Résistance aux antituberculeux

Résistance aux antituberculeux Pr Emmanuelle CAMBAU Centre National de Référence des mycobactéries et de la résistance aux antituberculeux Groupe Hospitalier Saint Louis-Lariboisière, Université Paris Diderot

Mycobacterium tuberculosis

Mycobactéries du complexe M. tuberculosis M. tuberculosis M. canettii M. africanum M. microti M. bovis HOMME agent principal de la tuberculose HOMME très rare HOMME responsables de la tuberculose chez les mammifères CAMPAGNOL SOURIS BETAIL LAPIN LAMA CHAT PHOQUE CHEVRE LION HOMME 99 % d homologie au niveau des séquences nucléotidiques ARN ribosomal 16S identique M. bovis BCG Souche vaccinale

Nombre estimé de cas de tuberculose dans le monde Incident cases : 8 Millions Prevalent cases: 10 Millions Mortality: 1 Million MDR-TB: 0.3 Millions (4 % of cases) 13% co-infection VIH 2011 () www.who.int/fr/

Incidence de la tuberculose en Europe (OMS-europe) en 2010 72 000 cas dans EU/EEA 330 000 OMS Europe 25 000 cas MDR

Incidence globale 7,7 /100 000 ha 4991 cas annuel de tuberculose 4000 cas à culture positive (réseau du CNR-MyRMA) D. Antoine, Institut de veille sanitaire

31 000 cas en 1970 5 000 cas en 2010

Activité des principaux antibiotiques sur les mycobactéries Antibiotique (année de découverte) M. tuberculosis M. leprae Mycobactéries atypiques Sulfamides (1935) - + - Penicilline G (1944) - - - Streptomycine (1944) + - - Chloramphenicol (1947) - - - Tetracyclines (1948) - - a - Erythromycine (1952) - - - b Isoniazid (1952) + - - Vancomycine (1956) - - - Beta-lactamines large spectre (1961) - - - Quinolones (1962) - - - Rifampicine (1966) + + - Fluoroquinolones (1979) + + c + antibiotique actif ; - antibiotique sans activité a la minocycline (1961) est active sur M. leprae ; b la clarithromycine (1984) est active sur certaines mycobactéries atypiques ; c activité variable en fonction de l espèce et de la fluoroquinolone.

Résistance naturelle aux antibiotiques chez les mycobactéries

Sec/cm Imperméabilité naturelle de la paroi des mycobactéries 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 glycérol Glucose cephaloridine nitrocefin 1 Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Mycobacterium chelonae Jarlier et Nikaido 1990

Facteurs d activité des antibiotiques chez les mycobactéries PENETRATION PAROI INACTIVATION ACTIVATION BL, Ag, R H, Z, Eth CIBLE R, Ag, FQ, E EFFLUX

Sélection de mutants résistants sous traitement par streptomycine (1944 Waksman) Medical Research Council Investigation 1947-48 107 tuberculoses pulmonaires Streptomycine 2 g/j pendant 4 mois Mortalité : 7 % vs 27 % témoins non traités Échec par sélection de mutants résistants chez 42 cas de tuberculose cavitaire (ci-contre) CMI x 10 à 1000 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 81 83,4 71,5 62 12 1 mois 2 mois 3 mois 4 mois 5 mois

Résistance acquise aux antibiotiques chez les mycobactéries - Historique Antituberculeux Utilisation Résistance Référence Ttt in vivo M. tuberculosis Streptomycine 1946 1947 BMRC Isoniazide 1952 1953 Fox Rifampicine 1968 1968 Tsukamura Ofloxacine 1985 1985 Tsukamura M. leprae DDS 1955 1964 Petit Rifampicine 1970 1976 Hastings Ofloxacine 1990 1996 Cambau M. avium complex Clarithromycine 1989 1991 Dautzenberg

Support génétique de la résistance acquise chez les mycobactéries = modification de la séquence nucléotidique d'un gène chromosomique (proportion d 1 mutant résistant pour 10 5 à 10 8 bactéries selon l antibiotique et la concentration de sélection) 1. Mutations ponctuelles TCG ---> TTG Sérine ---> Leucine 2. Délétions ACGCCTAGAT ----> AC TAGAT 3. Insertions ACGCCTAG ----> ACCTTGCCTA

