Dépistage des mycotoxines Bart Huybrechts Centre d Etudes et de Recherches vétérinaires et agrochimiques (CODA-CERVA) Direction opérationnelle Sécurité chimique de la chaîne alimentaire, Service Toxines et Substances naturelles Laboratoire national de référence pour les Mycotoxines Leuvensesteenweg 17, 3080 Tervuren, Belgique Introduction Les problèmes de sécurité alimentaire sont essentiellement associés à la présence potentielle de contaminants issus des activités humaines, tels que les pesticides, par exemple. Une attention bien moindre est prêtée aux contaminants d origine naturelle. Les mycotoxines sont un bon exemple de contaminant naturel : il s agit des substances toxiques produites par les moisissures. Début de l année dernière, les mycotoxines ont fait parler d elles lorsque du maïs-fourrage importé d Europe de l Est et contaminé par l aflatoxine, une des mycotoxines les plus connues et les plus toxiques, est entré dans l alimentation de bêtes laitières. Les moisissures des familles Aspergillus, Fusarium et Penicillium sont les principaux producteurs de mycotoxines dans les denrées alimentaires. Une première condition pour limiter autant que possible la présence de mycotoxines dans l alimentation est de prévenir le développement des moisissures à tout moment de la production et de la transformation. Le stockage de la récolte représente également un moment critique ; la température et le taux d humidité doivent être contrôlés en permanence. Les mycotoxines sont des composés très stables qui résistent à la plupart des procédés de préparation et de transformation. Cela signifie que les mycotoxines peuvent encore être présentes alors même que la moisissure qui les a produites ne peut plus être décelée. De plus, les mycotoxines peuvent pénétrer dans la chaîne alimentaire par différentes voies. Outre la possibilité d une contamination primaire, une contamination secondaire peut également se produire, avec, par exemple, l introduction d aflatoxines dans la chaîne alimentaire humaine par le biais du lait. Tests rapides versus méthodes de confirmation Étant donné qu une contamination par ces toxines ne peut jamais être totalement exclue et qu une décontamination systématique ne constitue pas une option acceptable en raison de la dégradation olfactive inévitable du produit, il est recommandé de surveiller la présence de ces toxines dans les denrées alimentaires. Il n est pas si évident de développer des méthodes d analyse capables de détecter ces toxines de manière fiable et en routine, dans des matrices diverses (des céréales à la viande, en passant par le miel), d autant plus que la norme applicable à plusieurs de ces toxines peut être relativement basse. Le fait qu une méthode d analyse nouvellement développée soit adaptée ou non à une utilisation commerciale en routine est déterminé par trois critères pratiques : (a) la fiabilité, c.-à-d. l exactitude et la précision (b) la rapidité et donc, dans une large mesure, le prix de l analyse (c) la possibilité de réaliser l analyse sur le terrain. Sur base de ces critères, les techniques d analyse des mycotoxines peuvent être classées en deux catégories : (1) les tests rapides de dépistage et (2) les méthodes de confirmation. Tandis que les méthodes de la catégorie 1 ont principalement pour but de détecter les toxines le plus rapidement possible, de préférence déjà sur le terrain et de manière plutôt qualitative, c.-à-d. en donnant une réponse oui ou non, les méthodes de la catégorie 2 sont essentiellement utilisées pour confirmer un résultat positif obtenu avec un test rapide, et/ou pour fournir un résultat quantitatif plus précis ( quelle est la quantité exacte présente? ). Les deux catégories de méthodes ont en commun qu elles nécessitent une étape d extraction, lors de laquelle la toxine est extraite de l échantillon au moyen d un solvant (p.ex. alcool). Leur différence fondamentale est la manière dont se fait la détection. 4
Tests rapides La majorité des tests rapides se basent sur les anticorps (essais immunologiques) pour la détection et diffèrent essentiellement entre eux suivant la manière dont est utilisé l anticorps. Trois formats sont actuellement commercialisés : (1) les tests ELISA (enzyme-linked immunosorbent-assays) (2) les tests à bandelette réactive et à flux latéral et (3) les FPIA (immunoessais à polarisation de fluorescence). Ces derniers ne sont presque plus utilisés en raison de leur complexité. Dans les tests ELISA, la toxine doit se lier à un certain nombre de sites de liaison d un anticorps dans la solution d extraction, immobilisés dans une plaque multititre, ce qui entraîne une extinction du signal ; en d autres termes, moins le test émet de signal, plus la toxine est présente. Un inconvénient de ce test est qu il réclame une main-d œuvre relativement élevée et qu il est difficilement applicable sur le terrain. Les tests à bandelette réactive et à flux latéral sont des tests immunochromatographiques où la présence de la toxine est mesurée au moyen