CHAPITRE 3 LES MUTATIONS.

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CHAPITRE 3 LES MUTATIONS. 1. Introduction 1.1. Définition. Les mutations sont des changements brusques et d emblée héréditaires de l'information génétique. L'information héréditaire est normalement stable, elle est transmise de génération en génération de manière fidèle. Mais cette fidélité n'est pas absolue. Le système à la base de la transmission de l'information héréditaire est ce qu'on appelle la réplication. La réplication permet de faire à partir d'une molécule ADN une copie conforme (exacte). Cette copie est presque toujours conforme a la molécule originale, de sorte que le génotype reste constant de la fécondation jusqu à la mort. Mais il arrive que la réplication est accompagnée de quelques erreurs très rares aboutissant à des copies qui diffèrent du modèle original: ce sont les mutations géniques. En plus des mutations produites à la suite d'erreurs au niveau de la réplication, il y a différents agents de l environnement qui peuvent altérer la structure de la molécule d'adn et qui provoquent donc l'apparition des mutations. Ces agents peuvent êtres de différentes natures (physique, chimique ou même biologique). Ce sont les agents mutagènes. Le mot mutation est souvent employé dans un sens large pour designer non seulement les gènes ayant subi une altération interne, mais aussi les variations structurales des chromosomes. On distingue alors les deux catégories de mutations en qualifiant les premières de géniques et les secondes de chromosomiques. En plus de ces deux types de mutations, il existe une troisième catégorie dite mutation génomique où l'altération touche le nombre des chromosomes (variation numérique des chromosomes). 1.2. Mutations et phénotype. Tous les caractères héréditaires peuvent être touchés par les mutations. Ainsi il y a plusieurs sortes de mutations: morphologiques, physiologiques, biochimiques ou même psychologiques. Chez la drosophile par exemple, il existe des mutations qui touchent: la pigmentation des yeux ou du corps, les ailes, la répartition des soies, les caractères sexuelles, la fertilité, la longévité, les propriétés sérologiques, la réaction à la lumière, le comportement durant l accouplements... etc. 2

Les conséquences des mutations sur le phénotype varient des mutations dont l'effet sur le phénotype est imperceptible aux mutations dont l'effet est dramatique (modification radicale du phénotype). Les mutations peuvent toucher tous les types de cellules d'un organisme. Chez les métazoaires à reproduction sexuées, les mutations peuvent toucher soit des cellules somatiques soit des cellules germinales. Les mutations touchant les cellules somatiques sont transmises aux cellules filles (par suite de mitose), il en résulte qu'une partie des cellules expriment un phénotype mutant, ce qui donne les chimères ou mosaïques. Les mutations somatiques ne vont pas êtres transmis à la descendance et vont donc disparaître au plus tard avec la mort de l individu ou ils sont apparues. Mais les mutations qui touchent une cellule germinale peuvent être transmises à la descendance. Ces dernières sont les seules à pouvoir changer l hérédité dans une ligné ou une famille. Dans les tissus haploïdes les effets des mutations sur le phénotype peuvent être décelés dès l'apparition des mutations. Mais chez les diploïdes les mutations ne peuvent être décelées dans la descendance immédiate de l individu où elles sont apparues que si elles sont dominantes. Si elles sont récessives, elles ne seront décelées que quelques générations après leurs productions. Chez les polyploïdes les mutations sont décelées encore plus tardivement que chez les diploïdes. 1.3. Fréquences. Si on considère les fréquences des mutations au niveau d'un gène donné on constate que les fréquences sont généralement très basses. Cependant ces fréquences varient énormément d'un gène à un autre un sein d'une même espèce. Chez le Maïs par exemple, Stadler n'a pas observé une seule mutation du gène (Wx) en (wx) parmi 1 503 744 gamètes testés, alors que parmi 554 786 gamètes il a observé 273 mutations du gène (R) en (r). Mais si le taux de mutation des gènes est assez bas, le taux globale de l'ensemble des gènes est assez important. Si on prend l'exemple de Drosophila melanogaster, au moins 5 % des gamètes contiennent une nouvelle mutation à chaque génération. De la même façon que les fréquences des mutations varient énormément d'un gène à un autre au sein d'une même espèce, la fréquence globale des mutations par espèce varient énormément d'une espèce à une autre. 2. Nature des mutations. 2.1. Mutation ponctuelles. Ce sont des modifications qui touchent une seule paire de base à la fois ou un nombre très faible de paires de bases. Ce sont donc des mutations géniques. Il y a deux types de mutations ponctuelles: les substitutions et les délétions/additions. 3

2.1.1. Substitutions. C'est le changement d'une paire de base par une autre. Au niveau de la molécule d'adn quatre types de bases sont présentes: - La cytosine et la thymine qui sont des pyrémidines - La Guanine et l Adénine qui sont des purines. Quand la substitution consiste en le changement de purines par des purines (exemple A---G ou G---A) ou le changement d une pyrémidine par une pyrémidine (T--- C ou C---T), on dit que c'est une transition. Quand la substitution consiste en le changement d'une purine par une pyrimidique (G---T ou A----C...) ou inversement changement d'une pyrimidine par une purine (T---A ou T----G...), on dit que c'est une transvertion (figure 3.1). Les substitutions de bases conduisent à des mutations qui peuvent avoir des conséquences différentes au niveau du phénotype. On distingues trois types de mutations par substitutions selon leur conséquence au niveau de la protéine et donc au niveau du phénotype. -mutation silencieuse: le changement au niveau du génome est imperceptible au niveau du phénotype car le changement de l aminoacide, induit par la substitution au niveau de la protéine, n'a pas d'effet sur l'activité de cette dernière. L'absence du changement au niveau du phénotype peut être dû au fait que le codon initiale et le codon mutant codent tous les deux pour le même aminoacide (figure 3.2). Figure 3.1. Les différents types de mutations par substitution. 4