Réseau AZAY Mycobactéries laboratoires de CHU de France 1570 cas en 2008 Représente 27% des cas de la DO 7.3% antécédents de traitement 11.4% VIH positif 58% des cas nés à l étranger Surveillance de la résistance primaire et secondaire aux antituberculeux

Résistance Primaire en France nouveau cas ou sans ATCD de ttt 5-6% isoniazide 1% rifampicine Données réseau AZAY mycobactéries rapport CNR MyRMA 2013 J. Robert, http://cnrmyctb.free.fr

Définition OMS de la tuberculose multi-résistante 2 antituberculeux majeurs : Isoniazide (INH) Rifampicine (RIF) TB- MDR = resistance à INH et RIF

Nouveaux cas avec tuberculose multi-résistante = MDR résistance primaire Global report on Tuberculosis 2012 OMS www.who.int

OMS Europe 2009 : multi-résistance (MDR-TB) primaire 28 000 MDR cases

Résistance secondaire en France Cas avec ATCD de ttt 10-20% isoniazide 10% rifampicine Données réseau AZAY mycobactéries rapport CNR MyRMA 2013 J. Robert, http://cnrmyctb.free.fr

Cas de rechutes avec tuberculose multi-résistante = MDR résistance secondaire 2011

Définition OMS XDR-TB October 2006 Ultra-résistance (XDR) = Multi- resistance INH and RIF (MDR-TB) + résistance aux aminosides de 2eme ligne amikacine, kanamycine ou capreomycine Et aux fluoroquinolones

N cas 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Souches MDR-XDR isolées en France (CNR-MyRMA) 2003-2012 MDR (XDR) XDR 2 à 5 % des MDR 8% 13% 9% 17% 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

Cas de tuberculose XDR en France année Pays de naissance N 2004 Algérie 1 2005 Mali 1 2006 France, Tchétchénie 2 2007 France, Congo 2 2008 Russie, Roumanie 2 2009 Algérie, 2 Géorgie, Arménie 4 2010 Portugal, 3 Tchétchénie, Azerbaïdjan 5 2011 Portugal, 2 Algérie, Côte d Ivoire, 2 Russie 6 2012 14 Géorgie, Arménie, Ukraine 16

Rifampicine Rifampicine : dérivé semi-synthétique d'un antibiotique macrocyclique : la rifamycine B Rifampicine Rifabutine Rifapentine CMI = 0,5 2 mg/l Cmax = 10-15 mg/l

Résistance acquise à la rifampicine chez les mycobactéries Synthèse d ARN in vitro après purification des ARN polymérases de Mycobacterium tuberculosis (Yamada 1985) Souches CMI (mg/l) Rifampicine Rif (mg/l) % synthèse Sensible 1,25 0 1 5 Résistance bas niveau Résistance haut niveau 10 0 1 5 40 0 1 5 100 11 4 100 113 97 100 100 107

Mécanisme de résistance à la rifampicine chez Mycobacterium tuberculosis Mutations ponctuelles dans la région 507-533* de rpob, codant la sous-unité b de l ARN polymérase 511 513 516 521 526 531 533 Leu Gln Asp Ser His Ser Leu Pro Pourcentage des mutations Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Arg Leu Leu Trp parmi souches Rif-R 10% 35% 45% Pro *numérotation des codons utilisée chez E.coli Telenti 1993, Honore 1993, Williams 1994 et 1998, Musser 1995, 1998

Isoniazide : Isoniazide hydrazide de l'acide isonicotinique (INH) Actif sur le complexe M. tuberculosis CMI = 0,05 0,1 mg/l Cmax = 2 5 mg/l

Isoniazide : mode d action KatG (catalase) Inh inactif Isonicotinic- Cible = InhA acyl-nadh enoyl ACP reductase (FAS2) Le complexe Inh-NADH se lie à la protéine InhA avec une forte affinité et bloque le site actif inhibition de la synthèse des acides mycoliques à longue chaine (FASII) (Lei et coll., JBC 2000)

