Projets Exploratoires PluridisciplinaireS 2010 La technologie «HRM» (High Resolution Melting) Une nouvelle approche pour l étude de la diversité des communautés symbiotiques Hélène Henri & Laurence Mouton Laboratoire de Biométrie et Biologie Evolutive UMR CNRS 5558 Université de Lyon; Université Lyon1 Henri & Mouton. Molecular Ecology Resources, in Press
Contexte biologique Arthropodes -> grande diversité de symbiotes bactériens -> Multi-infections -> Transmission verticale : héritabilité de communautés bactériennes Symbiotes primaires -> Obligatoires : symbiotes nutritionnels Symbiotes secondaires -> Facultatifs : grande diversité d effets phénotypiques -> Influence de la composition symbiotique sur le phénotype de l hôte -> Phénotype étendu : génome hôte + génome(s) bactérie(s) + interactions Projet: mise au point d une technique d exploration et de caractérisation de la diversité symbiotique à large échelle et sans a priori
Contexte biologique Exploration et caractérisation de la diversité symbiotique au niveau individuel à grande échelle - Séquençage + Facile (grandes séries possibles) - Cher (grandes séries) - Clonage, screening, puis séquençage si multi-infections (petites séries seulement) + Facile (grandes séries possibles) - PCR-RFLP + Pas cher (dépend enzyme) - Mise au point au cas par cas (parfois difficile) - Sous-estime la diversité : polymorphisme au niveau du site de restriction - Approche avec a priori + Pas cher (grandes séries possibles) - PCR spécifiques - Mise au point au cas par cas (Pas toujours possible) - Approche avec a priori
«HRM» : dérive la PCR quantitative en temps réel Principe de la PCR quantitative en temps réel 18 Cinétique d'amplification 16 14 Phase plateau Fluorescence (qté ADN) 12 10 8 6 Phase exponentielle 4 2 0 Phase de latence 2 5 8 11 14 17 20 23 26 29 32 35 38 41 44 47 50 53 56 59 62 Cycle Début de l amplification de l ADN Courbes de fusion -> Cinétique de dissociation des brins des produits PCR -> Validation de la spécificité du produit amplifié
Principe de la technique de HRM «High Resolution Melting» HRM = courbes de fusion améliorées -> Intercalant : saturation de l'adn double brin -> Cinétique plus fine -> Regroupements en clusters Tm + forme de la courbe
Principe de la technique de HRM «High Resolution Melting» - Détection et identification des mutations de gènes impliqués dans certaines maladies, SNPs... (outil diagnostic). - Détection de nouveaux variants viraux et bactériens But du projet : Développer cette technique dans un contexte écologique pour étudier la diversité des endosymbiotes dans les populations naturelles d insectes
Infections par différentes espèces bactériennes Modèle : Bemisia tabaci Insecte polyphage, ravageur de cultures (liste IUCN) Cardinium Symbiote primaire -> Bactérie Portiera Classe γ - protéobactérie Wolbachia Hamiltonella γ - protéobactérie Arsenophonus γ - protéobactérie Symbiotes secondaires Wolbachia Cardinium α - protéobactérie Bacteroidetes Prévalence : >95% Multi-infections : >45% Rickettsia Fritschea α - protéobactérie Chlamydia Hamiltonella Arsenophonus Nécessite l utilisation d amorces qui amplifient l ensemble des symbiotes secondaires de B. tabaci et seulement eux -> problèmes de spécificité -> trop de variabilité
