Dynamique d évolution de la flore microbienne dans les fromages

Dynamique d évolution de la flore microbienne dans les fromages Colloque Flores microbiennes d intérêt dans les Procédés Alimentaires et la Santé Christine Achilleos Dijon - 07 / 10 / 2014

Le fromage, un écosystème complexe levures ph nutriments sel disponibilité de l eau température moisissures bactéries substances antimicrobiennes potentiel redox Microbiote dans son environnement Christine Achilleos / Dynamique d évolution de la flore microbienne dans les fromages.02 Dijon - 07 / 10 / 2014

Une diversité en constante évolution Depuis le lait de cuve jusqu au fromage affiné Potentiel métabolique des micro-organismes Composition biochimique lait / fromage Processus technologique Conditions de fabrication d affinage Qualité des fromages sensorielle, santé, sanitaire Christine Achilleos / Dynamique d évolution de la flore microbienne dans les fromages.03 Dijon - 07 / 10 / 2014

Analyse du microbiote écosystème échantillon extraction des cellules Méthodes cultures-dépendantes Méthodes cultures-indépendantes milieux de culture extraction des acides nucléiques dénombrement isolats ADN ARN Qui fait quoi? Analyse phénotypique Analyse génotypique Qui est là? Identification / Diversité / Dynamique Amplification Hybridation Empreintes moléculaires Expression des gènes Activité métabolique Christine Achilleos / Dynamique d évolution de la flore microbienne dans les fromages.04 Dijon - 07 / 10 / 2014

Suivi dynamique de Lb.delbrueckii Les analyses Quantification avec 2 méthodes : Culture-dépendante : culture sur milieu sélectif, MRS 45 C 72h anaérobiose Culture-indépendante : PCR quantitative en temps réel (qpcr) 14 points d analyse différents répartis pendant toute la fabrication et l affinage 0,5 2 3 4 6 8 10 12 24 h 7 28 49 70 214 jours fabrication affinage.05

Suivi dynamique de Lb.delbrueckii Les fromages 24 fromages au lait cru de type pâte pressée cuite fabriqués à la fromagerie expérimentale de l unité à partir du même lait, sur 6 semaines consécutives 3 levains acidifiants : Lb.delbrueckii Lb.helveticus St.thermophilus 2 souches différentes : D0 / D1 / D2 H0 / H1 / H2 activités acidifiantes et protéolytiques 2 taux d inoculation : haut / bas 18 combinaisons.06

Lb.delbrueckii ensemencé Quantification avec 2 méthodes : culture sur milieu et qpcr 0,5 2 3 4 6 8 10 12 24 h fabrication 7 28 49 70 affinage 214 jours.07

Des cellules cultivables et non cultivables en phase de déclin mais aussi en phases exponentielle / ralentissement / stationnaire Pour 90 % des échantillons, les résultats culture sur milieu < qpcr 3 hypothèses non exclusives 1 Les cellules forment des chaînes 2 Les cellules contiennent plus d un génome 3 Les cellules sont actives mais non cultivables ou mortes mais non lysées.08

Pendant la fabrication en phases exponentielle / ralentissement / stationnaire La capacité à se diviser de certaines cellules de Lb.delbrueckii est limitée 1 Les cellules forment des chaînes 1 chaine (= plusieurs cellules) est comptée comme 1 cellule en culture sur milieu 2 Les cellules contiennent plus d un génome réplication d ADN indépendamment du clivage du corps cellulaire le septum ne se forme pas, 2 cellules filles ne se séparent pas À 2 h et 24 h on a observé de longs bacilles et pas de chaîne. La présence de longs bacilles Lb.delbrueckii, sans septum et plusieurs génomes, a été observée dans le lait lorsque la synthèse des purines est réprimée (Suzuki et al., 1986)..09

Pendant l affinage en phase de déclin 3 Les cellules sont actives mais non cultivables ou mortes mais non lysées culture qpcr d après.010

Dans la littérature La présence de cellules actives mais non cultivables en phase de déclin a été observée dans les fromages à pâte pressée cuite pour les lactobacilles thermophiles pour St.thermophilus.011

Lb.delbrueckii natif du lait Quantification avec 2 méthodes : culture sur milieu et qpcr Lb.delbrueckii ensemencé Lb.delbrueckii natif culture qpcr 0,5 2 3 4 6 8 10 12 24 h fabrication 7 28 49 70 affinage 214 jours.012

