TP DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE
1 - DIAGNOSTIC DIRECT : le virus ou un de ses constituants Virus: Microscopie électronique Antigène viral : - immunofluorescence - immunochromatographie - ELISa en plaque ADN ou ARN : - PCR (point final, temps réel ) - séquençage 2 - DIAGNOSTIC INDIRECT : la réponse immunitaire dosage des anticorps dirigés contre le virus - ELISA - Western Blot - Fixation du Complément - mesure de l avidité des IgG
DIAGNOSTIC DIRECT Prélèvements sur milieu de transport LBA Urines Liquide amniotique Sécrétions naso-pharyngées Ecouvillon nasal
Diagnostic direct : Immunofluorescence sur lame
Diagnostic direct : Immunofluorescence VRS Parainfluenza 1 Grippe A HSV
Diagnostic direct : immuno-chromatographie
Cultures de virus
Cultures de virus Isolement du virus sur culture cellulaire Rappel : virus = parasites intracellulaires obligatoiresne peuvent se multiplier que dans des cellules vivantes 3 systèmes possibles : cellules en culture (le seul utilisé en pratique courante) animal de laboratoire œuf de poule embryonné Recherche, études épidémiologiques Techniques longues, fastidieuses mais reste le procédé de choix pour : établir le diagnostic étiologique de certaines infections virales prouver le caractère infectieux des virus isolés étudier la résistance phénotypique aux antiviraux disponibles réaliser des surveillances épidémiologiques
Culture virale Lignée cellulaire : MRC-5 fibroblastes embryonnaires humains de poumon Culture classique et immunocytochimie Incubation 15 jours
Cultures de virus
Diagnostic direct Isolement du virus sur culture cellulaire : en pratique HSV 24-48 h Observation d un effet cytopathogène (ECP) Aspect caractéristique de l ECP Type de cellules utilisées Temps d apparition de l ECP CMV VZV Enterovirus cultivables ECHO, Coxsackies B, polio Rhinovirus Adénovirus VRS Grippe Parainfluenza Métapneumo virus 3j à 3 semaines 5-6 j 2j à 8j (2ème passage) 7 à 10j 5-7 j 2 à 7j 7 j 7 à 10j 4 semaines?
Effet Cyto-pathogène (ECP) CMV Grippe A VRS HSV
Effets cytopathogènes Stade plus avancé ECP: apparait rapidement(2-4 jours) en MRC5 HSV: formation de grosses cellules arrondies souvent groupées initialement en foyers (grappe de raisin) puis envahissant toute la nappe cellulaire foyers lytiques de cellules ballonnisées Actualité de la culture cellulaire et de son application au diagnostic des infections virales Virologie. Volume 8, Numéro 4, 297-309, juillet-août 2004, revue
Effets cytopathogènes Le virus varicelle zona induit en MRC5 l apparition de cellules irrégulières, toujours disposées en foyer, sous forme de plages granuleuses. Actualité de la culture cellulaire et de son application au diagnostic des infections virales Virologie. Volume 8, Numéro 4, 297-309, juillet-août 2004, revue
Effets cytopathogènes Le cytomégalovirus donne des foyersde grandes cellules réfringentessans lyse, disposées en «bancs de poisson» Trame cellulaire conservée Actualité de la culture cellulaire et de son application au diagnostic des infections virales Virologie. Volume 8, Numéro 4, 297-309, juillet-août 2004, revue
Effets cytopathogènes Grandes cellules ovalaires réfringentes, clairsemées «bancs de poisson» Stade plus évolué : tapis en dentelle Actualité de la culture cellulaire et de son application au diagnostic des infections virales Virologie. Volume 8, Numéro 4, 297-309, juillet-août 2004, revue
Effets cytopathogènes ENTEROVIRUS Cellules arrondies, diminuées de taille. Lyse rapide et complète du tapis cellulaire
Effets cytopathogènes VRS Effet cytopathogène du virus VRS (Virus Respiratoire Syncytial) MICHEL (E.) ET COLLABORATEURS Revue Méd. Vét., 2010, 161, 4, 157-161
Recherche d antigènes précoces ex : CMV Détection rapide du CMV en culture de fibroblastes humains avant l ECP, par peroxydase : immunocytochimie Principe : localisation d antigènes dans des tissus, cellules ou organites cellulaires par utilisation d Ac spécifiques dirigés contre l Ag à détecter, et couplés à des enzymes Noyaux des cellules infectées colorés en brun rouge
Immunocytochimie Grippe VRS CMV Adénovirus
Diagnostic direct : détection d ADN ou d ARN PCR (Polymerase Chain Reaction)
PCR en temps réel
Séquençage : analyse de la composition du génome
Diagnostic indirect Sérologie ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
Western-Blot Application au VIH
Virus de l immunodéficience humaine VIH Outils du diagnostic de l infection VIH Diagnostic sérologique Direct ou indirect Mise en évidence des anticorps anti-vih et/ou de l antigène p24 Tests de dépistage ELISA ou tests diagnostiques rapides (TDR) Tests de confirmation Western Blot ou ImmunoBlot Diagnostic moléculaire Mise en évidence des acides nucléiques par PCR ARN viral plasmatique (CV HIV) quantitative ADN proviral (ST/PBMCs/CG) qualitative ou quantitative Culture virale Isolement par co-culture à partir des cellules mononuclées du sang périphérique
