Mécanismes moléculaires de la chimio- résistancede Plasmodium falciparumet nouvelles stratégies thérapeutiques Abdoulaye Djimdé Pharmacien Microbiologiste Université de Bamako, Mali
DHFR & DHPS 2
Molecular mechanism of SP resistance dhfr: PetersonDS et al. Evidence that a point mutation in dihydrofolate reductase-thymidylate synthase confers resistance to pyrimethamine in falciparummalaria. Proc Natl Acad Sci U S A 85:9114-9118, 1988. Dhps: Brooks DR et al. Sequence variation of the hydroxymethyldihydropterin pyrophospohkinasedihydropteroate synthase gene in lines of the human malaria parasite, Plasmodium falciparum, with differing resistance to sulfadoxine. Eur J Biochem 224:397-405, 1994. 3
59 51 MTX NADP 108 164 16
Sample collection on filter papers for molecular analysis -Finger prick blood spotted onto filter paper -Sample was air-dried -Storage at room temperature Sample ID -Shipment in luggage or by regular mail -DNA extracted by simple methods for molecular analysis 6
PCR detection of dhfr 108 polymorphisms AMP1 SP1 108 DIA3 DIA9 DIA12 AMP2 DIAGNOSTIC PCR PCR1: AMP1+AMP2 PCR2: SP1+DIAx 7
Nested MS-PCR Plowe et al., AJTMH, 1995 8
Pyrimethamine resistance rate in 4 sites of Mali 60 50 40 30 20 10 Asn-108 0 Kolle Bougoula Bandiagara Mopti Plowe et al., AJTMH, 1996
DHFR mutations and pyrimethamine resistance 100 80 40 20 0 108 51 59 164 60 51 Day 0 infections village-wide (N=120) Breakthrough infections (N=52) Doumbo et al., JID, 2000
DHFR mutations and pyrimethamine Conclusions resistance Pyrimethamine is strongly selective for DHFR mutations DHFR mutants arise very quickly under drug DHFR mutants arise very quickly under drug pressure, even when undetectable in the initial infection
Molecular markers of SP resistance 12 Adapted from P. Wang et al. :Molecular and Biochemical Parasitology 89 (1997) 161 177
Molecular markers of SP resistance Logistic regression showed that the 2 sets of mutations (DHFR 108+51+59 and DHPS 437+540) interact and that the presence of all 5 mutations (the quintuple mutant) was most strongly associated with treatment failure Kublin et al., JID, 2002. 13
Spread of SP resistant parasites 14
A Shared Asian Origin of the Triple-Mutant dhfr Allele in Plasmodium falciparum from Sites Across Africa Oumou Maïga,1,2 Abdoulaye A. Djimdé,2 Véronique Hubert,3 Emmanuelle Renard,1 Agnès Aubouy,4 Fred Kironde,5 Basile Nsimba,6 Kwadwo Koram,7 Ogobara Doumbo,2 Jacques Le Bras,1,3 and Jérôme Clain,1 1 EA209, Université Paris 5 Descartes 2 MRTC, Université de Bamako 3 CNR Paludisme, Hôpital Bichat Claude Bernard, Paris 4 IRD Cotonou, Benin. 5Makerere University, Kampala, Uganda. 6 NMCP Brazzaville, Congo. 7Noguchi Memorial Institute for Medical Research, Accra, Ghana Maiga et al. JID, i2007 15
Molecular Mechanism of Pyrimethamine Resistance : séquence codante dhfr ts Génotype, en Afrique Sauvage Simple mutant Double mutant 1 Double mutant 2 Triple mutant 51 59 108 N N I N I C C C R R S N N N N 16
Single origin of dhfrtriple mutant : microsatellite : séquence codante dhfr ts 51 59 108 +0.5 +6 +10 kb Roper 2003 17
Origin of samples 18
Méthodes Extraction de l ADN : méthode au methanol, Qiagen Génotypage dhfr (codons 51, 59 et 108) : RFLP, PCR allèle spécifique, séquençage Génotypage de 4 marqueurs microsatellites à proximité du gène dhfr par PCR multiplex : -3.9, -0.1, +0.5, +1.5 Taille (pb) + 0.5-0.1-3.9 + 1.5 Distance par rapport à dhfr (kb) Analyse de fragments sur séquenceur ABI PRISM 3100 (GENESCAN) 19
