LA CONSERVATION EX SITU D ESPECES VEGETALES AU CONSERVATOIRE BOTANIQUE NATIONAL MEDITERRANEEN DE PORQUEROLLES Le conservatoire botanique national méditerranéen de Porquerolles a pour mission (entres autre) de conserver ex situ (c est à dire hors du milieu d origine) les espèces végétales menacées, rares, ou protégées par la loi. En dehors des textes réglementaires, il existe ce que les conservatoires botaniques nationaux appellent les espèces à responsabilité patrimoniale, ou les espèces prioritaires qui correspondent à des végétaux endémiques (localisés dans le monde à une petite surface, quelquefois de quelques mètres carrés), très rares et/ou menacés sur l ensemble de leur aire, en limite d aire, ou dont l essentiel des populations se trouvent sur le territoire français. Pour ces espèces il devient essentiel de les préserver de toute atteinte, de gérer leur habitat et parfois de les conserver hors site, dans un conservatoire botanique national et cette mesure s appelle conservation ex situ. La longévité des semences dans les conditions naturelles peut varier de quelques jours à quelques années. Leur conservation est généralement favorisée par une forte déshydratation et par un stockage en atmosphère sèche à basse température. Selon leur comportement en stockage après déshydratation, on distingue classiquement les graines orthodoxes qui supportent la dessiccation, des graines récalcitrantes qui meurent lors d une dessiccation. Depuis 35 ans, le Conservatoire botanique national méditerranéen de Porquerolles assure la conservation ex situ de semences d espèces végétales rares et menacées de la région méditerranéenne française. Pour la plupart de ces espèces la longévité des semences selon les conditions de conservation n avait jamais fait l objet d études précises. En l absence de telles données, le choix a été fait de conserver les semences à faible température et faible taux d humidité, conditions réputées optimales pour la plupart des espèces. Cependant, les quelques 2000 espèces et 11 000 lots de semences actuellement conservés ne peuvent plus être matériellement testés à intervalles réguliers. De plus, comme dans la plupart des banques de semences d espèces rares, les lots de semences sont très réduits et ne peuvent, faute de quantités suffisantes, subir des tests de viabilité ou de germination en série. Cette préservation s effectue au moyen de semences ou de parties de plantes (bulbes, rhizomes, éclats de souches, boutures ). Les parties de plantes sont mises en culture immédiatement en tenant compte des spécificités écologiques de l espèce. Les semences ou les spores sont nettoyées séchées et conditionnées en emballage afin d être stocké en conservation. Les protocoles de conservation Ajustement en eau des semences : Il existe deux grandes catégories de semences, celles qui supportent la dessiccation et celles que la dessiccation extermine. Dans la région méditerranéenne, très peu de semences sont dites récalcitrantes à la dessiccation, ce sont surtout dans les zones tropicales avec des saisons peu marquées en température où l on rencontre ces semences impossibles à conserver à long terme. Concernant les semences orthodoxes, c'est à dire qui supportent la dessiccation, nous les faisons sécher à l'aide de silicagel (absorbeur d'humidité) dans des boites étanches. Les pastilles de silicagel sont changées régulièrement afin d'avoir un séchage régulier. La fréquence du changement de pastille est fonction de la teneur en eau des semences, de la quantité de semences et du volume de ces semences. Le silicagel est teinté au bleu de cobalt qui vire au rose lors de l absorption d humidité. Le silicagel est utilisé à la fois pour dessécher mais aussi comme témoin d humidité. En effet, un indicateur coloré en bleu tourne au rose en présence d humidité. Les opérations de séchage s effectuent à 5 C en cha mbre froide. 1
La durée de dessiccation nécessaire est également inconnue pour les espèces; elle est très variable d une espèce à l autre et il semble difficile d arriver à l évaluer tant qu il n existe pas de moyens non destructifs pour déterminer la teneur en eau d une semence. La conservation : Trois méthodes de conservation sont utilisées, la chambre froide à +5 C, la congélation à -20 C et l ultra dessiccation. En règle générale, les lots des chambres froides, servent à mettre au point les méthodes de germination et de culture de l'espèce, mais aussi à faire des échanges avec des scientifiques. La chambre froide étant la "plus mauvaise" méthode de conservation. Afin d éviter de perdre du matériel par un