PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) Amplification des acides nucléiques PCR RT-PCR Et leurs applications PCR en temps réel
La PCR : une révolution technologique en biologie moléculaire APPLICATIONS : - Médecine légale * Identification d un suspect * Recherche de paternité - Détection de microorganismes pathogènes (à ADN ou à ARN) - Diagnostic préimplantatoire, prénatal - Diagnostic de maladies génétiques - Etude de l expression des gènes - Agroalimentaire (OGM)
Etude d un cycle de PCR 1. Dénaturation de l ADN cible 2. Hybridation des amorces 3. Extension des amorces - Ces 3 étapes se font à des températures différentes. - La PCR consiste à répéter ce cycle de 3 étapes thermiques dans un même tube.
Les 2 brins de l ADN sont maintenus appariés par des liaisons non covalentes : G C et A=T. La dénaturation correspond à la rupture de ces liaisons par la température (94 C) ADN simple brin En se plaçant dans les conditions de renaturation de l ADN ( 55 C), les séquences complémentaires se réapparient. Les oligonucléotides spécifiques (20 bases) à une molarité 10 6 fois celle de la cible s hybrident sur l ADN.
Les oligonucléotides servent d amorce à une ADN polymérase qui recopie chacun des brins initiaux en incorporant les dntps. Le brin néosynthétisé s étend de 5 3 et est complémentaire de la cible.
La succession des cycles A chaque cycle : doublement du nombre de copies de la séquence cible. En PCR classique : 25 à 40 cycles sont effectués 2 25 à 2 40 copies (théoriques) 2 30 = 1 073 741 824
Réalité de l amplification
Visualisation de l amplification Après coloration des acides nucléiques par un agent intercalant (BET ou bromure d éthidium)
Le milieu réactionnel : - La matrice (cible) - L enzyme - Les oligonucléotides (5 et 3 ) - dntp - MgCl 2 - Autres
L ADN cible - Pas forcément purifié (lysat de cellules) - Pas en trop fort quantité : 10 ng dans 50 µl (inhibition de l amplification ou smear) - Pas trop de séquences GC (difficile à dénaturer) - Dans des parties spécifiques du gène
Les enzymes - Taq ADN polymérases : les plus utilisées (thermus aquaticus : Eubactérie) - Polymérases d archaebactéries (pfu, pfx) - Chaque enzyme a ses propriétés intrinsèques (processivité, fidélité, [MgCl 2 ] Mise au point si on change d enzyme - Fonctionnent jusqu à 100 C mais cette température endommage l ADN. - 0,2 à 1 U pour 50 µl de réaction. Si trop d enzyme : inhibition de la réaction / bandes parasites.
Les amorces oligonucléotidiques Amorces = Primers = Oligonucléotides 1 sens et 1 antisens Taille = 20 à 30 pb Complémentarité parfaite avec la cible Pourcentage en GC proche de 50% Pas de complémentarité intra et inter amorces (dimères d amorces) Pas de structure secondaire (boucles ou structures en épingles à cheveux)
Le choix des amorces Il existe des logiciels pour «designer» les amorces. Il faut définir le Tm (melting temp = température à laquelle 50% de l ADN est sous forme simple-brin) Tm = 81,5 C + 16,6logM + 0,41 (%G + %C) 500/l 0,6f 1,5m M : concentration molaire en ions monovalents l : longueur de l amorce (en base) f : pourcentage de formamide m : pourcentage de mauvais appariement Tm = 2 C x [A + T] + 4 C x [G + C] (amorces de 14 à 24 bases) Tm relativement élevés et proches (diff<5c ) Température d hybridation = Tm 5 C (si trop basse : Hybridations non spécifiques)
Les dntps - Leur concentration doit être supérieure au Km des polymérases. - En général, [dntp] = 200 µm (même concentration pour chaque. - Le MgCl2 nécessaire à l enzyme est chélaté par les dntps Pas trop de dntps
Les sels - Le MgCl 2 : sa concentration est prépondérante. - Pour optimiser la PCR, on fait varier la [MgCl 2 ] entre 1 et 4 mm. - Les autres sels sont présents dans le tampon de l enzyme (KCl).