Isoniazide : mécanisme de résistance Deux modes de résistance à l'isoniazide : Mutations KatG Inh inactif Isonicotinic- Cible = InhA acyl-nadh Mutations : - augmentent le niveau d'expression: promoteur -15 - diminuent l'affinité pour inh-nadh: mutation codon Ser94 10 à 15% des souches : pas de mutations dans katg ou inha

Isoniazide : mécanismes de résistance 50% à 80% des souches : mutations katg (76% Ramaswamy, AAC 2003) haut niveau de résistance à l'isoniazide (CMI >= 10 mg/l) mutations = substitutions, délétions ou insertions altérant la séquence polypeptidique de KatG : Ser315Thr = mutation la plus fréquente qui diminue l'activation de Inh (mutation au voisinage de NADH) Arg104Leu, His108Gln dans le site catalytique Thr275Pro = site de fixation Réduction ou perte d'activité catalasique

Pyrazinamide : mode d action pyrazinamidase CMI = 50 250 mg/l à ph 5.5

Pyrazinamide : mécanisme de résistance pyrazinamidase (Résistance) 72-98% des souches PzaR : mutations dans le gène pnca grande diversité de mutations : substitutions, insertions, délétions, mutations Stop, insertion d'is6110, Thr47Ala Scorpio et coll., Nature Med, 1996, Lemaître et coll., AAC, 1999, Dormandy 2007

Ethambutol : mécanisme de résistance mutations dans l'opéron embcab qui code pour des arabinosyl transférases impliquées dans la synthèse de l'arabinogalactane et du lipoarabinomannane (constituants de base de la paroi des mycobactéries) mutations dans embb : Met306 -> Ile, Leu ou Val dans 50-80% des souches Phe330 -> Val Thr630 -> Ile niveau de résistance variable mutations en amont de embcab : surexpression des protéines Emb CMI = 0,5-2 mg/l Cmax = 2-5 mg/l Telenti et coll., Nature Med, 1997

In vitro activity (MIC in mg/l) of quinolones on Mycobacterium tuberculosis Quinolone E. coli S. pneumoniae M. tuberculosis Levofloxacin 0,06 2 0.5-1 Ciprofloxacin 0,003 1 1-2 Sparfloxacin 0,03 0,25 0,25 Moxifloxacin 0,03 0,125 0.25-0,5 Gatifloxacin 0,006 0,25 0,25 Garenoxacin 0,03 0,032 2

Mécanismes de résistance acquise aux quinolones chez les mycobactéries Species GyrA 83 GyrA 87 CMI OFL (mg/l) M. tuberculosis S Ala Asp 1 R in vivo His 16 R in vivo Tyr 16 M. leprae S Ala Asp S in vivo R in vivo Val R in vivo M. avium Ala Asp 16 mutant R in vitro Val 128 M. smegmatis Ala Asp 1 14 mutant R in vitro 1 ét. Val 8 mutant R in vitro 1 ét. Gly 16 500 mutant R in vitro 2 ét. Val Gly 128 1800 IC50 OFL /gyrase (mg/l) Cambau FEMS ML 1994, Cambau JID 1994, Revel AAC 1994, Cambau Res Microbiol 1996, Sougakoff EJCMID 1997, Cambau Lancet 1997

Ethionamide : Ethionamide éthyl-3 thio-isonicotinamide

Ethionamide Mécanisme d'action : Transformation par oxydation en dérivé actif par la mono-oxygénase EtaA (régulée par EtaR) (Vannelli, J Biol Chem, 2002) Inhibition de la synthèse des acides mycoliques (au niveau de FAS2 ; cible = InhA) Mécanisme de résistance : Mutation de l énoyl-acp-réductase InhA (résistance croisée avec l'isoniazide) Mutations dans le gène activateur etaa, ou dans le gène régulateur etar (diminution du niveau de synthèse d'etaa) (Baulard et coll., J Biol Chem, 2000)