séquence génique séquence ARNm séquence protéique Sauvage AAC UUG Lys Mutant AAT UUA Lys Figure 3. 2. Mutation silencieuse: changement de l'information au niveaux du génotype sans effet sur le phénotype (le code génétique est dégénéré c'est à dire qu'un aminoacide peut être codé par plusieurs codons différents). Lys: lysine. -Mutation faux sens (missense): le codon mutant spécifie un aminoacide diffèrent de celui spécifié par le codon initiale. L'effet de ce changement au niveau du phénotype dépend de la nature de l aminoacide échangé, par rapport à celui d'origine (aminoacide de même groupe chimique ou nom: aminoacide acide, basique ou neutre), et de l'emplacement de l aminoacide échangé (cite actif de l'enzyme ou en dehors du cite actif). Selon la nature chimique de l aminoacide mutant et son emplacement au niveau de la protéine le résultat peut être une enzyme mutante inactive, moins efficace ou thermosensible (figure 3.3). séquence génique séquence ARNm séquence protéique Sauvage CAA GUU Val Mutant GAA CUU Leu Figure 3. 3. Mutation faux sens (missense). La mutation a pour conséquence le changement d un aminoacide par un autre au niveau de la protéine codée par le gène. - Mutation non-sens (non sense): les mutations non-sens consistent en la transformation du codon initiale en l'un des trois codons non-sens (UAG, UAA ou UGA) qui ne codent pas l aminoacide et détermine la fin de la synthèse protéique. Les effets des mutations non-sens sur le phénotype sont beaucoup plus dramatiques que les mutations faux-sens. Les mutations non-sens provoquent l arrêt prématuré de la synthèse protéique ce qui aboutit à des protéines tronquées qui sont de plus souvent inactives. Le phénotype mutant va dépendre de la position des mutations: plus la position de la mutation est proche du codon d'initiation de la traduction, plus son effet est dramatique sur le phénotype. 5

2.1.2. Délétion ou addition. Dans ce type de mutation nous avons un ajout (addition) ou une diminution (délétion) d'un petit nombre de paires de bases.il existe deux types de mutations selon le nombre de nucléotides ajoutés ou supprimés: soit ce nombre est un multiple de 3 soit non multiple de 3. Pourquoi multiple de 3? Il faut rappeler ici le code génétique est composé d'unité de base qui sont les codons. Un codon est formé de 3 nucléotide. Si le nombre de nucléotides supprimés ou ajoutés à une séquence est un multiple de 3, il y aura an niveau de la protéine un ajout ou une diminution d'un certain nombre d aminoacides. Mais si le nombre de nucléotide ajoutés ou supprimés n'est pas un multiple de 3, il y a changement du cadre de lecture du message existant dans l'adn, et donc aussi dans la partie correspondante dans l'arnm. Ceci se traduit au niveau de la protéine par un changement de toute la séquence qui est en avale de la mutation. C'est ce qu'on appelle des mutation de décalage "frame shift". Le décalage du cadre de lecture aboutit très fréquemment à l'apparition de codon stop (UAG,UAA ou UGA) ce qui provoque l arrêt de la traduction et donne donc des protéines tronquées (figure 3.4). a) Séquence... Leu His Pro Asn Asp Leu Lys..... protéique mutée ARNm mutant par..... CUU CAU CCU AAU GAU UUA AAG...... addition (3 bases) addition Séquence... Leu His Asn Asp Leu Lys.... protéique sauvage ARNm sauvage...... CUU CAU AAU GAU UUA AAG...... CCU délétion b) ARNm mutant par...... CUC AUA AUG AUU UA A AG...... substitution Décalage du cadre de lecture provoquant un arrêt prématuré de la traduction. Séquence protéique... Leu Ile Met Ile stop mutée par substitution Figure 3. 4. Mutation par addition ou substitution. a) mutation sans décalage.(b) mutation par décalage du cadre de lecture (frame shift). 6

2.2. Mutation par insertion. Depuis les années trente nous savons qu'il existe des éléments génétiques mobiles appellées aussi transposons. La mobilité de ces séquences fait qu'ils changent fréquemment leurs places et vont s'insérer dans d'autres endroits du génome. Lorsqu un transposon s insère au milieux d'un gène, ceci provoque une interruption de la séquence qui induit un phénotype mutant (figure 3.5). Sauvage Promoteur ATG TAA Mutant Promoteur ATG transposon TAA Figure 3. 5. Mutation par insertion. 2.3. Mutations chromosomiques. Les mutations chromosomiques sont des altération majeures des chromosomes. Elles touchent la structure des chromosomes, et touchent donc plusieurs gènes à la fois. Il existe quatre types de mutations chromosomiques (figure 36). - Les délétions ou déficiences: disparition d'un segment du chromosome. - Les duplications: dédoublement d'un segment du chromosome. - Les inversions: un segment du chromosome trouve son orientation par rapport au reste du chromosome changé. - Les translocations: c'est un échange de segment de chromosome entre deux chromosomes non homologues. Quand il y a un échange réciproque de segments entre deux chromosomes c est une translocation réciproque. 7

A B C D E F G H I J K L A B C D E F G H I J K L Sauvage. A B E F A B C D E F Déficience. A B C D C D E F Duplication. A B C D E F Inversion. G J I H K L G H I J K L A B C D K L A B C D E F G H I J E F G H I J K L Translocation réciproque. Figure 3. 6. Les quatre types de mutations chromosomiques. 3.2.3.1. Chromosomes géants. L'étude des mutations chromosomiques a été beaucoup facilité par l existence chez certaines espèce de dipter (plus spécialement chez Drosophila melanogaster) de ce qu'on appelle des chromosomes géants. Chez la drosophile les chromosomes géants se trouvent au niveau des cellules des glandes salivaires des larves La structure et l'origine de ces chromosomes peuvent être interprétées selon la théorie la plus vraisemblable, celle de la nature polythénique des chromosomes géants. Chez les dipters, les chromosomes homologues des cellules somatiques sont rapprochés les un des autres au lieu d'être distribués au hasard comme dans les cellules somatiques des autres organismes, ainsi qu'on peut le voir dans les cellules de glandes salivaires de Drosophila melanogaster (Figure 3.7.). 8

