1 TD-ED DCEM 1 Bactériologie B. Berçot, C. Branger Propriété de la Faculté de Médecine Université Paris 7-Denis Diderot Démarche du diagnostic bactériologique II. COMMENT FAIT-ON LE DIAGNOSTIC D'UNE INFECTION BACTERIENNE? Le diagnostic bactériologique est un ensemble de moyens permettant de confirmer telle ou telle étiologie infectieuse d'origine bactérienne. Ces moyens diagnostiques sont variés et caractérisent soit le diagnostic direct soit celui indirect : DIAGNOSTIC DIRECT : mise en évidence de la bactérie elle-même, donc finalement de sa culture ou isolement qui permettra l'identification ultérieure ainsi que de préciser sa sensibilité aux antibiotiques (antibiogramme). Ceci n est pas toujours possible soit : - L agent a disparu avant ou peu après l apparition des symptômes (ex : Rhumatisme articulaire aigu, brucellose) ou a la suite d un traitement antibiotique trop hâtif. - La bactérie de culture impossible, ex : agent de la syphilis (tréponème) - La bactérie est de culture très lente ou nécessite des milieux de culture spéciaux. Isolement fait par des laboratoires spécialisés (ex : agent de pneumopathie atypiques : chlamydiae, mycoplasmes). On a donc recourt à d'autres moyens de diagnostic direct : recherche d Ag bactérien ou mise en évidence de séquences d'adn spécifiques de bactéries. DIAGNOSTIC INDIRECT : mise en évidence de la réponse de l'organisme à l'infection par la présence d'anticorps spécifiques, le plus souvent sériques ou plus rarement par une réponse d hypersensibilité, dite allergique. RETENIR : Le diagnostic direct est le seul diagnostic de certitude, car il permet la mise en évidence de la bactérie elle-même, donc finalement sa culture ou isolement qui permettra l'identification ultérieure mais aussi de préciser sa sensibilité aux antibiotiques (antibiogramme).
2 DEMARCHE DIAGNOSTIQUE BACTERIOLOGIQUE DIRECT (cf.poly) PRELEVEMENT Site Mode Transport EXAMEN BACTERIOLOGIQUE JO Aspect macroscopique Examen microscopique - cytologie appréciation de la présence de polynucléaires - coloration mise en évidence de la présence de bactéries Diagnostic moléculaire direct : PCR, sonde Mise en culture : choix des milieux de culture spécifiques incubation * température * atmosphère * durée J1 Résultats des cultures - si culture positive identification antibiogramme - si culture négative prolongation de l'incubation Résultats de l'identification et de l'antibiogramme J2 Typage selon indication : sérotype, technique moléculaire
3 1/ LE PRELEVEMENT : 1ERE ETAPE DU DIAGNOSTIC Les résultats des examens bactériologiques dépendent pour une grande part des conditions de prélèvements et de transport. VARIE SELON LE SIEGE DE L INFECTION ET LE GERME QUE L ON COMPTE ISOLER Méningite Diarrhée Infection urinaire Pneumonie PL (LCR) + hémoculture (sang) Coproculture (selles) ECBU expectoration ou prélèvement bronchique + hémocultures DOIT ETRE EFFECTUE AVEC DU MATERIEL STERILE A USAGE UNIQUE (RECIPIENT STERILE OU ECOUVILLON) EN RESPECTANT LES REGLES D ASEPSIE ELEMENTAIRES : Toute contamination du produit peut entraîner des causes d erreur dans l interprétation du résultat. Contamination par les flores : Penser que la peau, les muqueuses, les cavités naturelles oropharyngées, digestives, vaginales sont le siège d une flore commensale (cf. poly et cours sur flore commensale) qui vont contaminer le prélèvement. (ex de la gélose ensemencée avec gorge) ex : urines Contaminations par l environnement : Penser que dans l environnement il y a des bactéries et spores (eau, terre, poussière) ex : gélose ouverte en début de cours DOIT ETRE EFFECTUE AU MOMENT OPPORTUN : - Précocement - Avant toute antibiothérapie. DOIT ETRE TRANSPORTE RAPIDEMENT ENSEMENCEMENT RAPIDE Certains germes ne résistent pas ou se multiplient
4 2/ L EXAMEN BACTERIOLOGIQUE A J0 Infection bactérienne la présence de bactéries de signes biologiques liés à l'inflammation : leucocytes polynucléaires 2.1. ETUDE MACROSCOPIQUE DU PRELEVEMENT : o Trouble : urine, LCR, liquide pleural ou articulaire o Hématurique : urine, LCR, liquide ou autre coloration anormale pleural ou articulaire o Odeur : on notera celle caractéristique lors d'infections à germes anaérobies stricts dans un liquide pleural o Consistance : Exemple d'une selle diarrhéique 2.2 ETUDE MICROSCOPIQUE DU PRELEVEMENT aucune anomalie macroscopique visible nécessité de rechercher des bactéries et des éléments cellulaires de type polynucléaire au microscope optique ETAT FRAIS : 1. compte des cellules en Malassez (microscope optique X40) 2. visualisation de la mobilité des bactéries (microscope optique X40)