procédé de conservation mal adapté à l espèce, les gestionnaires de banque de semences choisissent de diviser l échantillon en plusieurs lots, chaque lot correspondant à une méthode de conservation: 5 C, congélation, éventuellement ultradessiccation. Par sécurité les lots sont séparés et conservés selon les trois méthodes. Les lots les plus précieux sont systématiquement congelés et lyophilisés. Ce sont des lots qui ne doivent servir qu'à des opérations de renforcement de population en nature, ou d'introduction ou de réintroduction en nature. Toujours dans un objectif de rechercher une sécurité maximale, la lyophilisation permet de dédoubler et de conserver à température ambiante les lots de semences les plus précieux dans un autre site. Pour garantir une conservation optimale et afin d éviter aux semences des variations d humidité et de température lors de l ouverture d un flacon ou d un sachet, les échantillons conservés sont fractionnés en sous-lots lors du conditionnement. Le silicagel est utilisé à la fois pour dessécher mais aussi comme témoin d humidité. En effet, un indicateur coloré en bleu tourne au rose en présence d humidité. RECAPITULATIF DES PROCEDES RECOLTE séchage en dessiccateur à 5 C tri et nettoyage STOCKAGE conditionnement (essai de viabilité) Le nombre de graines conservées par espèce ou par population est variable s'il s agit d'une espèce allogame ou non, si la population est importante ou non. Ce problème est à régler au cas par cas sachant qu'il ne faut en aucun cas piller les populations naturelles c'est à dire qu'il faut prélever un peu de semences sur chaque individu de la population. C'est le cas optimal. Pour certaines espèces, la récolte se fait individu par individu au sein de la population. Rythme de tests de germination et régénération des stocks : Logiquement toute semence arrivant sur le lieu de stockage doit être testée pour évaluer sa viabilité avant conservation. Ceci est réalisable pour les lots de semences important en quantité mais aussi pour les petites banques de semences qui ne reçoivent que très peu de lot. Un rythme de test de germination peut être envisagé tous les trois ans. La régénération des stocks est pratiquée de façon exceptionnelle. En effet à chaque culture vous finissez par sélectionner les individus aptes à survivre dans vos conditions de culture et non tous les individus aptes à survivre dans leurs conditions naturelles. Il s'agit de semences de plantes sauvages et non de semences de plantes cultivées et sélectionnées. Gestion de la banque de semences, essais de germination, tests de viabilité, cultures : Les essais de germinations ont trois objectifs: définir le comportement germinatif d une espèce, s assurer de la viabilité d un lot de semence et la production de plants. 2
Les lots de semences arrivant au conservatoire devraient être testés systématiquement afin de déterminer les conditions de germination si elles ne sont pas connues, et de s assurer que le lot est viable avant la conservation. Malheureusement cette procédure est peu envisageable. La plupart des échantillons arrivent pendant la même période. Quelquefois, la quantité de semences est très faible et ne va pas permettre l utilisation d une batterie de tests de germination pour définir ses caractéristiques germinatives. De plus au fil des ans le nombre de lot à tester après conservation augmente très rapidement. Même si on ne peut tester les lots de conservation tous les ans, faut-il les tester tous les 2, 3, 4 ans, ou plus? (Sachant qu une partie majoritaire des lots doit être réservée pour des cultures de multiplication ou des opérations en nature.) Certaines espèces posent des problèmes de germination. Il s agit souvent des semences de plantes aquatiques, ou de plantes parasites mais aussi de semences grosses ou très petites (orchidées et spores de fougère). La culture des espèces sauvages au sein des Conservatoires botaniques a quatre objectifs principaux. 1. La conservation ex situ des espèces qui ne peuvent pas être conservées sous forme de semences. Les plantes à semences récalcitrantes, à comportement intermédiaire, ou inconnu, les plantes à multiplication végétative, les espèces stériles. D autres moyens que la culture classique peuvent être utilisés, comme la conservation in vitro. Dans ce cas, la culture doit être pérennisée sans limitation de durée, avec un maximum d effectifs disponible. 2. La mise au point de la culture afin de pouvoir produire une espèce si nécessaire. La culture peut être arrêtée après un ou deux cycles de fructification. Elle va permettre de réaliser quelques études sur la biologie florale par exemple. Le nombre de plants en culture dépend souvent du nombre de graines germées issues de l essai de germination. 