Figure 3. 7. Représentation schématique des chromosomes géants de Drosophila melanogaster. Les chromosomes sont formés de deux types de structures. La partie du chromosome qui est condensée par augmentation du nombre de spirales de la molécule d'adn et donc bien individualisée, est dite partie euchromatique. La partie non individualisée est l'hétérochromatine. Les parties hétérochromatique des quatre paires de chromosome sont réunies pour former une structure diffuse: le chromocentre. Le chromosome Y est formé presque entièrement d héterochromatine, c'est pour cela qu'on ne voit qu'une petite partie (euchromatine), le reste du chromosome est noyé dans le chromocentre. Le chromosome Y est très petit. Les régions centromériques des quatre paires de chromosomes sont hétérochromatiques, c'est pour cette raison qu'on ne peut pas suivre un chromosome d'un bout à l'autre. Pour la paire II et III on les extrémités des deux bras sont euchromatiques. Pour les paires de chromosome I (X X, X Y) et IV, un seule bras est visible par ce que le deuxième est complètement hétérochromatique est noyée dans le chromocentre. C'est le phénomène de l appariement somatique, les deux homologues sont appariés comme durant la prophase de la méiose. Chacune des deux glandes salivaires d'une larve de drosophile compte de 100 à 120 cellules. Toutes ces cellules sont formées au début de la période de développement embryonnaire. Après cette période le nombre de cellules reste constant, mais le volume de chacune et son noyau augmente considérablement. Au cours de cette phase d accroissement il y a plusieurs cycles successifs d'endomitoses, c'est à dire de duplication des chromosomes à l'intérieur d'une membrane nucléaire intact. Ce qui fait que le diamètre des chromosomes double à chaque cycle d'endomitose par appariement des nouvelles copies synthétisées. Donc les chromosomes géants sont formés par plusieurs filaments appariés d'où leur appellation par: "chromosome polythène" (ploy = plusieurs et thène = filaments). L'étude cytologique de ces chromosomes a montré qu'ils sont différenciés longitudinalement par la succession de bandes sombres et de bandes claires de différentes 9

épaisseurs. Les bandes sombres sont des régions du chromosome qui absorbent fortement le colorant (utilisé dans l'étude cytologique). Les bandes claires n'absorbent pas le colorant. Les bandes sombres forment les chromomères. Le long d'un chromosome il y a une succession de chromomères de différentes épaisseur (figure 3.9. et 3.10). Figure 3.8. Interprétation de la structure des chromosomes polythène de diptères. Figure 3. 9. Chromosomes géants des cellules des glandes salivaires de larves de Drosophila melanogaster. 10

Comme la structure de ces chromosomes est constante, mais qu'elle varie d'un chromosome à l'autre, et d'une espèce à l'autre, les généticiens ont pu préparé des cartes des chromosomes des glandes salivaires de plusieurs espèces de diptères. Les mieux connues sont évidement les cartes des chromosomes de Drosophila melanogaster qui furent préparées par Bridges (1935). 2.3.2 Déficiences ou délétions. La déficience qui consiste en la perte d'un segment de chromosome implique qu'il y a perte d au moins quelques gènes (le nombre de gènes dépend de la taille de la déficience et de l'endroit auquel elle s'est produit). Ceci implique que les déficiences soient le plus souvent non viable à l'état homozygote (plus la taille de la déficience est grande plus elle a des chances d'être létale à l'état homozygote). Les déficiences sont souvent à l'état hétérozygote. Lorsqu'elles sont petites et que les parties déficientes (absentes) ne contiennent pas de gènes essentiels à la viabilité. Il faut noté cependant que des segments relativement longs et même des chromosomes entiers peuvent manquer lorsqu'ils sont inertes (contiennent des gènes inactifs ou presque exemple de mâles XO qui sont viables). Lorsqu'un individu est hétérozygote pour une déficience, le chromosome déficient est plus court que son homologue, si la partie absente est relativement longue. Du faite que appariement des chromosomes ne se fait qu'entre partie strictement homologue, lorsque ces deux chromosomes s'apparieront, la partie du chromosome non déficient, qui correspond à la partie absente du chromosome déficient n'aura pas d'homologue dans ce dernier et formera une boucle qui sera visible au microscope au stade pachyténe, ou dans les noyaux des glandes salivaires, s'il s'agit d'un diptere. C D E A B F G H I Chromosome sauvage A B F G H I Chromosome déficient Figure 3.11. Déficience à l'état hétérozygote (formation d'une boucle). 2.3.3. Duplication. Les duplications, bien qu'elles correspondent à un ajout de matériel héréditaire, peuvent donner un phénotype mutant. L'exemple de la duplication de la sous-section 16A du chromosome "X" de Drosophila illustre ce qu'on vient de dire. Cette duplication donne le phénotype mutant dit barre, qui correspond à des yeux réduites. 11

Il existe plusieurs types de duplications, et qui peuvent être intrachromosomiques, interchromosomiques ou libres (Figure 3.12). -Duplication intrachromosomique: le segment dupliqué est contenue dans le chromosome qui contient les gènes en duplication. -Duplication interchromosomique: le segment dupliqué est incorporé dans un chromosome non homologue. -Duplication libre: le segment dupliqué a son propre centromère. Il y a donc formation d'un petit chromosome supplémentaire. A B C D C D E F A B C D E F Duplication intrachromosomique (en tandem). G H I J K C DD L G H I J K L Duplication interchromosomique. A B C D E F A B C D E F C D Duplication libre. Figure 3.12. Les différents types de duplications Les duplications en tandem à l'état homozygote peuvent aboutir à un mauvais appariement (figure 3.13), qui peut produire une triplication. Pour illustrer ce phénomène prenons l'exemple de la mutation Bar. La mutation Bar est due à une duplication en tandem de la sous section 16A du chromosome X de Drosophila melanogaster. Lors du croisement d une femelle Bar homozygote avec un mâle sauvage, la descendance obtenue comporte en plus des mâles Bar normalement attendus, des mâles sauvages et des mâles qui ont un phénotype Bar très prononcé (ultrabar). L examen cytogénétique des mâles ultrabar, montre qu'ils ont une triplication de la région 16A. L'apparition des mâle sauvages (Bar réversés) et des mâles ultrabar est due à un mauvais appariement des chromosomes de la femelle (figure 3.13). 12

a) Appariement normal f 16A 16A fu + 16A 16A + b) Mauvais appariement 16A f 16A fu crossing-over + 16A + 16A c) Résultats du mauvais appariement suivi d un crossing-over Retour à l état sauvage (réversion) + 16A fu Triplication f 16A 16A 16A + Figure 3. 13. Appariement anormal des régions dupliquées des chromosomes X d'une femelle homozygote Bar de Drosophila. Les marqueurs f et fu permettent de préciser le mécanisme qui fait apparaître la triplication et disparaître la duplication. 2.3.4. Translocations. Les translocations, comme les inversions bien qu'elles ne correspondent pas à une perte ou une addition de matériel héréditaire (il y a seulement changement de place pour certains gènes), donnent des phénotypes mutants. Certains des phénotypes mutants induits par les inversions ou les translocations, peuvent être expliqués par l'effet de position. L'effet de position est le fait qu'un gène actifs peut devenir inactif s il change sa place (soit dans le même chromosome soit dans un autre chromosome non homologue. Trois types de translocation sont mentionnés dans la littérature. Les translocation simples, les Shifts" et les translocations réciproques (figure 3.14). 13