d une bandelette jetable. Ces bandelettes contiennent un anticorps lié à une particule de couleur ; lorsque l agent d extraction est ajouté, la toxine présente se lie à la particule de couleur, la bandelette de papier se colore et démontre ainsi la présence de la toxine. Le grand avantage de ce test par rapport au test ELISA est qu il peut être appliqué sur le terrain, raison pour laquelle il a récemment fortement gagné en popularité. Ces tests immunologiques ont cependant un point faible : les autres composants présents dans l échantillon sont susceptibles d influencer la liaison de l anticorps et d ainsi donner lieu à un faux négatif ou à un faux positif. Figure 1 : Test rapide de type ELISA avec plaque de titration de 96 puits. Chaque position exige plusieurs étapes de pipetage pour parvenir à un résultat. Figure 2 : Test bandelette. La solution d échantillon peut directement être appliquée sur cette bandelette. Une coloration indique ensuite le résultat positif ou négatif. 5
Nouvelles tendances L évolution récente des méthodes de détection peut être perçue comme la réponse à deux demandes conflictuelles : d une part, la demande de méthodes toujours plus rapides et toujours plus simples, avec une meilleure applicabilité sur le terrain, et d autre part l évolution vers des méthodes de référence davantage fiables et capables de détecter le plus de toxines possible en une seule analyse. Indépendamment de ceci, on a également une demande de méthodes d extraction nécessitant des agents organiques d extraction moins nocifs, sans pour autant toucher à la qualité des analyses. Tests rapides Tests à flux multi-toxines (multiplex) Grâce à leur manipulation beaucoup plus aisée, les tests rapides sous la forme de bandelettes ont rapidement gagné des parts de marché, comparativement aux tests ELISA. Un inconvénient important qu ils partageaient avec les tests ELISA est qu ils ne pouvaient détecter qu une seule mycotoxine par analyse. Récemment, plusieurs tests à flux capables de mesurer plusieurs toxines au cours d une même analyse ont été mis à disposition sur le marché. Leur inconvénient, cependant, est qu ils sont pour l instant encore moins sensibles que les tests à bandelette réactive mono-toxine. Polymères à empreintes moléculaires (MIP) & Aptamères Jusqu il y a peu, les tests rapides étaient basés sur des anticorps d origine biologique (p.ex. de lapins, de souris) mais, récemment, des tests rapides à base d éléments de liaison non biologiques ont été commercialisés. Les MIP sont des polymères avec une mémoire moléculaire intégrée qui, à l instar des anticorps, ont la capacité de lier spécifiquement une toxine via un mécanisme clé-serrure. La stabilité, la réutilisabilité, la reproductibilité, les faibles coûts de production et l absence d éventuelles questions éthiques autour de l utilisation d animaux de laboratoire constituent des atouts commerciaux importants. Des aptamères (éléments de liaison basés sur l ADN) sont déjà utilisés à l échelle du laboratoire comme alternative aux anticorps mais leur avenir commercial est encore incertain. Méthodes rapides de spectroscopie Les techniques spectroscopiques où, par exemple, un laser infrarouge est dirigé sur l échantillon et où l absorption spécifique d une certaine longueur d onde de la lumière révèle la présence d une toxine, possèdent un très grand atout : elles permettent d omettre l étape d extraction. Cela ouvre un nombre infini de nouvelles possibilités : par exemple, des grains de maïs peuvent être soumis à un screening individuel tandis qu ils passent sur un tapis roulant et ainsi être éliminés individuellement, ce qui évite la destruction de tout un lot. Cependant, cette technique est relativement sensible aux interférences, une conséquence inévitable de l absence de toute forme de préparation de l échantillon, et la technologie utilisée est relativement coûteuse. Par contre, une fois mises en œuvre, ces analyses se déroulent de façon entièrement automatique. 6
Biocapteurs Un biocapteur est un appareil permettant de détecter des molécules, qui combine un composé biologique comme élément sensible à une lecture physico-chimique. Un biocapteur se compose de 3 parties : un élément biologique sensible, un convertisseur (transducteur) et un détecteur physico-chimique. Si la toxine est présente, elle se lie à l élément et provoque ainsi une altération physico-chimique dans le détecteur. Bien que cette technologie ait jusqu à présent donné des résultats prometteurs à l échelle du laboratoire, elle ne semble pour le moment pas présenter d avantages concluants par rapport aux technologies existantes et elle n est pas disponible sur le marché. Bead-based assays Dans les bead-based assays, des petites billes (beads) codées avec une couleur ou des billes magnétiques sont ajoutées à une solution d échantillon. Outre leur codage d identification, ces billes sont également marquées au moyen d un anticorps dirigé contre une certaine toxine. Les altérations causées aux billes par le