Cyclosérine D-cyclosérine : analogue structural cyclique de la D-alanine perturbe la synthèse de la paroi bactérienne antibiotique à large spectre actif sur la majorité des mycobactéries la surexpression du gène alra codant pour une D- alanine racémase pourrait être un mécanisme de résistance chez M. tuberculosis (Ramaswamy et Musser, Tub Lung Dis, 1998)

Streptomycine : mode d action Aminocyclitol glycoside Premier antibiotique à avoir été utilisé dans le traitement de la tuberculose Cible = sous-unité 30S du ribosome (ARN 16S) : inhibiteur de la synthèse protéique) Streptidine L-streptose CMI = 1-2 mg/l Cmax = 20-40 mg/l N-Me- L-glucosamine

Streptomycine : mécanismes de résistance 55% des souches : mutations rpsl / protéine ribosomale S12 haut niveau de résistance, CMI > 500 mg/l) : Lys43 -> Arg et Lys88 -> Gln ou Thr 15% des souches mutations rrs / ARN16S boucle 530 : mutations en 491, 512, 513, 516 boucle 915 : mutations en 903, 904-30% des souches: bas niveau de résistance (CMI > 4 et < 100 mg/l) mécanisme encore inconnu, diminution de la perméabilité de la paroi ou enzymes modificatrices, mutations du gène gidb (m(7)g) methyltransferase pour G527 de l ARN 16S Finken 1993, Meier 1994, Meier 1996, Honore 1994, Alangaden 1998, Okamoto 2007

Autres aminoglycosides Aminoglycosides : Amikacine (dérivé de la kanamycine) fixation sur les ribosomes résistance par mutation de rrs (ARN16S, nucléotide 1400) (Tanigushi et coll., J Bact, 1997)

Capréomycine Capréomycine : antibiotique polypeptidique cyclique uniquement actif sur Mycobacterium tuberculosis Inhibe la synthèse protéique

Résistance à l amikacine et à la capréomycine rrs (ARN16s): 1401 A => G Résistance à la capréomycine et amikacine rrs (ARN16s): 1402 C => T Résistance à la capréomycine Mutations tlya?? Autres mécanismes: R Akn mais non Cap Mutation gidb??: R capréomycine

PAS Acide para-aminosalicylique (PAS) : analogue de l'acide para-aminobenzoïque (PAB) inhibition de la synthèse de l'acide folique actif sur M. tuberculosis

Nouveaux antituberculeux CMI mg/l Commercialisation Linézolide (oxazolidinone) PA 824 (nitroimidazopyrane) TMC-207, besaquiline (diarylquinoline) OPC, Delamanid (Nitroimidazopyrane) 0,5 Faite pour autres Gram positif 0,1?? 0,01 En cours EMA 0,01 En cours EMA Cynamon AAC 1999, Stover Nature 2000, Andries Science 2005

ATP synthase TMC-207 Janssen (Jonhson & Jonhson) Pharmaceutical Research and Development) Séquençage complet de 2 couples sauvage/mutant résistant (M.tuberculosis, M.smegmatis) : sous-unité c ATP synthase (gène atpe) Andries Science 2005

Pas de résistance croisée entre TMC-207 et les autres antituberculeux Wild type Mutant BK12* TMC-207 0.03 4 Isoniazide 0.12 0.12 Rifampicine 0.5 0.12 Ethambutol 2 4 Streptomycine 1 1 Amikacine 1 2 Moxifloxacin 0.25 0.25 * : mutation A63P in atpe

Mycobacterium tuberculosis complex = Pathogènes du groupe 3 Manipulation en NSB3 (P3) Surtout cultures de BK multi-résistant Arrêté CE 2005, Arrêté JO 2007, 2012

Détection de la résistance aux antibiotiques chez les mycobactéries. Méthodes phénotypiques croissance en présence d ATB (concentration critique) par rapport à un milieu témoin sans ATB calcul de la proportion de mutants résistants (proportion critique) 12 à 28 jours. Méthodes génotypiques mise en évidence de mutations «prédictives» dans un gène impliqué dans les mécanismes de résistance 1 à 3 jours

Log 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Proportions de résistants mutants au cours d un traitement par monothérapie 99.9% 50% R/S 1% R/S Month1 Month2 Month3 0.1% R/S Month4 Month5 Month6 Month7 Month8 0.001% R/S R/S S R Susceptible Population Resistant mutant