Agents chimiques - DMSO (diméthylsulfoxyde) et formamide : diminuent les hybridations non spécifiques (augmentent la stringence). - PEG (polyoxyéthylène glycol) : augmente l efficacité d amplification. - Bases modifiées dé-aza (fragilisation des liaisons G C) Structures secondaires plus facilement déstabilisées.
N 6 2 OH N 2 H N C7-déaza N N H C7-DéazaGuanine (2amino-6hydroxy-purine) N 1 6 5 7 2 4 8 3 9 N N H N
PCR et bandes parasites - Re- «designer» des amorces (pas de séquences Alu/Line ) - Variation de [MgCl 2 ] - Diminution de [amorces] - Augmentation de la température d appariement - PCR Hot Start / PCR Touch Down / PCR nichée
PCR Hot Start Au lieu d ajouter les réactifs à température ambiante (stringence faible hybridations non spécifiques), 1 des réactifs est ajouté une fois la température d hybri- -dation spécifique atteinte. PCR Touch Down La température d hybridation, élevée lors des premiers Cycles (bonne spécificité / faible rendement), est diminuée de façon progressive à chaque cycle (-0,2 C/ cycle)jusqu à une température plus faible (bon rendement). Exemple : 64 C 58 C.
PCR nichée 2 réactions de PCR successives : 1ère PCR : amorces A + B 2ème PCR : amorces C + D
Problèmes de contamination - Donne des faux positifs. - Dû à la sensibilité +++ de la technique (x 10 6 ) - Contamination par aérosols de produits PCR Après amplification : 200 copies/pl or 1 aérosol = 1 pl - Nécessité de contrôle négatif (sans ADN cible) - Organisation du laboratoire (pièces pré-pcr, PCR, post-pcr) avec matériel dédié et circulation mono-directionnelle - Utilisation de pointes-filtres - Aliquotage des réactifs
Problème de la présence d inhibiteurs - Donne des faux négatifs. - Certains sont connus (hème, DMSO, héparine, SDS, colorants, phénols ). - D autres inconnus (dans LCR, urines) -Nécessité de contrôle positif ajouté dans l échantillon (autre cible ou même cible modifiée) - Pour lever l inhibition : * Diluer l échantillon * Purifier l ADN
Amplification pangénomique WGA = Whole Genome Amplification (Kit SIGMA) Méthode d amplification de la totalité du génome ampli x500 de l ADN génomique Pour pallier au problème des échantillons d ADN en faible quantité Basée sur une fragmentation aléatoire de l ADN. Utilise des amorces universelles, un nombre de cycles limité et une polymérase "robuste" (WGA).
ETAPES DE L AMPLIFICATION PANGENOMIQUE : 1) Fragmentation aléatoire pour générer des fragments d environ 400 pb 2) Hybridation d amorces universelles 3) Elongation (ADN polymérase WGA2) 4) Seconde étape d hybridation 5) Elongation Banque de fragments D ADN 6) Amplification PCR
AVANTAGES DE LA PCR : Exemples d applications - Pouvoir travailler sur une toute petite quantité de matériel biologique (sensibilité) * Criminologie * DPI * DPN - Pouvoir travailler sur de l ADN dégradé * Analyses post-mortem * Recherches historiques * Préhistoire (migrations) - Pouvoir discriminer entre différentes cibles (spécificité) * Tests de paternité * Détection de micro-organismes pathogènes * Recherche de contaminants
PCR et criminologie (1) - Problématique = matériel en très faible quantité (éventuellement dégradé) : 1 ng -Cibles doivent être communes à tous les individus et non codantes.
PCR et criminologie (2) Utilisation de séquences microsatellites (séquences répétées en tandem : STR).
DPN (Diagnostic PréNatal) On peut déterminer si un individu porte 1 allèle ou 2 allèles mutés. 2 techniques : - prélèvement de villosités chorioniques - amniocentèse.