5 COLORATION DE GRAM : microscope optique à immersion (X100) Coloration basée sur la perméabilité de la paroi des bactéries à l alcool. - 1 er temps : cristal violet + lugol complexe colorant soluble dans l alcool qui colore en violet le cytoplasme de toutes les bactéries. - 2 e temps : décoloration par l alcool l alcool traverse la paroi des bactéries dites à Gram négatif et dissout le complexe colorant (bactéries décolorées). bactéries à Gram positif : la paroi ne se laisse pas traverser par l alcool (bactéries restent colorées en violet): bactéries dites à Gram positif. - 3 e temps : contre coloration par de la fushine (rose) : les bactéries décolorées apparaissent rose on les dit à Gram négatif. Retenir : La coloration de Gram ne permet pas une identification mais une orientation (17-19) Renseigne sur la présence (ou absence) de bactéries leur forme (cocci ou bacille, cocobacille, fusiforme) leur groupement (amas, chaînettes, diplocoques) leur gram (+ ou -) voir tableau à la fin du poly très utile car oriente l antibiothérapie. Ex : Pus : orientation vers un Staphylocoque. Leucocytes Coccis à Gram positif en amas Hématies Ex : Méningite : orientation vers un méningocoque : atb approprié. Diplocoques à Gram négatif
6 AUTRES COLORATIONS (certaines bactéries ne se colorent pas avec la coloration de Gram) Ziehl-Neelsen pour les mycobactéries : coloration des bacilles acidoalcoolo-résistants 2.3/ AUTRES METHODES UTILISEES : en développement+++ Recherche du pathogène dans le prélèvement (on détecte une de ses caractéristiques) * Méthodes immunologiques Ex : Détection de l antigène soluble pneumococcique dans le LCR rapide 30min (méthode immunochromatographique sur membrane) écouvillon spécifique Echantillon de Contrôle 15 min négatif LCR membrane revêtue d Ac de lapin spécifique de l Ag soluble de S. pneumoniae positif * Méthodes moléculaires PCR : décrite en 1983 par Kary Mullis L amplification génique multiplie de manière exponentielle un ADN cible ADN (pg) 10-12 1 copie non détectable ADN (µg) 10-6 1 milliard de copies détectable 2 (cycles)
La PCR (réaction de polymération en chaine) - multiplie spécifiquement l ADN cible - le nombre de copies croît de manière exponentielle avec le nombre de réplications effectuées (30 à 35 cycles) 7 Applications : bactéries non cultivables bactéries de culture lente et difficile détection rapide en urgence d un pathogène amélioration de délai diagnostic (mycobactéries) Inconvénient : encore cher en bactériologie et pas développé pour l ensemble des applications. 2.4/ LA MISE EN CULTURE DU PRELEVEMENT : Retenir : La culture est l examen principal, reste la référence en bactériologie, nécessite au minimum 24h, couramment quelques jours parfois 3 mois. Le prélèvement est ensemencé sur différents milieux choisis en fonction du pathogène recherché : Simples Enrichis bactéries exigeantes ex : méningocoque Sélectifs bactérie à isoler au sein d une flore commensale Isolement des bactéries : milieux solides étalement et isolement en stries (voir poly) pour étaler les bactéries et les isoler les unes des autres. les bactéries se multiplient et donne une colonie visible à l œil nu au bout de 18 à 24h ou plus. 1 2 3 4 Etuve à 37 C Atmosphère : aérobie, anaérobie, CO2 Colonies isolées
8 2.5/ SYNTHESE POUR LE CLINICIEN : Retenir : signes inflammation+détection bactérie+tests diagnostic rapide permettent une orientation clinique Mise en place d une antibiothérapie probabiliste 3/ L EXAMEN BACTERIOLOGIQUE A J1 J1 (à J5) Lecture des milieux de culture L isolement sur milieu solide permet d obtenir des colonies séparées. 3.1 IDENTIFICATION D UN PATHOGENE : L interprétation d une culture positive se fait en fonction du site de prélèvement et du contexte clinique. Responsabilité du bactériologiste distinguer un pathogène au sein d un flore incriminer une bactérie dite commensale comme responsable de l infection (terrain particulier) Quantification du pathogène ex : urines 3.2 IDENTIFICATION DE LA BACTERIE RESPONSABLE DE L INFECTION Orientation diagnostic : - Coloration de Gram sur une ou des colonies (confirme ex direct) : forme, groupement coloration + ou - présence d une capsule ou non, de spore. - Aspect des colonies en culture : grosses petites, muqueuses, sèches, hémolyse sur gélose au sang, pigmentation odeur particulière caractères culturaux (pousse en atmosphère anaérobie, sous CO 2 ) sur milieu enrichi uniquement. - Tests biochimiques simples sur les colonies : Les bactéries possèdent un équipement enzymatique que l on utilise pour les identifier Ex : certaines bactéries possèdent une catalase d autre non : enzyme qui décompose l H2O2 en H2O et oxygène libre (une goutte de H2O2 + une colonie = apparition de bulles). Ex p 17