Exemple d interaction Effet du taux de St.thermophilus ensemencé et de la nature de la souche Lb.helveticus sur la croissance de D2 SbH2 ShH2 Interaction ShH2 (, ) sur D2 SbH2 ShH2 Effet négatif de la combinaison Sh (St.thermophilus ensemencés haut) et H2 (Lb.helveticus) sur la croissance de D2 dénombré sur milieu de culture. culture qpcr 0,5 2 3 4 6 8 10 12 24 h fabrication 7 28 49 70 affinage 214 jours.013

Un ADN parfois difficile à extraire Pour 10 % des échantillons, les résultats culture sur milieu > qpcr Nature de la souche : D1 (, ) et D2 (, ) D2 D1 D1 D2 D1 D2 culture qpcr D1 D2 0,5 2 3 4 6 8 10 12 24 h fabrication 7 28 49 70 affinage 214 jours Christine Achilleos / Dynamique d évolution de la flore microbienne dans les fromages.014 Dijon - 07 / 10 / 2014

selon la souche D1 (, ) et D2 (, ) D1 D2 D1 D2 D après la culture, à partir de 4h, D1 > D2 D après la qpcr, à partir de 2h, D2 > D1 Les écarts observés entre les résultats de qpcr et de culture sont supérieurs pour D2 culture qpcr Hypothèse : Pendant la fabrication, les cellules Lb. delbrueckii D1 sont plus difficiles à lyser au cours de l étape d extraction de l ADN 0,5 2 3 4 6 8 10 12 24 h fabrication Christine Achilleos / Dynamique d évolution de la flore microbienne dans les fromages.015 Dijon - 07 / 10 / 2014

et selon l état physiologique des cellules D après la culture, à partir de 1j, D1 > D2 D après la qpcr, à partir de 7j, D1 > D2 D1 (, ) et D2 (, ) culture qpcr D1 Hypothèses : 1) Au cours de l affinage, l état physiologique des cellules Lb. delbrueckii est modifié D1 est plus facile à lyser ou D2 est plus difficile à lyser par rapport à la fabrication D2 D1 D2 2) Au cours de l affinage, les cellules Lb. delbrueckii D2 se lysent dans la matrice fromagère (cellules non quantifiées) 7 28 49 70 affinage 214 jours Christine Achilleos / Dynamique d évolution de la flore microbienne dans les fromages.016 Dijon - 07 / 10 / 2014

CONCLUSIONS Les 2 méthodes utilisées pour quantifier Lb.delbrueckii, qpcr et culture sur milieu, donnent une image différente de la dynamique bactérienne pendant la fabrication et l affinage des fromages. Lorsque les 2 méthodes sont utilisées, la dynamique de Lb.delbrueckii peut être interprétée au plus juste. Depuis l étape de pressage jusqu en fin d affinage, Lb.delbrueckii, ensemencé ou natif du lait, est cultivable en partie. Lb.delbrueckii est présent sous forme cultivable et non-cultivable non seulement en phase de déclin mais également en phases exponentielle, ralentissement et stationnaire. L efficacité de la méthode d extraction de l ADN de Lb. delbrueckii à partir des échantillons de fromage varie selon l étape de fabrication (état physiologique) et selon la nature de la souche..017

Une méthode = une image Les biais propres à chaque méthode entrainent souvent la nécessité d en utiliser plusieurs afin d obtenir une vision globale et plus complète de la (ou des) population(s) étudiée(s). Culture sur milieu Impossibilité de dénombrer une population sous-dominante si une population dominante se développe sur le milieu Manque de spécificité du milieu : dénombrement de taxons différents sur un même milieu Milieu trop sélectif : sous-estimation du nombre de cellules potentiellement cultivables Sous-estimation du nombre de cellules actives (uniquement les cellules cultivables) qpcr Trouver une méthode d extraction de l ADN «universelle» (extraire l ADN de chaque espèce sans favoriser une population plus sensible à la technique employée) L ADN n est pas toujours extrait de toutes les cellules. Risque de sous-estimation du nombre de cellules actives. L efficacité d extraction dépend de - la méthode d extraction - la population cible - du stade physiologique des cellules L ADN des cellules mortes mais intactes est extrait : surestimation du nombre de cellules actives.018

M.Rousseau Photothèque INRA INRA UR342 Technologie et Analyses Laitières F-39800 Poligny France Dijon - 07 / 10 / 2014