Résultats dhfr triples mutants dhfr sauvages -3.9-0.1 +0.5 +1.5-3.9-0.1 +0.5 +1.5-3.9-0.1 +0.5 +1.5-3.9-0.1 +0.5 +1.5 F C M 2 9 1 9 4 1 4 7 1 0 5 2 0 2 T H A I BENIN GUINEE GHANA SENEGAL COMORES OUGANDA CAMEROUN COTE D'IVOIRE GABON MALI CONGO 20
PfCRT story 21
Chloroquine resistance locus on Chr 7 22
Mutation Sites in the PfCRT Transmembrane Protein K76 H97 Q271 I356 R371 N75 M74 C72 N326 A220 COOH NH2 Fidock et al. (2000) Mol.Cell 6:861-871
Chloroquine Action & Resistance in the Parasite
What is the role of pfcrt in CQR in the field? 25
Kolle Bandiagara
METHODS Study type: Prospective chloroquine efficacy survey Study population:patients presenting to the clinic during the study period Inclusion criteria: 1. Live in study site since 6 months, 2. Aged 6 months, Axillary temperature 37,5 C, 3. P.falciparum mono infection (2000-200,000 Tf/mm 3 ), 4. No signs of severe or complicated malaria, 5. Consent of patient and/or is guardian. Follow up for 14 days : Collect filter paper and blood samples before and after CQ 27
PCR detection of pfcrt K76T polymorphisms P1 P3 D1 Apo1 P4-w P4-m D2 P2 DIAGNOSTIC PCR RESTRICTION PCR1: P1+P2 PCR2: P3+P4-w or P4-m PCR1: P1+P2 PCR2: D1+D2 Digestion with Apo1 28
Restriction digestion analysis of pfcrt K76T M 1 2 3 4 5 Dd2 3D7 C M 300bp 29
PfCRT 76T is associated with CQR in Mali Prevalence Prevalence in sensitive in resistant All ages Age < 10 Age > 10 Polymorphisms infections (n) infections (n) OR 95% CI P OR 95% CI P OR 95% CI P PfCRT T76 37.4% (107) 91.8% (61) 18.8 6.5 Š 58.3 <0.001 20.7 5.9 Š 80.3 <0.001 16.8 2.0 Š 373.3 0.001 Pgh1 Y86 49.0% (104) 75.4% (61) 3.2 1.5 Š 6.8 <0.001 3.5 1.4 Š 8.7 0.002 4.5 0.8 Š 32.9 0.05 CG2 37.1% (105) 71.4% (56) 4.2 2.0 Š 9.1 <0.001 4.8 1.8 Š 12.8 <0.001 2.5 0.6 Š 10.8 0.13 CG2 39.0% (100) 77.0% (61) 5.3 2.4 Š 11.5 <0.001 6.9 2.6 Š 19.0 <0.001 4.6 1.0 Š 24.8 0.02 T76 + Y86 21.6% (102) 72.7% (59) 9.8 4.4 Š 22.1 <0.001 13.3 4.5 Š 40.2 <0.001 12.5 2.1 Š 95.5 <0.001 T76 + Y86 + & 15.6% (90) 54.9% (51) 6.6 2.8 Š 15.9 <0.001 10.5 3.1 Š 37.7 <0.001 3.9 0.8 Š 20.8 0.06 Djimde et al. N Engl J Med, Vol. 344, No. 4 January 25, 2001 30
Could Pfcrt 76T be used as a tool for monitoring CQR in the field? 31
Prevalence of pfcrtt76 (resistant gene) higher than clinical resistance 100 90 80 70 60 50 40 Resistance Genotype 30 20 10 0 Mopti 97 Bgara 97 Bgara 98 Kolle 98 Kolle 99
Age-adjusted Genotype Resistance Index 33
Modèle GRI Exemple Mantérou 2000 GRI = P m /P DR => P DR = P m /GRI Mali: GRI = 2.1 P m = Prévalence du marqueur moléculaire P DR =Prévalence chimio-résistancein vivo GRI= Indice de la Résistance Génotypique Prév. moléculaire = 75.8% Rés. in vivo = 75.8/2.1= 36.1% 34
35
Resistant Sensitive Predicted Observed P Manterou (Dolo et al.) NS Bancoumana (Fofana et al.) NS Kangaba (Guindo et al.) NS Kolle 2002 (Maiga H. et al.) NS Sud de la Mauritanie (Jenilek et al., AJTMH, 2002) NS 36
Pilot implementation of GRI as a drug resistance surveillance tool in Mali 37
Kolle Bandiagara
A molecular map of CQR in Mali Djimde et al., 2009 39
40
Quinine and PfNHE story 41
Genetics of decreased susceptibility to quinine Ferdig et al., Mol Mic, (2004), 52 (4), 985-997 42
Pfnhe (Ferdig et al., 2004) 43
Artemisinin resistance?