9 - Mise en évidence de constituants antigéniques : avec des sérums spécifiques dirigés contre la paroi Ex : méningocoque (type C, virulent) But de cette première analyse résultat au clinicien, permet d orienter l étiologie de l infection et le traitement. Galerie d identification : Evolution avec les années mais reste la référence Pourrait être progressivement remplacé par des identifications génomiques Contient des tests plus lents (résultat en 4h à 24h) basés sur l étude de la fermentation de sucres et des caractères enzymatiques. Une colonie Inoculation des cupules incubation
10 3.3 REALISATION D UN ANTIBIOGRAMME But : Tester la bactérie vis a vis d un panel d antibiotiques pour déterminer les sensibilités aux antibiotiques à partir d une colonie, résultat en 4h à 24h. Méthode manuelle la plus utilisée : méthode de diffusion en gélose inoculum 106 bactéries /ml gélose standardisée (Mueller Hinton) disque de papier (antibiotique) Avantages : Simple, compatible avec routine, test de nombreux antibiotiques sur une seule boite de gélose Une colonie suspension 10 ml H2O bactérienne inoculer gélose 1 2 3 4 Incubation étuve Dépôt des disques imprégnés d antibiotiques
11 4/ L examen bactériologique à J2 Retenir : Résultats de l identification et de l antibiogramme en un minimum de 48 h Intérêt de l utilisation de tests rapides d identification et l utilisation d antibiothérapie probabiliste dans les infections graves à pronostic vital 4.1 Lecture des galeries d identification Notification des réactions positives et négatives Code d identification Banques de données Nom de la bactérie NB : Il suffit d intégrer cette démarche pour identifier la plupart des pathogènes. Même logique pour l identification à partir à d autres critères (ADN)
12 4.2 Lecture de l antibiogramme Après une incubation à 37 C, le diamètre d inhibition de l antibiotique entourant les disques permet de calculer la CMI de l antibiotique pour la souche examinée en rapportant ce diamètre à une courbe de concordance. Culture au contact du disque Diamètre d inhibition (absence de culture autour du disque) diamètre (en mm) 30 --- pénicilline G Diamètre observé 20 10 0 0.25 c CMI calculée 16 C CMI(en mg/l) Courbe de concordance
L intérêt de l antibiogramme est de permettre de comparer la CMI d un antibiotique donné à celle de 2 concentrations critiques c et C proposées par le comité d expert du Comité de l Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie. Ces 2 concentrations permettent de catégoriser la souche à étudier en S, R ou I en confrontant la CMI d un antibiotique donné à celle de c et C. 13 4.3/ Retour des résultats aux cliniciens Liaison clinique : essentielle Renseignements cliniques : indispensables pour orienter les recherches bactériologiques. Car dans le laboratoire, il n existe pas une méthode seule qui permette d isoler tous les germes (voir généralités du cours). Retour des résultats au clinicien réorientation diagnostic et thérapeutique A 48h : Rediscutions de l antibiothérapie probabiliste Références http://www.microbes-edu.com
14 DEMARCHE DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE INDIRECT But : Détection d anticorps spécifiques d une pathologie donnée Diagnostic d infection bactérienne pourra se faire par l ascension des Ac dirigés contre la bactérie. Classiquement la production d'igm caractérise une infection primaire (ne persistent pas). Indications : le diagnostic d infection due à une bactérie de croissance difficile ou impossible (Syphilis, rickettsiose, leptospirose, maladie de lyme ) Tester 2 sérums à 15 jours d intervalle. Interprétation peut être délicate en raison de : - Infection antérieure cicatrices sérologiques - Vaccination - Réaction croisée avec antigènes voisins d une autre bactérie : fausse positivité Sérodiagnostic est tardif ne peut se substituer au diagnostic direct : méthode complémentaire