Évolution des marqueurs virologiques du VIH après contamination, sans traitement Apparition des anticorps 21 jours après la contamination et western-blot sensible au 28 ème jour
Virus de l immunodéficience humaine VIH Diagnostic de l infection VIH Chez l adulte et l enfant > 18 mois Diagnostic sérologique + moléculaire + culture (en cas de suspicion de primo-infection ou variants particuliers) Chez le nouveau-né et le nourrisson < 18 mois Diagnostic moléculaire (+++ détection de l ADN proviral) + culture (variants particuliers)
Dépistage : Western-blot: place dans le diagnostic du VIH Diagnostic biologique d une infection par le virus de l'immunodéficience humaine Technique ELISA de détection combinée des anticorps anti-vih 1 et 2 et de l'antigène p24 du VIH 1 Si dépistage positifwestern blot : WB positif = confirmation et differentiation infection à VIH 1 et 2 WB négatif ou douteuxantigène p24 et recherche de l ARN du VIH possible
Western-blot: principe Test de confirmation du VIH Détection d'anticorps humains anti-vih, dirigés spécifiquement contre des protéines du virus, dans le sérum du malade
Schématisation des western-blot VIH-1 et VIH-2 Précurseur des gp d env Critères de positivité des WB VIH Précurseur de protéines GAG TI intégrase Protéine de matrice TI Protéine de capside OMS : HIV-1 : 2 bandes ENV ANAES 2000 : HIV-1 : 2 bandes ENV + 1 GAG ou 1 POL
Profils de WB VIH-1 en fonction du stade de la maladie Début de séroconversion Evolution de la maladie D'après Cours IMEA 2010 Pr françois Simon
Organisation de la séance de TP Installation par groupe de 3 personnes 5 minutes Présentation: 20 minutes Observation des ECP/ ICC Préparation de cas (1/groupe) Quizz: Reconnaissance mystère Présentation des cas 45 minutes Nettoyage des paillasses Rangement salle Remise des comptes-rendus (1/ groupe) 5 minutes
Cas cliniques western-blot VIH
Cas 1 C-F Homme, 44 ans Urgences: Détresse respiratoire avec tableau de SDRA dans un contexte de syndrome grippal depuis 15 jours Scanner: -Atteinte parenchymateuse pulmonaire diffuse essentiellement à type de verre dépoli et kystes pulmonaires Transfert en réanimation pour poursuite de prise en charge: -Sérologie VIH dépistage positive Test combiné = 235 (seuil de positivité >1) -Diagnostic de pneumocystose sur le LBA Test de confirmation (ci-contre) CD4 = 92/µL (VN:530-1300/µL) % CD4 = 7% (VN:31-52%) CD4/CD8 = 0,08 (VN: 1,10 2,90) VIH-2 T+ fort T+ faible Témoin neg Patient
Cas 1 C-F (suite) 1/ Le patient est-il infecté? Si oui, à quelle stade? 2/Quel bilan complémentaire demandez-vous au laboratoire de Virologie dans ce contexte? VIH-2 T+ fort T+ faible Témoin neg Patient
Cas 2 SMD Jeune, 23 ans Vient au Centre de Dépistage Anonyme et Gratuit (CDAG) Le 21/01/15 -Sérologie VIH dépistage positive Test combiné = 1,14 (seuil de positivité >1) -Test de confirmation (ci-contre) 1/ Le patient est il infecté? Si oui, à quelle stade? 2/Quel marqueur sérologique pourrait être utile dans ce cas? 3/Quelle est la conduite à tenir? VIH-2 T+ fort T+ faible Témoin neg Patient
Cas 2 (suite) Revient le 21/02/15 au CDAG Sérologie VIH dépistage positive: -Test combiné = 1,13 (seuil de positivité >1) Test de confirmation (ci-contre) 4/ Pourquoi avoir attendu 1 mois avant de refaire la sérologie? 5/ Quelle est votre conclusion? VIH-2 T+ fort T+ faible Témoin neg Patient
Cas 3 KM Femme, 32 ans Consulte le 24/02/15 Pour fièvre, éruption, angine -Sérologie VIH dépistage positive Test combiné = 3,65 (seuil de positivité >1) -Test de confirmation (ci-contre) 1/La patiente est-elle infectée? 2/Quel(s) marqueur(s) virologique(s) devezvous demander pour compléter le bilan? 3/Quel est votre hypothèse diagnostique dans le cas ou ces marqueurs se révèlent positifs? VIH-2 T+ fort T+ faible Témoin neg Patient
Cas 4 TI Nourrisson de 1 an né de mère infectée par le VIH-1 Test de dépistage combiné VIH = 7.5 Mère sous traitement antirétroviral avec un bon contrôle immuno-virologique Antériorités: -Recherche directe du VIH par biologie moléculaire négative à J7, M1, M3 et M6 1/Comment interprétez-vous ce bilan sérologique? 2/Qu apportent les recherches effectuées à J7, M1, M3 et M6? 3/Un prélèvement de contrôle est-il nécessaire? Si oui, sous quel délai? 4/ Quels sont les objectifs du traitement chez la mère? VIH-2 T+ fort T+ faible Témoin neg Patient
Cas 5 PJP Homme de 55 ans, bisexuel, consulte son médecin traitant pour une asthénie persistante. Sérologie VIH négative en 2002. Le 4/07/14: Sérologie VIH dépistage positive: -Test combiné = 1479 (seuil de positivité >1) Test de confirmation (ci-contre) 1/ Le patient est il infecté? Si oui, à quelle stade? 2/Quel bilan complémentaire demandez-vous au laboratoire de Virologie dans ce contexte? VIH-2 T+ fort T+ faible Témoin neg Patient
PM GENE Cas gp160 Env gp120 Env Date: Groupe: Noms: - - - p66 p55 p51 p39 gp41 Pol Gag Pol Gag Env Réponse p31 p24 p17 Pol Gag Gag