complexe anticorps-antigène peuvent alors être mesurées au moyen d un laser, par exemple. Un des grands avantages de cette technologie est qu elle est particulièrement bien adaptée aux analyses multi-toxines. Des kits commerciaux sont déjà attendus dans le courant de cette année. Spectrométrie de masse à haute résolution Dans le domaine des méthodes de référence, la spectrométrie de masse se profile indubitablement comme la référence en matière de détection. La spectrométrie de masse à haute résolution (HR-MS) met en œuvre une très haute résolution de masse. Afin d identifier un composé de manière univoque, le spectromètre de masse doit pouvoir déterminer la masse du composé le plus précisément possible, c est-à-dire posséder une haute précision de masse, et en même temps pouvoir différencier cette masse le plus précisément possible des autres masses moléculaires, c est-à-dire posséder une résolution la plus grande possible. Il faut ici bien garder à l esprit qu une résolution la plus haute possible est particulièrement utile mais qu il ne s agit pas d une condition indispensable, ni d une condition suffisante, pour obtenir une précision de masse satisfaisante. Les spectromètres de masse à haute résolution actuellement disponibles sur le marché peuvent être classés en quatre catégories, suivant leur principe d action : (1) les spectromètres de masse à secteur magnétique (2) les spectromètres de masse à temps de vol (Time-of-Flight, TOFMS) (3) les spectromètres de masse à résonance cyclotronique ionique à transformée de Fourier (FT-ICR) (4) l Orbitrap à transformée de Fourier. Les deux premiers types de spectromètre de masse sont généralement comptés parmi les spectromètres de masse à scanning continu (secteur magnétique) ou semi-continu (TOFMS) ; les deux derniers sont ce qu on appelle des trappes ioniques. Dans le spectromètre de masse à secteur magnétique, une molécule chargée électriquement est tout d abord activée jusqu à une très haute vitesse, après quoi elle doit passer par un champ magnétique situé perpendiculairement à sa trajectoire ; les molécules les plus lourdes, en raison de leur plus grande inertie de masse, seront déviées différemment des molécules plus légères. Jusque dans les années nonante, les secteurs magnétiques étaient l outil privilégié lorsqu une haute résolution était requise dans un environnement de routine. À l heure actuelle, ils ont en grande partie disparu en raison d une série d inconvénients : le coût 7
d investissement est très élevé, et ils ne peuvent scanner que masse par masse et non pas établir en une fois un profil complet de l échantillon. En outre, ils ne peuvent pas être combinés à la chromatographie en phase liquide mais uniquement à la chromatographie en phase gazeuse. Les spectromètres de masse à temps de vol utilisent le principe selon lequel, si on donne la même énergie à deux molécules, la masse la plus lourde va se déplacer plus lentement au travers d un tube sous vide qu une molécule plus légère. Ces spectromètres de masse ont, depuis les années nonante, plus ou moins repris le rôle des secteurs magnétiques en tant qu outil à haute résolution grâce à une série d avantages : coût d investissement relativement bas, vitesse de scanning très élevée, robustesse (principe d action très simple), possibilité d être combinés à presque toutes les méthodes de préparation d échantillon et de séparation d échantillon. Ils présentent néanmoins deux grands inconvénients : leur résolution est très basse, selon les normes HR-MS, et leur sensibilité diminue fortement si l utilisateur demande une plus grande résolution. Bien que l on ait travaillé à ce problème ces dernières années, par exemple avec la technologie du réflectron, la technologie TOFMS est pour l instant encore à la traîne par rapport au système de trappe à ions du point de vue de la résolution de masse. Les spectromètres de masse dits trappes à ions, tels que le spectromètre de masse ICR ou Orbitrap, offrent de très hautes résolutions, jusqu à 100 fois plus élevées que les autres types. Avec ces spectromètres de masse à transformée de Fourier, les ions sont capturés dans une cage en métal (trappe), après quoi ils sont soumis à un champ magnétique (ICR) ou à un champ électrique à courant continu (Orbitrap). La manière dont ils réagissent à l exposition à ce champ est dictée uniquement par leur masse. L énergie éventuelle que les ions reçoivent par exemple pendant l introduction dans le détecteur n a pas d incidence sur le mesurage. D où leur principale qualité : une résolution extrêmement élevée. Étant donné qu ils stockent des ions dans une trappe et, de cette manière, les concentrent pour ainsi dire, ils présentent en général une excellente sensibilité qui, en plus, ne diminue pas lorsqu une plus grande résolution est demandée. Par contre, ils commencent à scanner plus lentement si une plus grande résolution est demandée, un inconvénient que n a pas le TOFMS, ce qui complique leur intégration avec les dernières techniques