- La translocation simple implique le transfert d'une partie terminale d'un chromosome à l'une des extrémités d'un autre chromosome. Cette opération ne requiert qu'une seule fracture. - Le Schift" implique le transfert d'un segment interstitiel d'un chromosome à un autre lieu, dans le même chromosome ou dans un autre chromosome. Cette opération requiert trois fractures. - Translocation réciproque, consiste en un échange de segments terminaux entre deux chromosomes non homologues, ce qui nécessite deux fractures. A B C D E F Sauvage G H I J K L C D E F A B G H I J K L Translocation simple C D E F G H A B I J K L Shift A B C D K L G H I J Translocation réciproque E F Figure 3.14. Les différents types de translocations. Les translocations peuvent aboutir à la diminution du nombre de chromosomes au niveau d'une cellule par suite de fusion Robertsonnienne (Figure 3.15). Quand un chromosome, qui contient un segment transloqué, s'apparie avec un chromosome non homologue mais qui contient l'homologue du segment transloqué, si un crossing-over a lieux, une fusion se produit entre ces deux chromosomes (figure 3.15). 14

Crossing-over Chromosome transloqué Chromosome sauvage Dissociation (b) Perdu (a) Fusion Crossing-over Chromosome issu de la fusion Figure 3. 15. Fusion Robertsonnienne obtention d'un chromosome métacentrique par fusion de deux chromosomes acrocentriques (a). Cette fusion est réversible: dissociation (b). Ces deux phénomènes nécessitent une translocation réciproque. 2.3.5. Inversions. Elles peuvent être simples, où un seule segment est impliqué: comme elles peuvent être complexes où plusieurs segments sont impliqués (figure 3.16). Les inversion simples peuvent êtres: - paracentrique ; le segment inversé ne contient pas le centromère. - pericentrique: le segment inversé contient le centromère. Les inversions complexes peuvent êtres: - Indépendantes: les deux segments inversés sont totalement indépendants - Chevauchantes: les deux segments inversés sont chevauchants. Une partie du chromosomes est doublement inversé. - Incluses: un des segment inversé est totalement inclus dans une deuxième inversion. 15

INVERSIONS SIMPLES A B C D E F Paracentrique G H I J K L Péricentrique A D C B E F G H K J I L INVERSIONS COMPLEXES A B C D E F G A C B D F E G Indépendantes A B C D E F G A E D C B F G A E D F B C G Chevauchantes A B C D E F G A F E D C B G Incluses A F C D E B G Figure 3. 16. Les différents types d inversions. 16

Les inversions comme les déficiences peuvent être reconnues à l'examen cytogénétique des chromosomes des glandes salivaires de Drosophila, par la formation d'une boucle à l'état hétérozygote. La boucle formée par l inversion contrairement à celle formée par la déficience est double (figure 3.17). Boucle double Boucle simple Inversion hétérozygote Déficience hétérozygote Figure 3.17. Mise en évidence de mutations chromosomiques par observation des chromosomes polythénique (cellules des glandes salivaires des larves de Drosophila melanogaster). Les inversions paracentriques sont connues pour êtres des supresseurs de crossing-over. Les inversions n'empêchent pas la formation de crossing-over, mais ce sont les chromatides recombinées qui sont soit acentromériques (ne contiennent pas de centromères) ou dicentriques (ont deux centromères), ce qui fait que ces chromatides ne sont pas incorporées dans les gamètes et sont perdues (figure 3.18). La chromatide dicentrique peut être cassée et les deux chromatides qui en résultent peuvent être incorporées dans des gamètes. Mais même dans ce dernier cas ces chromatides, issues de la cassure de la chromatide soeur, sont déficientes et les gamètes qui les contiennent ne sont pas viable. Donc il n y aura que des gamètes qui contiennent les chromatides parentales. Donc les séquences géniques qui se trouvent à l'intérieur des limites d'une inversion, chez l hétérozygotes d'inversion, sont protégées et se perpétuent sans modification (figure 3.18). 17

A B C D E A D C B E Chromosome normal Chromosome inversé B C Appariement C A B D E D A Ségrégation à la division I de la méiose E A B C D E A B C D E A A fragment acentrique B B (perdu) C C E D D D C cassure E B A aléatoire A A D C B E Ségrégation à la division II de la méiose A B C D E Produit normale A B C D Produit délaité A Produit délaité A D C B E Produit inversé A D C B E Figure 3. 18. résultats d un crossing-over simple dans une inversion à l état hétérozygote. 18

2.4. Mutations génomiques. Le génome bien qu'il est remarquablement stable, on constate qu'il peut subir un grand nombre de modifications (quand on fait l'examen chez un grand nombre d'individus). En plus des modifications structurales des chromosome (voir paragraphe précèdent), il existe des modifications touchant le nombre des chromosomes: mutations génomiques. Il y a deux grands groupes de mutation génomiques (figure 3.19). - Mutations Euploïdes: ce sont des variations numériques touchant de la même façon toute la garniture chromosomique (chaque chromosome a subit la même variation numérique). - Mutations Aneuploïdes: ce sont des variations numériques chromosomiques, mais qui ne touchent pas de la même façon tous les chromosomes. 1) EUPLOÏDES MUTATIONS GENOMIQUES A B C N= 3x 1 Monoploïde A1 B1 C1 N= 3x 2 A2 B2 C2 Diploïde A1 B1 C1 N= 3x 3 A2 B2 C2 Triploïde A3 B3 C3 etc... Polyploïde N= 3x n n > 2 2) ANEUPLOÏDES A1 B1 C1 A2 C2 N= 6-1 Monosomique A1 B1 A2 B2 N= 6-2 Nulisomique A1 B1 C1 A2 B2 C2 N= 6 + 1 Trisomique B3 A1 B1 C1 C2 N=6-1-1 etc.... Double Monosomique Figure 3. 19. Quelques exemples de mutations génomiques. N est le nombre somatique des chromosomes. 19