Antibiogramme par la méthode des proportions

T -1 T -3 INH 0,2-1 R -1 100 col 1 col 0 col S S

T -1 INH 1-1 RMP -1 ETH -1 200 col 100 col 200 col 1 col R R S

Témoin Strep INH Rif Eth S R S S

Diagnostic de la résistance aux antituberculeux Méthodes phénotypiques: Antibiogramme Mesure la croissance en présence d antibiotique Utilise la culture en milieu solide (LJ, 7H11) ou liquide (7H9, MGIT) => Lent : 2 à 6 semaines Détecte la résistance et la sensibilité Pour tous les antituberculeux connus Méthodes moléculaires : génotype de résistance Détecte des mutations de gènes, connues pour donner une résistance à l ATB considéré Utilise la PCR-séquence => Rapide (24h) Détecte la résistance (partiellement la sensibilité) Principaux antituberculeux

Analyse des gènes de résistance aux antituberculeux : RESISTOME Antibiotique Gene principal complément Rifampicine rpob Isoniazide promoteur inha, katg codon 315 gene inha Ethionamide promoteur inha, etha ethr Ethambutol embb codon 306? Pyrazinamide pnca (tout le gène) pyrazinamidase Streptomycin rpsl (43, 88), rrs region 530 gidb Amikacin rrs region 1401 and 1490 Capreomycin rrs region 1401 and 1490 tlya Fluoroquinolones gyra (codons 88 to 94) gyrb PAS?? Cyclosérine?? Linézolide Bedaquiline rrl atpe

Analyse des gènes de résistance aux antituberculeux : RESISTOME Antibiotique Gene principal complément Rifampicine rpob Isoniazide promoteur inha, katg codon 315 gene InhA Ethionamide promoteur inha, etha ethr Ethambutol embb codon 306? Pyrazinamide pnca (tout le gène) pyrazinamidase Streptomycin rpsl (43, 88), rrs region 530 gidb Détection d une souche Amikacin rrs region 1401 and 1490 Capreomycin rrs region 1401 and 1490 tlya MDR (R Rmp et R Inh) Fluoroquinolones gyra (codons 88 to 94) gyrb PAS?? Cyclosérine?? Linézolide Bedaquiline rrl atpe

Analyse des gènes de résistance aux antituberculeux : RESISTOME Antibiotique Gene principal complément Rifampicine rpob Isoniazide promoteur inha, katg codon 315 gene inha Ethionamide promoteur inha, etha ethr Ethambutol embb codon 306? Pyrazinamide pnca (tout le gène) pyrazinamidase Streptomycin rpsl (43, 88), rrs region 530 gidb Amikacine rrs region 1401 and 1490 Capreomycin rrs region 1401 and 1490 tlya Fluoroquinolones gyra (codons 88 to 94) gyrb PAS?? Détection d une souche XDR Cyclosérine?? Linézolide rrl (R Rmp + R Inh + RFq + RAga) Bedaquiline atpe

Méthode 1 : PCR puis hybridation inverse 1. Bandelette préhybridée avec sondes oligonucléotidiques 2. PCR Multiplex =>fragments d ADN amplifiés Bande positive La séquence du fragment de PCR est identique à celle de la sonde Bande négative La séquence du fragment de PCR est différente à celle de la sonde

InnoLiPA Rif TB (Innogenetics) Gène rpob => détection de la résistance à la rifampicine

Genotype MTBDRplus (Hain, Biocentric) Résistance à la Rifampicine Résistance à l isoniazide rpob katg codon315 promoteur inha

GenoType MTBDRsl (Hain, Biocentric) Résistance aux fluoroquinolones gyra Résistance aux aminosides Résistance à l éthambutol rrs embb

Méthode 2 : PCR en temps réel PCR Détection de mutations pendant l amplification (sondes, température de fusion, HRMA) Trousses Magicplex MDR-TB Real-time Detection (Seegene) Roche Light cycler BD max Technique «maison»