Nouvelles stratégies de prise en charge du paludisme non compliqué au Mali
Bandiagara Koro Kolle Bougoula-Hameau
Prevalence de la Chloroquinoresistance au Mali 90 100 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Res. Totale Mopti 97 Koro 98 Donegue 98 Sotuba 98 Manterou 00 Kangaba 00 Faladje 00 Bgara 03 Bancou 03 Kolle 03 %
Combinaisons Thérapeutiques à base d Artémisinine (CTA)
Qu est-ce qu une combinaison thérapeutique CT avec des antipaludiques est l usage simultané de 2 ou plusieurs schizontocides sanguins ayant des modes d actions et des cibles biochimiques différents au niveau du parasite
Qu est-ce qu une combinaison thérapeutique (2) Combinaison libre = co-administration de deux mdcts distincts Combinaison fixe = co-formulation des deux Combinaison fixe = co-formulation des deux principes actifs sous une seule forme galénique
Pourquoi des combinaisons thérapeutiques? Prise en charge optimale du paludisme (Chimiorésistance) Protection des nouveaux antipaludiques Diminution de la transmission des parasites résistants
Pourquoi des combinaisons thérapeutiques? Prise en charge optimale du paludisme Protection des nouveaux antipaludiques Diminution de la transmission des parasites résistants
1 sur 10 12 parasites résistant au mdct A 1 sur 10 12 parasites résistant to drug B 1 sur 10 24 parasites résistant simultanément 1 sur 10 24 parasites résistant simultanément aux mdcts A et B
Pourquoi des combinaisons thérapeutiques? Prise en charge optimale du paludisme Protection des nouveaux antipaludiques Diminution de la transmission des parasites résistants
Evolution of gametocyte carriage by treatment arm on follow up days 50 45 40 35 30 25 AR_L AS/ AQ AS/ SP 20 15 10 5 0 D0 D3 D7 D14 D21 D28 Gametocyte carriage decreased following ACT treatment.
Artemisinine et ses derivés R R Derivé H- Dihydroartemisinin CH3- Artemether CH2CH3- Arteether NaOOC(CH2)2COO- Na Artesunate
Artemisinine et ses derivés Réduction rapide et substantielle de la biomasse parasitaire Efficace sur P. falci multi-résistant Portage de gameto Transmission? ½ vie trop courte (~ 3 H) Étroite fenêtre d activité (jeunes trophozoites) Taux de recrudescence en monotherapie Insuffisance de données chez la femme enceinte Faible toxicité?
Demi-vie d élimination de divers antipaludiques Artemisinine derivates Sulfadoxine Sulfalene Pyrimethamine Lumefantrine Amodiaquine Mefloquine 1-2 heures 100 400 heures 65 80 heures 80 95 heures 72 140 heures 216 720 heures ~ 480 heures
Combinaisons à base de derivés de l artemisinine (ACT)
CTAs sélectionnées par le PNLP Mali Artesunate/amodiaquine Artemether/lumefantrine
Inconvenient majeur des combinaisons: Le coût
Autres problèmes L observance Complexité du traitement surtout pour les combinaison libres Risque de monotherapie Risque de ttt incomplets Faible recul pour les nouvelles molécules et les nouvelles co-formulations Insuffisance de données Régionales et Maliennes Problèmes de déploiement de ces shémas souvent complexes dans les niveaux primaires de nos systèmes de santé
Etudes du MRTC
Efficacitéà J28des combinaisons thérapeutiques (sans correction moléculaire) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 RCPA AS+AQ AS+SP AS Coarinate Coartem
Efficacitéà J28des combinaisons thérapeutiques (avec correction moléculaire) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 RCPA+ AS+AQ AS+SP AS Coarinate Coartem
Conclusion Les combinaisons thérapeutiques représentent une chance à saisir pour améliorer le contrôle du paludisme en Afrique Mais
Problématique des CTA sur le terrain Besoin d une couverture d au moins 80% pour voir un impact réel Système de santé en Afrique couvre ~30 40% seulement de la population à risque Faut-il traiter le palu avec ou sans diagnostic biologique? Diagnostic + => coût additionnel des TDR Diagnostic (-) => accélération de la résistance
«Course contre la montre» Développement et propagation de la chimiorésistance à l artemisinine Développement de la contrefaçon Découverte de nouvelles molécules efficaces Déploiement à large échelle des CTA dans les zones les plus reculées Qui va remporter cette course????