chromatographiques ultra rapides. De plus, ils ne concentrent pas seulement les molécules d analyte souhaitées dans leur trappe mais toutes les molécules qui proviennent de l échantillon. La trappe peut ainsi se retrouver surchargée, ce qui entraîne une précision de masse erronée (effet de matrice). Cela peut être évité en ne laissant par exemple que 1% des ions entrer dans la trappe, mais alors la sensibilité s en retrouve bien entendu diminuée. La règle suivante s applique dès lors en spectrométrie de masse : une plus grande sensibilité signifie soit une moindre résolution dans le cas des spectromètres de masse à scan continu (quadripôle, secteur) ou semi-continu (TOFMS), soit des faibles vitesses de scan dans le cas des spectromètres de masse avec trappe à ions. La principale différence entre l ICR et l Orbitrap est le champ auquel sont soumis les ions. Dans le cas de l ICR, il s agit d un champ magnétique extrêmement puissant. Ce qui génère les résolutions les plus élevées actuellement disponibles dans les spectromètres de masse commercialisés. Les aimants coûtent cependant très cher (un ICR typique coûte plus de 2.000.000 euros) et sont très fragiles. De plus, l ICR est trop lent pour pouvoir être combiné aux nouvelles techniques chromatographiques rapides. Il est donc en grande partie inapproprié pour les analyses de routine. L Orbitrap est le dernier des rejetons dans les spectromètres de masse à haute résolution, il soumet les ions à un champ électrique à courant continu plutôt qu à un champ magnétique. Étant donné qu un champ électrique à courant continu est plus pur qu un champ magnétique, il possède une résolution plus élevée que l ICR, du moins en théorie ; il y a pour le moment encore des limites techniques à la production de la trappe proprement dite, qui entravent cette résolution. La vitesse de scan relativement lente typique des spectromètres de masse à transformée de Fourier, une opération mathématique où le signal de ces détecteurs, lié au temps, est transposé en une lecture de masse, entre ici également en jeu. On peut augmenter leur vitesse de scan, sans pour autant réduire la résolution, en diminuant la taille physique de la trappe mais cela les rend alors plus sensibles aux effets de surcharge dans la trappe, avec pour conséquence une inexactitude de la masse (et des résultats faux positifs ou faux négatifs). En tout cas, la génération actuelle peut être combinée aux techniques chromatographiques de 8
séparation. On s attend à ce que d ici quelques années, les Orbitraps dépassent les ICR du point de vue de la résolution, et ce pour seulement une fraction du coût des ICR. Ajoutez à cela une sensibilité actuellement meilleure que les TOFMS et presque aussi bonne que les spectromètres de masse quadripôle, et il n est donc pas étonnant que beaucoup considèrent cette technologie comme l avenir de la HR-MS. La spectrométrie de masse à haute résolution ouvre une perspective très intéressante : le screening dit générique ou non ciblé, où le détecteur scanne en continu un large champ de masses moléculaires pendant l analyse de l échantillon. De cette manière, une sorte de profil complet de contamination de l échantillon peut être établi, incluant non seulement les mycotoxines mais aussi les toxines végétales par exemple, les pesticides, les fongicides, etc. Une analyse rétroactive fait ici également partie des possibilités, par exemple si un client demande une analyse supplémentaire (suite à une nouvelle réglementation, par exemple), ces informations peuvent facilement être récupérées au moyen d un logiciel pour les échantillons déjà analysés. En outre, cette technologie permet aussi d examiner, en plus des toxines, les métabolites de celles-ci. Bien souvent, les toxines comme les toxines de moisissures sont modifiées par la plante en un produit moins nocif pour elle, mais lorsque celle-ci se retrouve dans le système digestif de l homme, les toxines sont susceptibles de retrouver leur forme initiale (supposée plus toxique). Ces métabolites ne sont toutefois pas détectés par les techniques d analyse classiques (toxines masquées ). La spectrométrie HR-MS permet d en effectuer un screening en routine. Les limites de détection de cette approche restent cependant relativement élevées, il faut donc examiner application par application si cette approche fonctionne ou non. Une limite supplémentaire est le développement encore à la traîne du logiciel adapté ; le screening manuel de centaines de composants dans chaque échantillon n est pas applicable dans un environnement de routine. Figure 3 : Spectromètre de masse orbitrap de Thermo Fisher Scientific Figure 4 : Spectre de masse avec résolution 100000 (audessus) et 10000 (en-dessous). On voit clairement que la plus forte résolution de masse donne lieu à des pics plus étroits. Cela signifie que le spectromètre de masse peut déterminer la masse exacte avec plus de précision avec un plus faible risque de résultats faux positifs ou faux négatifs. Bart.Huybrechts@coda-cerva.be 9