2.4.1. Haploïdie et polyploïdie. Chez les eucaryotes la majorité des organismes à reproduction sexuée sont diploïdes. Mais chez ces organismes l haploïdie représente une phase normale du cycle de vie (le cycle de vie pressente deux phase: l'une diploïde et l'autre haploïde). Chez certains espèces la phase diploïde est prépondérante et la phase haploïde est très réduite (c'est le cas de la drosophile des mammifères y compris l'homme). Ces espèces sont dites diplobiontiques. Chez d'autre espèces, la phase haploïde est prépondérante et la phase diploïde est très réduite, c est le cas de nombreux organismes inférieurs (Algues, mousses et champignons). Ces espèces sont dites haplobiontiques. 2.4.1.1. Haploïdie (Monoploïdie). On rencontre assez souvent chez certains groupes d invertébrés (par exemple ordre des héminoptères), des espèces ou le sexe femelle est diploïde alors que le sexe mâle est monoploïde (il est préférable d utiliser le terme monoploïdie que haploïdie pour indiquer qu'il ne s'agit pas de la phase haploïde normal du cycle vitale). Les monoploïdes se développent à partir d'un gamète femelle, sans qu'il y ait fécondation, par un processus nommé parthénogenèse dans le cas des abeilles, hyménoptères sociaux, les monoploïdes sont des mâles ou faux bourdons, alors que les individus résultants de la fécondation sont des femelles. 2. 4. 1. 2. Polyploïdie. La polyploidie est connue dans le monde végétal et animal. Elle est plus rare dans le règne animal, et y a été découvert plus tardivement. Les exemples les plus connus de polyploïdie sont dans le règne végétal. Quand la polyploïdie existe dans certains groupes, comme les mousses, les pteridophyte et les Angiospermes, le nombre de chromosomes qui constituent le génome des espèces, appartenant au même genre, varie d'une espèce à l'autre et ces nombres sont des multiples d'un même nombre de base (Tableau 3.1). Cette variation en termes de multiples a conduit à l'hypothèse de la polyploïdie, qui veut qu'a l'intérieur d'un groupe, le plus souvent un genre, les nombres les plus élevés soient dérivés des nombres moins élevés. Les mécanismes qui permettent d'obtenir les séries polyploïdes (les espèces appartenant à un même genre et ayant un nombre chromosomique qui est multiple d'un même nombre constituent une série polyploïdes) sont le dédoublement du nombre de chromosome et les croisements interspecifiques. Pour illustrer cela prenant l'exemple de la série polyploïde que constituent les différentes espèces appartenant au genre Triticum (figures 3.20). Genre Nombre somatique Nombre de base des chromosomes Triticum (blés) 14 / 28 / 42 7 Trillium 10 / 20 / 30 5 Drosera Rhododendron 20 / 30 / 40 / 60 / 80 26 / 39 / 52 / 78 / 104 / 156 10 13 Tableau 3. 1. Exemples de genres dont les espèces ont des nombres de chromosomes qui sont tous multiples d un même nombre de base. 20

Croisement interspécifique Blé diploïde sauvage Triticum monococcum A A (14) Blé diploïde sauvage inconnu peut être Triticum searsii?? B B (14) Hybride A B (14) Croisement interspécifique Blé diploïde sauvage Triticum tauschii D D (14) (x2) Dédoublement du nombre chromosomique Blé tetraploïde sauvage Triticum turgidum A A B B (28) Hybride A B D (21) (x2) Dédoublement du nombre chromosomique Blé hexaploïde Triticum aestivum A A B B D D (42) Figure 3. 20. Formation de polyploïdes à partir des diploïdes par croisements interspécifiques et dédoublement du nombre chromosomique. Espèce Nombre somatique Degré de ploïdie des chromosomes (2n) T. monococcum 14 2 X = 2 x 7 diploïde T. tauschii 14 2 X = 2 x 7 diploïde T. turgidum 28 4 X = 4 x 7 tétraploïde T. aestivum 42 6 X = 6 x 7 hexaploïde Tableau 3. 2. Nombres chromosomiques somatiques et degré de ploïdie des espèces du genre Triticum (nombre de base X = 7). 21

Lorsqu'un groupe a suffisamment été étudié pour qu'on puisse connaître avec certitude le nombre qui semble être à l'origine des autres (c'est à dire trouvé le nombre de chromosomes de l'espèce diploïde), ce nombre est dit nombre de base. Une fois ce nombre de base est connu, il est possible de déterminer pour chaque espèce constituant la série polyploïde, le degré de ploïdie (Tableau 3.3.). Il existe deux catégories principales de polyploïde: - Les autopolyploïdes: le complément chromosomique est constitué par le génome d'une seule espèce, qui est représenté cependant 3 fois ou plus (exemple espèce de blé tétraploïde AAAA). - Les allopolyploïdes: le complément chromosomique est constitué par le génomes d au moins deux espèces différentes (exemple espèce de blé hexaploïde AA BB DD). 2. 4. 1. 3. Formation des polyploïdes. Le dédoublement du nombre de chromosomes se fait spontanément dans la nature par deux mécanismes: - Dédoublement somatique du nombre de chromosome: Il arrive qu'au cours de la mitose, au niveau de tissus somatique, que le dédoublement des chromosomes qui se fait normalement avant la mitose (et aussi avant la méiose), ne soit pas suivie de la séparation des deux lots de chromosomes (c'est une endomitose). Si ce dédoublement arrive assez tôt pendant la croissance de la plante, il y aura formation d'un secteur assez grand au niveau de la plante qui sera tétraploïde et formera des gamètes diploïdes, qui peuvent donner des graines tétraploïdes. Si la plante peut se multiplier par voie végétative ce secteur peut aussi donner naissance à une plante tétraploïde. - Absence de réduction gamétique: la même chose ce produit que dans le dédoublement somatique, mais cette fois dans un tissu germinal et au cours d'une méiose, ce qui abouti à la formation de gamètes non réduits (gamètes diploïde). La rencontre de deux gamètes non réduits abouti à la formation de zygotes tétraploïdes. 2. 4. 1. 4. Technique d'induction des polyploïdes. Ces techniques utilisent les mêmes voies cités plus haut. Il s'agit de techniques qui permettent d augmenter la fréquence des endomitoses et des absences des réductions gamètiques. On peut citer quelques exemples de techniques: - décapitation des tiges. - Chocs thermiques (par le froid ou la chaleur). - Traitement des cellules par des substances chimiques qui bloquent la formation du fuseau et par la empêche le déroulement de l'anaphase. Les chromosomes qui se sont dédoublés, sont tous inclus dans la même membrane nucléaire et donc il y a dédoublement du nombre de chromosomes. 22