DPI (Diagnostic PréImplantatoire) Il se fait suite à une PMA (Procréation Médicalement Assistée). Prélèvement d 1 cellule sur embryon 8 cellules.
Identification de corps ADN dégradé Post-Mortem
Recherche de paternité
Détection de microorganismes pathogènes (1) Détection qualitative et quantitative. - Virus - Bactéries - Champignons - Parasites
Détection de microorganismes pathogènes (2) INTERETS : - Détection de bactéries à culture lente (Mycobacterium tuberculosis) - Détection de germes non cultivables - Réponse rapide (méningites) - Détection de mutations responsables de résistances aux antiviraux, antibiotiques
Application en agro-alimentaire - Détection d OGM - Détection de pathogènes (Salmonella, Listeria)
Application à l hématologie Détection de transcrits de fusion maladie résiduelle (bcr-abl : leucémie myéloïde chronique)
Diagnostic de Maladies Génétiques : Recherche de mutations (1) PCR spécifique d allèles (ASO = Allele Specific Oligonucleotide) ARMS = Amplification Refractory Mutation System PCR-mutagénèse dirigée (SDM = Site Directed Mutagenesis) PCR suivie de techniques de criblage : SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism), DHPLC (Chromato Liquide Haute Performance en conditions dénaturantes), HRM (High Resolution Melting)
Diagnostic de Maladies Génétiques : Recherche de mutations (2) PCR suivie de Séquençage
Diagnostic de Maladies Génétiques : Recherche de délétions PCR multiplex QMPSF (Quantitative Multiplex PCR of Short Fluorescent Fragments) MLPA (Multiplex Ligation dependent Probe Amplification) MLPA : délétion 17p11.2 (Smith-Magenis)
Etude d expression de gènes : la RT-PCR (1) - Cette technique permet l étude des ARNs. - Elle nécessite une étape de «reverse transcription» (RT) ou transcription inverse : transformation de l ARN en ADN complémentaire (ADNc). - Puis on applique une PCR classique. - Le résultat de la RT-PCR dépend : de l organisme + du tissu + de la physiopathologie.
Etude d expression de gènes : la RT-PCR (2) Transcription de l ARN en ADNc par une reverse transcriptase puis PCR à partir du brin d ADNc. Amorces de RT : - oligo dt (12 à 18 T): amplifie spécifiquement les ARNm (polya+) - random primers : mélange d hexamères synthétisés au hasard - amorces spécifiques de la cible Transcriptase inverse (RT) : ADN polymérase ARN dépendante : AMV et MMLV (extraites de virus à ARN). ARN : qualité, ARNm, sans contamination ADN La richesse en GC peut gêner
PCR en temps réel Les amplicons sont visualisés et quantifiés au fur et à mesure de leur synthèse par une émission de fluorescence. AVANTAGES : - Permet une quantification de la cible - Peut apporter une meilleure spécificité - Permet le multiplexage - Pas ou peu de post-pcr - Analyses à haut débit
Rappel : Cinétique de la PCR 1 2 3 4 4 phases: 1- ampli. non détectable 2- phase exponentielle 3- phase linéaire 4- plateau PCR «classique»: - Point final (phase 4) - Qualitatif PCR en temps réel: mesure d une émission de fluorescence cycle par cycle - Phase exponentielle - Xn = Xi x 2 n - Quantitatif
Phase plateau Phase linéaire Phase exponentielle
Traitement du signal de fluorescence QUAND? Ligne de base Phase exponentielle Nombre de cycles Seuil Définir le Seuil: niveau de fluorescence atteint au milieu de la phase exponentielle, représenté par une droite. Attribuer un Cycle seuil, Ct (threshold cycle) : cycle de la PCR où le signal de la fluorescence atteint la valeur du seuil. Le Ct est directement lié à la quantité d ADN cible présent au début de la PCR ( Xn = Xi x 2 n avec n = Ct). Tous les calculs de quantification sont effectués à partir des Ct.
