorbance à 610 nm. Documents de travail Lycée Senghor Evreux - http://biotech.spip.ac-rouen.fr 3
4-Gamme d'étalonnage (jour 2) -A l aide d une fiole de 50 ml réaliser une dilution au 1/10 d une solution de métaborate de sodium. -Prévoir une gamme étalon comprenant des quantités de phénol allant de 0 à 20 µg : Tubes 0 1 2 3 4 5 Solution étalon de phénol à 20 mg/l soit 0,002 % (ml) Solution de sulfate de cuivre (ml) 1 Solution de métaborate au 1/10 (ml) 5 Eau distillée qsp 10 ml Réactif de Gibbs (ml) 0,04 Quantité de phénol par tube (µg) Laisser la coloration se développer 30 minutes à l'obscurité Réflexion préliminaire Q1. Prévoir les dilutions décimales à réaliser en jour 1 pour l étude de la cinétique de décroissance bactérienne. Q2. Expliquer le rôle des témoins 1 et 2. Q3. Proposer une solution technique permettant de réaliser l incubation correctement, sachant que chacun des 4 tubes (essai 1, essai 2, témoin 1, témoin 2) devra avoir une durée d incubation de 1 heure exactement, Q4. Expliquer le choix des valeurs 37 et 100 C pour le protocole de détermination d activité. Q5. Compléter le tableau de gamme d étalonnage. A l aide du document n 1 : Q6. Proposer les moyens de protection individuels et collectifs éventuellement nécessaires pour la manipulation du phénol. Exploitation Contrôle direct de la pasteurisation Q7. Proposer un tableau de résultats du dénombrement pour chaque temps testé et pour chaque dilution. Q8. Calculer la concentration bactérienne / ml de lait pour chaque temps testé. Q9. Mutualiser les résultats dans le tableau de synthèse proposé dans le document n 2. A l aide du document n 3 : Q10. Tracer la courbe cinétique de destruction thermique des bactéries UFC/mL = f(t) pour chaque protocole de pasteurisation testé dans la salle (les tracés seront superposés sur le même graphique). Documents de travail Lycée Senghor Evreux - http://biotech.spip.ac-rouen.fr 4
Q11. Déterminer graphiquement le temps de réduction décimale pour chaque protocole de pasteurisation. Quel protocole semble être le plus efficace? Contrôle indirect de la pasteurisation Q12. Tracer la courbe d étalonnage A à 610 nm en fonction de la quantité de phénol en µg dans les tubes de gamme (tableur à disposition), puis lire les valeurs de m phénol obtenues pour les témoins et les essais. Q13. Imprimer le graphe. A l aide des documents n 4 et 5 : Q14. Exploiter les résultats issus du témoin 2 afin de calculer pour chaque essai et pour le témoin 1, la masse de phénol apparue dans le tube de coloration suite à la seule action de la phosphatase alcaline. Q15. Déterminer l équation aux grandeurs permettant de calculer l activité phosphatasique dans le MR en µg de phénol libéré par heure pour 1 g de lait (on considérera 1g de lait = 1 ml de lait). Q16. Calculer l activité phosphatasique du lait non traité et du lait traité. Conclure sur l efficacité du protocole de pasteurisation étudié. Synthèse Q17. A l aide de l ensemble des résultats obtenus, argumenter afin de proposer un barème de pasteurisation (temps / température) permettant de traiter efficacement le lait. Documents de travail Lycée Senghor Evreux - http://biotech.spip.ac-rouen.fr 5
Document 1 : Extrait de la fiche toxicologique INRS du phénol Document 2 : Résultats obtenus pour les différents protocoles de pasteurisation Temps d exposition (min) 0 10 20 30 Concentration bactérienne réelle (UFC/mL) à 45 C Concentration bactérienne réelle (UFC/mL) à 55 C Concentration bactérienne réelle (UFC/mL) à 65 C Documents de travail Lycée Senghor Evreux - http://biotech.spip.ac-rouen.fr 6
Document 3 : Notions théoriques sur la cinétique de destruction thermique des microorganismes (source : Opération unitaires, 2-La pasteurisation P.Chillet CNDP) Documents de travail Lycée Senghor Evreux - http://biotech.spip.ac-rouen.fr 7
Document 4 : Extrait de la norme AFNOR ISO 3356:2009 pour un lait convenablement pasteurisé, l'activité phosphatasique doit être inférieure à une masse de 4 µg de phénol libéré / h / par g de lait à ph=10 et 37 C. Afin de vérifier que cette masse de phénol provient bien de la catalyse enzymatique par la phosphatase alcaline, il est nécessaire de vérifier l évolution spontanée de la réaction non catalysée afin de retrancher éventuellement la masse de phénol qui apparaitrait spontanément sans lien avec l action enzymatique Document 5 : Notions théoriques sur les déterminations d activités enzymatiques 1-La notion d activité enzymatique Définition : l activité d une enzyme est la quantité de substrat qu elle peut transformer par unité de temps dans des conditions opératoires précises : lorsque la concentration en substrat est saturante, ph et t C constants, non dénaturants et si possible optimum. Une activité s exprime en nombre de moles de substrat transformé par unité de temps : Activité de l enzyme dans MR = n S transformé dans le MR / unité de temps 2-Expressions dérivées de l activité enzymatique Même si par définition une activité enzymatique s exprime à l aide d un nombre de moles de substrat transformé, il n est pas toujours possible d avoir recours à cette valeur. En effet, on mesure parfois l apparition d un produit : Activité de l enzyme dans MR = n P apparu dans le MR / unité de temps L activité peut également être exprimée à partir de grandeur dérivant du nombre de moles de substrat ou de produit : masse ou concentration de substrat ou produit Exemple : Activité de l enzyme dans MR = m P apparu dans le MR / unité de temps Lors de déterminations d activités enzymatiques, on a recours parfois à des méthodes deux points : le MR subit dans ce cas l ajout éventuel de réactifs complémentaires (réactifs d arrêt, diluants, réactifs de coloration ) qui entraine une dilution. Le calcul d activité devra alors être corrigé par ce facteur de dilution de façon à exprimer l activité enzymatique dans le MR. Documents de travail Lycée Senghor Evreux - http://biotech.spip.ac-rouen.fr 8