2. 4. 2. Aneuploïdie. Les mutations aneuploïdes s'observent tant chez les polyploïdes que chez les diploïdes. Les aneuploïdes sont naturellement plus tolérés chez les polyploïdes que chez les diploïdes. Les aneuploïdies résultent des mauvaises disjonctions des chromosomes pendant la méiose. On peut avoir une mauvaise disjonction soit à la division I soit à la division II de la méiose. Quand il y a mauvaise disjonction à la division I, on a les deux chromosomes homologues d'une paire qui se rendent au même pôle, il y a alors production de gamètes aneuploïdes à n + 1 et à n - 1 chromosomes. L'union d'un gamète normal et d'un gamète à n + 1 chromosomes donne un zygote trisomique (figure 3.21). L'union d'un gamète normale et un gamète à n - 1 donne un zygote monosomique... etc. (Figure 3.21). Il peut y avoir mauvaise disjonction à la deuxième division de la méiose, et dans ce cas les deux chromatides soeurs migrent vers un même pôle, ce qui amène à la production de gamètes aneuploïdes à n + 1 et n - 1 chromosomes (figure 3.21). a) Mauvaise disjonction de la paire b) Mauvaise disjonction de la paire de chromosomes A à la division I de chromosomes A à la division II Division I Division II (n + 1) (n + 1) (n - 1) (n - 1) (n) (n) (n + 1) (n - 1) Gamètes aneuploïdes Gamètes normales Gamètes aneuploïdes n n + 1 n - 1 n 2 n zygote normale 2 n + 1 trisomique 2 n - 1 monosomique n + 1 2 n + 1 trisomique n - 1 2 n - 1 monosomique 2 n + 2 tétrasomique 2 n normale 2 n normale 2 n - 2 nulisomique Figure 3. 21. Les aneuploïdies résultent des mauvaises disjonctions des chromosomes homologues durant la méiose. 23

3. Isolement de mutants. L'isolement des mutants revêt une importance capitale pour un généticien dans la mesure ou l'étude génétique de n'importe quel organisme commence nécessairement par la constitution d'une collection de mutants différents. La sélection des mutants repose sur la capacité à pouvoir différencier les mutants des sauvages. Il n'existe pas de protocole de sélection applicable à toutes les mutations. Chaque type de mutant nécessite un protocole qui lui est adapté. Cependant on peut distinguer deux types générales de sélection de mutants: - sélection directe: on utilise ce type de sélection quand les mutants ont un avantage sélectif sur les sauvages. - Sélection indirecte: on l'utilise quand les mutants sont désavantagés par rapport aux sauvages. 3.1. Augmentation des fréquences. Dans tous les protocoles de sélection des mutants, on procède en premier lieu à l'augmentation des fréquences des mutants dans la population soumise à la sélection. La fréquence des mutants spontanés est faible et pour rendre la sélection des mutants plus facile nous augmentons la fréquence des mutants par l'utilisation d'agents mutagènes. Donc la 1 ère étape d'un protocole de sélection des mutants est une mutagenèse artificielle. Nous utilisons pour cela, soit des produits mutagènes chimiques comme l éthyle méthane sulfonate (EMS), la nitrosoguanidine ou encore le di-époxy-butane (DEB), soit des agents mutagènes physiques, comme les rayons X ou les rayons à neutrons ou encore les ultraviolet (U.V). 3. 2. Sélection directe. Si la cellule mutée a un avantage sélectif par rapport à la cellule normale, il est facile de la sélectionnée, c'est le cas par exemple, des cellules de bactéries résistantes à des antibiotiques (par exemple la streptomycine) apparues dans une population sensible à cet antibiotique (figure 3.22). 24

dilution 10-1 10-6 Culture de la souche sauvage milieux non sélectif milieux additionné de tétracycline dilution 10-2 10-4 Culture de la souche sauvage milieux non sélectif milieux additionné de tétracycline Milieux additionné de mutagène (témoin de viabilité) Figure 3. 24. Protocole de sélection directe de mutant résistants à la tétracycline à partir de bactéries sensibles à la tétracycline. Il faut calibrer la dose d'agents mutagènes à utilisés de façon a ne pas tuer toute la population si la dose est trop grande ; c'est pour cela qu'on utilise le témoin de viabilité. 3.3. Sélection indirecte. Il est délicat de sélectioner des mutants qui sont désavantagés par rapport aux sauvages. C'est le cas des mutations conduisant à la perte d'une fonction essentielle (mutants auxotrophes par exemples). On peut prendre comme illustration d'un protocole de sélection indirecte, la méthode utilisé pour la sélection de mutants auxotrophes de Neurospora crassa. Cette méthode utilise la technique des répliques qui est illustré par la figure 3.23. 25

. Suspension de conidies Etalement des conidies mutagènisées Boite mère (milieux complet) (milieux complet) (milieux complet) Tissu en velours val - leu - Tambour val - leu - Empreinte de la boite mère Milieux minimum (Mm) Mm + leu + val Mm + valine (val) Mm + leucine (leu) Figure 3. 23. Méthode de sélection indirecte utilisant la technique des répliques pour sélectionner des mutants auxotrophes pour valine et leucine chez Neurospora crassa. Si les mutants sont très rares malgré l emploi de la mutagenèse, il est possible de faire un enrichissement de la population soumise à la sélection des mutants. Cet enrichissement chez les bactéries peut être achevé par utilisation de l'effet bactéricide de la pénicilline. Cet antibiotique provoque la mort des bactéries en croissance, alors qu'il est sans action sur les bactéries qui ne se divisent pas. Il suffit donc de placer la population de bactéries ayant subit la mutagenèse en milieu minimum contenant la pénicilline pour provoquer la mort des prototrophes en division, alors que les autotrophes qui ne se divisent pas survivent, après lavage des bactéries traitées pour éliminer la 26