Etude de la diversité des souches de Wolbachia Wolbachia - Bactérie intracellulaire présente chez de nombreux invertébrés ( 66% des espèces d arthropodes) - Nombreux cas d infection multiple -> lignées présentant différents statuts d infection Cible : Gène wsp (Wolbachia Surface Protein) 611pb HVR1 HVR2 HVR3 HVR4 Amorces 81F 2bF2 2R 3bF 3R 691R Région1 290pb Amplicons Région2 266pb Région3 269pb
Echantillonnage Espèce hôte Classe/Ordre Souche(s) de Wolbachia wlhet1 Leptopilina heterotoma Asobara tabida Insecte/Hyménoptère Insecte/Hyménoptère wlhet1, wlhet2 wlhet1, wlhet3 wlhet1, wlhet2, wlhet3 watab3 watab1, watab3 watab2, watab3 watab1, watab2, watab3 Asobara japonica Insecte/Hyménoptère wajap Drosophila simulans Drosophila melanogaster Sitophilus Oryzae Sitophilus Zeamais Phlebotomus papatasi Phlebotomus duboscqui Phlebotomus longicornis Bemisia tabaci Zygiella sp. Insecte/Diptère Insecte/Coléoptère Insecte/Diptère Insecte/Hémiptère Arachnide/Araneae wri wmel wsoraus wszeareu wphleb-m4 wphleb-54d wphleb-31f wbem1 wbem2 wzyg-i96 wzyg-im37
Cas des mono-infections Espèce hôte D. simulans Population Souche dewolbachia Résultat HRM Mozambique wri Cluster 1 Antibes (France) wri Cluster 1 Bordeaux (France) wri Cluster 1 Chicharo (Espagne) wri Cluster 1 Tokyo (Japon) wri Cluster 1 L. heterotoma Laboratoire wlhet1 Cluster 1 A. japonica Kagoshima wajap Cluster 2 HiroN wajap Cluster 2 SendN wajap Cluster 2 S. Oryzae Australie wsoraus Cluster 3 S. Zeamais Ile de la Réunion wszeareu Cluster 3 B. tabaci Zygiella sp. N 195 - Grèce wbem1 Cluster 4 N 160 - Grèce wbem1 Cluster 4 N 152 - Grèce wbem1 Cluster 4 N 153 - Grèce wbem1 Cluster 4 N 151 - Grèce wbem2 Cluster 5 N 195 Grèce wbem2 Cluster 5 N 160 Grèce wbem2 Cluster 5 N 152 Grèce wbem2 Cluster 5 N 153 Grèce wbem2 Cluster 5 N 169 Grèce wbem2 Cluster 5 N 159 - Grèce wbem2 Cluster 5 I96 wzyg-i96 Cluster 6 IM37 wzyg-im37 Cluster 6 wsp wbem1 / wbem2 : 2nt sur 611 (99.64% identité)
Cas des multi-infections Seuil de détection de la 2 ème souche Test : dilutions de 2 souches de Wolbachia 10% 40% Proportion des 2 souches de Wolbachia Résultat HRM wau wri Région 1 Région 2 Région 3 Totalité 0 1 Cluster 1 Cluster 1 Cluster 1 Cluster 1 0.1 0.9 Cluster 1 Cluster 1 Cluster 1 Cluster 1 0.2 0.8 Cluster 1 Cluster 1 Cluster 1 Cluster 1 0.3 0.7 Cluster 1 Cluster 1 Cluster 1 Cluster 1 0.4 0.6 Cluster 2 Cluster 1 Cluster 1 Cluster 2 0.5 0.5 Cluster 2 Cluster 1 Cluster 1 Cluster 2 0.6 0.4 Cluster 3 Cluster 1 Cluster 1 Cluster 3 0.7 0.3 Cluster 4 Cluster 1 Cluster 2 Cluster 4 0.8 0.2 Cluster 4 Cluster 1 Cluster 3 Cluster 5 0.9 0.1 Cluster 5 Cluster 2 Cluster 3 Cluster 6 1 0 Cluster 5 Cluster 2 Cluster 3 Cluster 6 Pb. affiliation -> quand les proportions relatives sont très différentes, certaines souches ne sont pas détectées Résultats non symétriques -> détection préférentielle d une souche (wri)? -> dans les échantillons naturellement multi-infectés (trois souches présentes) : OK
Bilan Mono-infections : Fiable, reproductible et discriminante -> Permet d identifier les souches présentes par rapport à des références -> Permet de détecter la présence de nouvelles souches (méthode sans a priori) Multi-infections : risque de sous-estimer la diversité Problème quand proportions des souches bactériennes très différentes Même problème rencontré avec les autres techniques utilisées actuellement Méthode sans a priori permettant le screening de la diversité des souches d une espèce bactérienne dans les populations naturelles