3. La production de plants pour les opérations en nature va dépendre de la quantité de semences en stock et des objectifs fixés pour le programme. Au CBNM, plusieurs lots de la même station différant par la date de récolte vont être mis en culture afin d obtenir un échantillonnage aussi large que possible. La durée de culture est généralement courte (inférieure à 1 an). 4. La régénération de lots de semences est effectuée lorsqu il est établi que la durée de conservation des semences est faible, mais aussi pour augmenter un lot de semences de plantes. Les effectifs vont dépendre de la quantité de semences et du mode de reproduction de l espèce (s il est connu). Les espèces apomictiques ou autogames n ont pas besoin d un grand nombre de plants pour conserver leur génotype. A l inverse les espèces allogames doivent bénéficier d un effectif important pour assurer un maintien de la variabilité génétique. Pour celles-ci des précautions de culture sont envisagées en rapport avec les risques d hybridations possibles ou supposés: les espèces anémogames doivent être cultivées à l écart dans un lieu fermé, population par population. La pollinisation est dans ce cas manuelle. Les espèces entomogames sont cultivées à l écart des insectes pollinisateurs libres, dans des serres anti-hybridation avec des pollinisateurs maintenus à l intérieur. 3
En pratique Récolte de semences à la pépinière, suivi de tri et de dessiccation. Récolte des fruits et étiquetage de l enveloppe. Cette étiquette comporte : le nom de l espèce, la date de récolte, le nombre de plantes sur lesquelles s est effectuée la récolte, le numéro d entrée en stock du lot d origine la mention «culture CBNMP» La récolte doit être immédiatement suivie d un tri et d un nettoyage soigneux : Oter les semences des fruits, suivis d un tri à la loupe pour écarter les semences parasitées. Placement des semences pour séchage au dessiccateur à 5 C en présence de pastilles de sili cagel et de son étiquette de récolte. Dans le cas de fruits à pulpe, le nettoyage s effectue à l eau suivi d un premier séchage sur du papier absorbant avant d être placé en dessiccateur. Le temps de séchage varie d un lot à l autre. Il peut durer de 2 semaines à plusieurs mois dans le cas de semences à volume important. Récolte de semences en nature. La récolte est accompagnée d un formulaire et d une étiquette qui comporte : le nom de l espèce, la date de récolte, le lieu le nombre de plantes sur lesquelles s est effectuée la récolte, le nom du récolteur, la mention «récolte en nature» L enveloppe de récolte doit rapidement arriver à la banque de semences pour être triée et/ou placée en dessiccateur afin de ne pas commencer le processus de vieillissement des semences. Conditionnement des semences pour terminer la dessiccation et l entrée en stock. Les semences vont achever leur maturation dans des sachets de polyéthylène scellés avec des pastilles de silicagel de couleur bleue et de leur étiquette de récolte. Le silicagel sert de témoin d humidité. La couleur des pastilles de silicagel varie en fonction de l humidité qui les entoure. Leur couleur va du rose (humide) au bleu intense (sec) grâce à la présence d un indicateur coloré le bleu de cobalt. Le recyclage des pastilles roses s effectue à l étuve à 80 C jusqu à ce que les pastilles deviennent bleues. Elles sont alors emballées dans des sacs scellés afin de les protéger de l humidité. L attribution d un numéro de codage et de placement va être noté sur le cahier des entrées en stock. Exemple avec plusieurs lots de semences. Semences très fines et spores de fougère : utilisation de sachets spéciaux afin que les semences ne s éparpillent pas. Semences à ornementations piquantes : il y a risque de perforations des sachets en polyéthylène. La manipulation doit être délicate, l emballage peut être doublé. La conservation en chambre froide à 5 C : elle peut s effectuer de suite après le nettoyage, une surveillance des pastilles de silicagel est effectuée tous les 15 jours environ. La conservation en chambre de congélation à 25 C : Les lots de semences sont placés en chambre froide à 5 C afin de s assurer que les semences sont bien sèches grâce au silicagel. Si le silicagel reste bleu durant 1 mois, les semences sont alors congelées. La conservation par lyophilisation : Les lots de semences sont placés en chambre froide à 5 C afin de s assurer que les semences sont bien sèches grâce