Gene Xpert MTB/RIF Cepheid (USA) gène rpob => résistance à la rifampicine méthode facilement praticable Résultat en 2 heures après réception au laboratoire Boehme CC et al. NEJM 2010

Fragmentation Méthode Next generation 3 : séquençage sequencing technologies d ADN Génome entier ou amplicons Tagging Amplification Sequencing Loman et al. 2012 Nat Rev Microbiol 10: 599

Détection moléculaire de la résistance : indications? Cas avec ATCD de traitement (cas nés en France et à l étranger) Nouveaux cas importés de pays à forte prévalence de résistance Cas collectivité (risque de transmission) Nouveaux cas VIH+ A confirmer par antibiogramme

Quantité de bacilles tuberculeux par ml de prélèvement Outils diagnostiques et sensibilité 100 000 000 = 10 8 Examen microscopique Amplification génique Culture 10 000 000 = 10 7 M+ 1 000 000 = 10 6 100 000 = 10 5 PCR+ C+ 10 000 = 10 4 1 000 = 10 3 M0 100 = 10 2 10 1 PCR0 C0

Diagnostic bactériologique de la tuberculose (maintenant) Temps du diagnostic 1 semaine à 3 mois Prélèvement Examen microscopique BK+ amplification génique PCR - Détection moléculaire de la résistance aux antituberculeux mutation PCR+ R Tuberculose MDR Avis spécialisé Pas de mutation M+ S Traitement Standard de tuberculose HRZE puis HR Culture M0 C+ BK+ Antibiogramme C0 -IDR ou IGRA pour contacts -Empreint digitale génomique si le contexte épidémiologique suggère une transmission

CAT devant une tuberculose MDR Il faut suspecter la tuberculose multi-résistante devant Suspicion de tuberculose l histoire du patient: pays d origine et date d arrivée en France, antécédent de TB ou de traitement Il faut alors Faire isolement strict préventif Envoyer prélèvement pour détection de la multi-résistance par un test moléculaire rapide Si MDR-TB confirmé, appel du CNR et signalement cas ARS

Comment éviter de créer de la multirésistance parmi les nouveaux cas - quadrithérapie pour tous les nouveaux cas - éthambutol : évite la sélection de mutants résistants à la rifampicine en cas de résistance 1aire à INH en début de traitement (population bacillaire ++) car le PZA ne sait pas faire cela! - ~ 5000 nouveaux cas / an - ~ 5% soit ~ 250 cas résistants 1aire à INH - 250 candidats par an à devenir MDR si pas d éthambutol

Comment éviter de créer de la multirésistance parmi les cas avec ATCD de traitement 4 erreurs à éviter 1. Ajouter 1 seule molécule à un régime en échec 2. Ne pas détecter les résistances pré-existantes 3. Traitement inadéquat 4. Négliger les problèmes de compliance Mahmoudi, JAMA 1993

Stratégie opérationnelle pour le diagnostic de la résistance en tuberculose J0-J1 J10-J30 Microscopie : M+,M0 en cas de prélèvement M+ Amplification génique (PCR) + Détection de la résistance à la rifampicine si facteurs de risque Mise en culture Lecture des cultures identification rapide des cultures positives (mycobactéries du complexe tuberculosis) tests de sensibilité ATB 1ere ligne (au minimum isoniazide et rifampicine) > J30 tests de sensibilité ATB 2eme ligne Génotypage Diagnostic de l infection tuberculeuse / entourage-contacts

Conclusion 1. Etude des mécanismes de résistance Connaissance fondamentale de la physiologie des mycobactéries Développement des méthodes rapides de détection de la résistance Recherche de nouveaux antibiotiques actifs sur les mycobactéries. 2. Détection de la résistance acquise au laboratoire En pratique, méthodes phénotypiques Méthodes génotypiques rapides au point pour la rifampicine» (pyrazinamide et fluoroquinolones). Particulièrement utile pour les malades ayant été déjà traités. En cas de résistance à la rifampicine, la détermination de la sensibilité aux autres antibiotiques (par méthode phénotypique) est indispensable. 3. Prévention de la résistance acquise la prévention de la sélection de mutant résistant par une polychimiothérapie adaptée la prévention de la transmission des souches résistantes.