Fluorescence émise (UA) 250 200 150 100 50 0 Ct 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 0 10 20 30 40 Nombre de copies (log) 6 5 4 3 2 1 Log N = -0,26 Ct + 10,85 R 2 = 0,998 18 23 28 33 38 Nombre de cycles Cycle seuil - Ct Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre une fluorescence donnée (phase log-linéaire) est fonction du nombre d ADN cibles initialement présents
Gamme de Dilution Une différence d un cycle pour la valeur du Ct correspond à un écart d un facteur 2 entre les quantités initiales d ADN.
Comment ça marche? - Appareil: thermocycleur + détecteur - Détection: fluorescence émise par un rapporteur (fluorophore). - Plaque 96 ou 384 puits. Chimie Sybr Green Intercalant fluorescent lorsque fixé à ADN double brin mesure en fin d élongation. Chimie Taqman Sonde spécifique portant en 5 un fluorochrome reporter et en 3 un quencher fluorescent FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer) Chimie Taqman MGB Même principe mais NFQ en 5 (Non Fluorescent Quencher) couplé au MGB (Minor Groove Binder)
Sybr Green Le Sybr Green libre n est pas fluorescent Durant l élongation: se lie à l ADN double-brin. Le Sybr Green lié est fluorescent Corrélation Intensité de fluorescence émise / Quantité d ADN double-brin. Liaison réversible : dénaturation double-brin fluorescence Avantage : pas cher. Inconvénient : problème de spécificité.
Chimie Taqman - sonde spécifique de la région d intérêt - sonde intacte excitation lumineuse, absorption de l émission du reporter (VIC/FAM) par le quencher (TAMRA)= FRET - activité 5 exonucléasique dégradation de la sonde, émission lumineuse par le reporter - Corrélation Intensité de fluorescence /Quantité d ADN Avantage : très spécifique Inconvénient : cher! hν FRET
Applications de la PCR-Q Quantification Relative: - A partir d ARN transformé en cdna via RT-PCR. Niveau d expression d un gène par rapport à un gène de référence. Comparaison de cellules cancéreuses/normales par ex. - Recherche de délétion Quantification absolue: Détection d agents pathogènes (charge virale), recherche d OGM Génotypage: Analyse des polymorphismes (SNP) par discrimination allélique.
Quantification Relative Comparer l expression de gènes entre différentes situations. Gène Cible Gène de Référence Gène d'intérêt à quantifier. Gène exprimé de façon stable (ex: ARN 18S). Normalisation de la quantité d ARN mise en RT-PCR Echantillon CalibrateurEchantillon de référence (situation normale). Quantification relative = Calculer la différence de Ct du gène cible entre un échantillon X et un échantillon Calibrateur.
Quantification Relative Gène de Référence Nom Ct 18S Std Dev Calibrateur 17,53 0,12 ech. 1 18,84 0,17 ech. 2 18,01 0,21 ech. 3 18,27 0,07 ech. 4 17,88 0,14 ech. 5 17,53 0,12 ech. 6 17,58 0,09 ech. 7 19,67 0,06 Gène Cible Nom Ct 5'Mc Std Dev Calibrateur 32,96 0,11 ech. 1 33,88 0,06 ech. 2 34,54 0,17 ech. 3 30,08 0,06 ech. 4 27,82 0,11 ech. 5 32,96 0,11 ech. 6 36,21 0,09 ech. 7 27,82 0,06