pénicilline, il est possible d utiliser la technique des répliques sur cette population enrichie en mutants auxotrophes. 3. 4. Isolement de mutants de drosophiles. L isolement des mutants chez les organismes supérieurs comme Drosophila melanogaster est confronté à deux difficultés majeurs. -L état diploïde de cet organisme fait que les mutations nouvellement obtenues ne sont pas directement décelables car le plus souvent elles sont récessives. -La mutation peut apparaître soit dans des cellules somatiques, et dans ce cas elles ne sont pas transmises à la descendance, soit dans des cellules de la lignée germinale. Chez Drosophila une technique relativement simple à été mise au point et qui permet de déceler des mutations touchant le chromosome X (figure 3. 24). Cette technique a été établie dans le but de sélectionner des mutations létales touchant des gènes sur le chromosome X. Cependant la technique est valable pour la sélection de toute mutation sur le chromosome X. Cette technique utilise un chromosome X clb.ce chromosome porte: -Un complexe d inversions (c) qui le rend incapable de recombiner avec un autre chromosome X. -Une mutation (l) homozygote létale. -La mutation Bar (B) dominante qui procure un marquage du chromosome X facilement identifiable au niveau phénotypique. Les mâles mutagènisés (U. V., rayons X,...) sont croisés avec des femelles ayant un chromosome X clb et un chromosome X normale (figure 3.24). Les femelles descendantes de ce croisement qui ont le phénotype Bar ont donc le chromosome X clb venant de leurs mères et un chromosome X venant de leurs pères et qui est potentiellement porteur de mutations induite par la mutagenèse. Ces femelles sont testées individuellement en les croisants avec des mâles sauvages. Si la descendance d un tel croisement ne présente que des femelles (absence des mâles), cela implique que la femelle testée porte un chromosome X ayant une mutation homozygote létale. 27

Croisement X clb / X + X X + / Y U. V. Gamètes X clb X + X + X m Y X + X m Y X clb X clb / X + [ Bar ] X + X + / X + [ + ] X clb / X m [ Bar ] X + / X m [ + ] X clb / Y Létale X + / Y [ + ] Les femelles[bar] potentiellement porteuses des mutations sont testées individuellement. X clb / X m X X + / Y X clb / X + X X + / Y X + Y X + Y X clb X clb / X + [ Bar ] X m X m / X + [ + ] X clb / Y Létale X m / Y Létale X clb X clb / X + [ Bar ] X + X + / X + [ + ] X clb / Y Létale X + / Y [ + ] Figure 3. 24. Protocole de sélection de mutant au niveau du chromosome X de Drosophila melanogaster. 28

CHAPITRE 4 GENETIQUE BACTERIENNE. 1. Introduction. Dans ce chapitres nous allons voir un type particulier de l'analyse génétique, diffèrent de ce que nous avons vue jusqu'à maintenant. La particularité de l'analyse génétique chez les bactéries vient de la particularité de ces dernières. Jusque là nous avons étudié des organismes eucaryotes dont le brassage et la transmission de l'information héréditaire est assurée par la méiose et, dans une moindre mesure, par la mitose. Les bactéries quand à elles, sont des procaryotes qui ne font ni mitose ni méiose. Elles ont un seule chromosome circulaire et en un seule exemplaire. Jusqu'à une date relativement récente on croyait que les bactéries se divisent par simple fission binaire (réplication du chromosome suivie de division du cytoplasme) et qu'il n'y a pas de brassage génétique. Aujourd'hui on sait que les bactéries sont capable de faire le brassage de l'information héréditaire par 3 modes diffèrents qui permettent la recombinaison unidirectionnelle (figure 7.1). Ce sont: - La transformation - La conjugaison - La transduction. Nous allons étudier chacune de ces trois modalités dans ce chapitre. 29

Donneur ADN libre Récepteur TRANSFORMATION Donneur ADN viral Récepteur TRANSDUCTION Donneur Récepteur Donneur Récepteur Transfert du chromosome CONJUGAISON Transfert du plasmide Figure 1.7. Les trois modalités de brassage génétique chez les bactéries. La figure ne donne que les étapes initiales des modalités de transfert de l'adn du donneur au récepteur. 2. La transformation. La découvert de la transformation chez les bactéries a été un événement important dans l'histoire de la génétique, puisque elle a conduit à des expériences qui ont donné la preuve que les acides nucléiques et spécialement l'adn sont le support de l'information génétique. La transformation a été découverte chez Diplococcus pneumoniae par Griffith (figure 7.2). Par la suite il a été montré que la transformation se fait chez d'autres espèces bactériennes. Actuellement on sait transformer n'importe quelle espèce bactérienne, grâce au traitement par les ions calcium. Revenons maintenant à l expérience de Griffith, ce chercheur étudiait une espèce bactérienne Diplococcus pneumoniae. Cette bactérie possède une capsule polysaccharidique qui lui permet d envahir les poumons des souries, ce qui cause la mort. Griffith possédait un mutant de Diplococcus qui ne possède pas la capsule et qui est incapable d envahir les poumons de la sourie et donc incapable de la tuer. La souche 30

sauvage peut être différenciée de la souche mutée par l'aspect des colonies qu'elle forme sur milieu solide. La souche sauvage "S" (de l'anglais Smooth), donne des colonies lisses. La souche mutante "R" (de 'anglais Rough), forme des colonies rugueuses. La souche S inactivée par la chaleur n'est plus capable de tuer la sourie. Mais quand Griffth injecta à la sourie le mélange de la souche S inactivée par la chaleur et la souche R vivante, la sourie meurt par suite d'envahissement de ces poumons par les bactéries. Les bactéries que Griffith extrayait de cette sourie sont de type "S". Donc les bactéries R ont été transformées en bactéries S, ce qui signifie que les bactéries R ont acquis l'information héréditaire qui leurs permet de synthétiser la capsule polysaccharidiques. Plus tard (1944) Avery, Mc Carty et Macleod, ont montré que la transformation de la souche R en S peut se faire dans un tube à essai et pas seulement dans la sourie en incubant la souche R avec un extrait de la souche S. Ils ont ensuite (par différentes purifications) montré que le composon de l'extrait qui est responsable de la transformation était l'adn. Ceci a été la première démonstration que l'adn est le support de l'information génétique. S Injection R S Chauffage S + R Figure 7. 2. Expériences de Griffith. La transformation génétique est donc un processus dans lequel une molécule d ADN libre est incorporée par une cellule réceptrice ce qui donne à celle-ci une nouvelle 31