au silicagel. Si le silicagel reste bleu durant 1 mois, les semences sont alors lyophilisées pendant 24 heures, puis placées en chambre froide à 5 C. Essais de germination Mise en place Les semences sont retirées de l emballage de conservation. Si ce sont des semences congelées ou lyophilisées elles sont laissées à l air libre pendant 24 heures avant d humidifier le substrat. En effet, ces semences sont très déshydratées, et une entrée d eau brutale peut entraîner des lésions irréversibles au niveau des membranes cellulaires provocant la mort de l embryon. Une étude bibliographique est menée afin d obtenir des renseignements sur les caractéristiques germinatives si elles existent, mais aussi pour trouver les exigences écologiques de l espèce grâce au formulaire rempli lors de la récolte. 4
Tests standardisés Ils s effectuent dans des boites de Pétri, avec du papier filtre imbibé d eau distillée. Chaque boite contient un nombre précis de graines et des indications sur le couvercle : numéro du test, date de mise en place, nombre de graines, et température à laquelle va être placée la boite. Plusieurs températures sont utilisées : 5 C, 10 C, 15 C, 20 C, 25 C, et éventuellement 30 C. Les boite s sont placées dans des étuves chauffées à la température requise. Les observations sont effectuées tous les deux jours. Les observations sont écrites sur la fiche de germination si cela est nécessaire : germinations, changement de papier filtre, changement de température Ceci afin de pouvoir analyser et d obtenir les caractéristiques germinatives du lot de graines. Semis en pépinière Ce sont des semis classiques en terrine avec un substrat adapté aux exigences de l espèce. Les notations sur les fiches de germinations seront moins précises que celles effectuées sur les boites de germination. Fiches de germination Elles sont remplies dès la mise en place des semences. Elles comportent des renseignements et des observations qui vont permettre d avoir des indications sur les caractéristiques germinatives du lot de semences, mais aussi elles vont permettre en utilisant la même méthode de réussir à nouveau la germination de l espèce. Analyse des fiches de germination Cette analyse permet d obtenir les caractéristiques germinatives du lot de semences. Le type de prétraitement à effectuer pour obtenir la germination. (scarification, lavage, trempage, stratification ) Le protocole permettant la germination. (changements de température). La ou les températures optimales. Le temps de latence, temps nécessaire pour obtenir la première germination a une température donnée. Le T50, temps nécessaire pour obtenir 50% de semences germées à une température. La durée de l essai de germination. Ces résultats permettent d établir des courbes de germinations précises et de pouvoir programmer des cultures par exemple. Caissette de repiquage et choix du substrat Les semences germées vont être repiquées dans une mini-serre avec un substrat adapté à leur milieu d origine. Cette mini-serre va être placée en salle de culture. La salle de culture a une température de 15 C la nu it et de 20 C le jour. Cette salle permet d élever des plants en dehors de la période normale de croissance des plantules. Les plantules sont repiquées dans des godets plus grands dès que les racines apparaissent vers le fond du pot. Les pots sont étiquetés précisément avec les renseignements suivants : Nom de l espèce La station de récolte Le numéro de lot attribué lors de l entrée en stock Le numéro de l essai de germination Une étiquette particulière peut être rajoutée si les conditions de culture sont particulières : arrosage modéré. Fiches d observations en salle de culture Ces fiches sont remplies au minimum une fois par semaine. Tous les renseignements et observations utiles vont être notés : ajout de plants, perte de plants et cause supposée, traitement phytosanitaire, croissance, rempotage, et envoi de plants à la pépinière. Fiches d observations en pépinière Ces fiches sont remplies au minimum une fois par semaine.. Tous les renseignements et observations utiles vont être notés : zone de culture, ajout de plants, perte de plants et cause supposée, traitement phytosanitaire, croissance, rempotage, arrosage, pluie, floraison, fructification, récolte des semences. Analyse des fiches d observations L analyse de ces 2 fiches d observations permet d obtenir des renseignements indispensables sur la culture et la phénologie des espèces. Elle va donner lieu à l établissement d une fiche de culture de l espèce, où sont notées les particularités et les exigences de culture. 5