Quantification Relative Gène de Référence Nom Ct 18S Std Dev Calibrateur 17,53 0,12 ech. 1 18,84 0,17 ech. 2 18,01 0,21 ech. 3 18,27 0,07 ech. 4 17,88 0,14 ech. 5 17,53 0,12 ech. 6 17,58 0,09 ech. 7 19,67 0,06 Gène Cible Nom Ct 5'Mc Std Dev Calibrateur 32,96 0,11 ech. 1 33,88 0,06 ech. 2 34,54 0,17 ech. 3 30,08 0,06 ech. 4 27,82 0,11 ech. 5 32,96 0,11 ech. 6 36,21 0,09 ech. 7 27,82 0,06 Ct = Ct Cible - Ct Référence Calibrateur 15,43 ech. 1 15,03 ech. 2 16,53 ech. 3 11,81 ech. 4 9,94 ech. 5 15,43 ech. 6 18,63 ech. 7 8,15
Quantification Relative Gène de Référence Nom Ct 18S Std Dev Calibrateur 17,53 0,12 ech. 1 18,84 0,17 ech. 2 18,01 0,21 ech. 3 18,27 0,07 ech. 4 17,88 0,14 ech. 5 17,53 0,12 ech. 6 17,58 0,09 ech. 7 19,67 0,06 Gène Cible Nom Ct 5'Mc Std Dev Calibrateur 32,96 0,11 ech. 1 33,88 0,06 ech. 2 34,54 0,17 ech. 3 30,08 0,06 ech. 4 27,82 0,11 ech. 5 32,96 0,11 ech. 6 36,21 0,09 ech. 7 27,82 0,06 Ct = Ct Cible - Ct Référence Ct = Ct Echantillon - Ct Calibrateur Nom Ct Ct Calibrateur 15,43 ech. 1 15,03-0,40 ech. 2 16,53 1,09 ech. 3 11,81-3,62 ech. 4 9,94-5,49 ech. 5 15,43 0,00 ech. 6 18,63 3,20 ech. 7 8,15-7,28
Quantification Relative Gène de Référence Nom Ct 18S Std Dev Calibrateur 17,53 0,12 ech. 1 18,84 0,17 ech. 2 18,01 0,21 ech. 3 18,27 0,07 ech. 4 17,88 0,14 ech. 5 17,53 0,12 ech. 6 17,58 0,09 ech. 7 19,67 0,06 Gène Cible Nom Ct 5'Mc Std Dev Calibrateur 32,96 0,11 ech. 1 33,88 0,06 ech. 2 34,54 0,17 ech. 3 30,08 0,06 ech. 4 27,82 0,11 ech. 5 32,96 0,11 ech. 6 36,21 0,09 ech. 7 27,82 0,06 Ct = Ct Cible - Ct Référence Ct = Ct Echantillon - Ct Calibrateur 2 - Ct = Expression Normalisée de la Cible 2 - Ct Nom Ct Ct Calibrateur 15,43 ech. 1 15,03-0,40 1,32 ech. 2 16,53 1,09 0,47 ech. 3 11,81-3,62 12,31 ech. 4 9,94-5,49 44,99 ech. 5 15,43 0,00 1,00 ech. 6 18,63 3,20 0,11 ech. 7 8,15-7,28 155,60
Exercice (1/2) Cellules humaines normales de la plèvre ARN 18S Ct 14 Ferritine-L Ct 32 Cellules humaines transformées de mésothéliome ARN 18S Ct 16 Ferritine-L Ct29 La chaîne légère de la ferritine est-elle sous-exprimée ou sur-exprimée dans le mésothéliome pleural malin?
Exercice (2/2) Cellules normales ARN 18S Ct 14 Ferritine-L Ct 32 Cellules mésothéliomales ARN 18S Ct 16 Ferritine-L Ct 29 Ct Cellules Normales = 32 14 = 18 Ct Cellules Mésothéliomales = 29 16 = 13 Ct = 13 18 = -5 2 - Ct = 2 +5 = 32 La chaîne légère de la ferritine est 32 fois plus exprimée dans les cellules cancéreuses que dans les cellules normales.
Quantification absolue Une courbe standard est ensuite établie : Ct observé en fonction de la quantité d ADN cible quantification absolue possible en fonction du Ct obtenu pour chaque échantillon Courbe standard du gène d intérêt Ct Ct Ct observé Log ng ADN cible Quantité ADN cible Log ng ADN cible Détection d OGM, de particules virales