information génétique. Cependant, toutes les cellules ne sont pas transformables. Les cellules capables de recevoir l'information génétique sous forme d'adn libre, sont dites compétentes. La compétence est un caractère héréditaire sous le contrôle de plusieurs gènes. Ces gènes codent pour des protéines responsables de l'absorption de la molécule d'adn exogène et de sa protection contre l'action des nucléases de la cellule réceptrice (figure 7.3.). La molécule d'adn qui est adsorbée sur la paroi de la cellule réceptrice est double brin, mais son absorption se fait sous forme simple brin (figure 7.3.). L'ADN exogène simple brin recombine avec le chromosome bactérien grâce aux enzymes impliquées dans la recombinaison et plus particulièrement grâce à "REC A". Il y a alors production d'un hétéroduplexe (un brin est parentale et l'autre est reconbiné par intégration de la molécule d'adn exogène) et à la réplication il y a formation de deux chromosomes. L'un est parentale et le deuxième est recombiné. Ce dernier donnera la souche transformée (figure 7.4). Récepteur (DNA binding protein) a) b) Protéine de compétence se liant à l ADN simple brin Nucléase Nucléotides libres Rec A (enzyme permettant la recombinaison) Chromosome bactérien c) Integration d une partie de la d) molécule d ADN éxogène Hétéroduplex Figure 7. 3. Mécanisme de la transformation génétique chez les bactéries. (a) l'adn exogène est adsorbée sur la paroi de la cellule grâce à des récepteurs. b) l'adn exogène pénètre dans la cellule sous forme simple brin, le brin complémentaire est digéré par les nucléases localisées au niveau de la paroi. L'ADN simple brin est protégée des nucléases cellulaires par les protéines spécifiques de la compétence (c) l'adn exogène reconnaît la partie du chromosome bactérien qui lui est complémentaire et s apparie avec elle. Par double crossing-over l'adn exogène est intégrée à l'un des deux brin du chromosome (d) formation d'un hétéroduplex: chromosome bactérien avec un brin parental et un brin recombiné. La division bactérienne aboutit à deux bactéries filles dont l'une est parentale et l'autre est transformée. 32

Chromosome bactérien + + Souche transformée C. O + m m m + m Réplication C. O ADN exogène Hétéroduplèxe m m Souche parentale Figure 7. 4. Mécanisme de la transformation génétique chez les bactéries (suite). C.O = crossing-over. 3. La conjugaison. 3. 1. Mise en évidence. Bien que la transformation bactérienne a été découvert par hasard, la conjugaison a été découverte par Lederberg et Tatum (1946) grâce à des expériences conçues dans un but de trouver s'il existe ou non un transfert sexuel de l'information génétique chez les bactéries. La figure 7.5 décrit l'expérience de Lederberg et Tatum qui a permis la mise en évidence de la conjugaison. Ces deux chercheurs ont obtenu différentes souches mutantes (souches auxotrophes pour diffèrents aminoacides et vitamines). Ils mélangent deux souches (Yco et Y24) auxotrophes pour des substances différentes, mais ces deux souches sont complémentaires et peuvent par recombinaison produire des souches recombinées prototrophes. Le mélange des souches mutantes ce fait dans un milieux complet, ensuite et après un certain temps les bactéries sont lavées et placées dans un milieu minimum pour détecter d éventuelles recombinants. Lederberg et Tatum ont effectivement obtenu quelques colonies qui poussent sur milieu minimum bien que leur fréquence est très faible. Ces prototrophes ne peuvent donc être dus qu'à la recombinaison entre les génomes des deux souches mutantes (on ne peut pas avoir des revêtants pour les trois gènes en même temps avec la fréquence avec laquelle les recombinants prototrophes sont obtenus). 33

Souche Y10 Souche Y24 B1- met- thr+ leu+ B1+ met+ thr- leu- pas de prototrophes pas de prototrophes mélange de Y10 et Y24 dans milieu complet milieu minimum milieu minimum Recombinants prototrophes B1+ met+ thr+ leu+ milieu minimum Figure 7. 5. Expérience de Lederberg et Tatum, conçue pour étudier la recombinaison génétique par conjugaison chez E.coli. Lederberg et Tatum se sont assuré ensuite que le processus par lequel les recombinants sont obtenues nécessite que les bactéries puissent établir un contact physique entre elles. Pour cette vérification ils placent les bactéries dans un tube en "U" dont les deux compartiments qu'il contient son séparés par un filtre qui laisse passer les macromolécules mais non les bactéries. Chacune des deux souches Y10 et Y24 est placée dans un compartiment du tube en "U" (figure 7. 6). Dans ces conditions Lederberg et Tatum ne récupèrent plus de recombinants prototrophes. 34

Extrémité reliée à une pompe pour permettre la circulation du liquide dans les deux compartiments Compartiment contenant Y10 Compartiment contenant Y24 Filtre Figure 7. 6. Tube en utilisé pour la mise en évidence de la conjugaison. Ceci prouve que le mécanisme par lequel est obtenu la recombinaison nécessite le contact physique entre les deux souches bactériennes. Par la ensuite, il a été découvert qu'il s'agit en faite d'un transfert unidirectionnel de l'information héréditaire d'une bactérie donneuse (bactérie de type +) vers une bactérie réceptrice (bactérie de type -). Le transfert de l'information ne se fait que dans ce sens, jamais dans le sens contraire (de type - vers le type +). Il a été montré ensuite que la différence entre les bactéries de type (+) et de type (-) réside dans le faite que les bactéries (+) possèdent un plasmide noté F (pour facteur de fertilité) alors que les bactéries de type (-) ne le possèdent pas. Le facteur de fertilité F est une molécule d'adn circulaire qui contient une dizaine de gènes. Ces gènes codent pour les protéines qui donnent à la bactérie donneuse (F + ) le pouvoir d'établir un pont (qu'on appelle tube de conjugaison) à travers lequel il y a transmission de l'information génétique vers la bactérie réceptrice (F - ). Il a été ensuite découvert que certaines souches bactériennes de type F +, croisés avec des F - donnent une très grande fréquence de recombinants dans la descendance. Ces bactéries sont désignée par Hfr (haute fréquence de recombinaison). Il a été par la suite démontré que les bactéries Hfr avaient le facteur de fertilité F qui est intégré au chromosome bactérien alors qu'il est libre chez les bactérie F + (figure 7.7.). Donc la conjugaison chez les bactéries consiste en deux types de croisement : - un croisement F + x F - - et un croisement Hfr x F - 35