Order #: COKAL0200 But d utilisation Le kit format microplaque AgraQuant Gluten G12 est un test ELISA de type sandwich qui permet de doser la présence de fragments spécifiquement immuno-toxique du gluten dans de nombreux produits alimentaires. Le kit AgraQuant Gluten G12 représente la nouvelle génération de kits hautement sensibles pour la détection des fragments toxiques du gluten, responsables du déclenchement des réactions immunes chez les malades atteints de la maladie cœliaque, permettant ainsi de garantir les aliments sûrs pour les cœliaques. Gluten G12 Le gluten est le groupe majoritaire des protéines des céréales et est constitué de prolamines (dans le blé : gliadine) et de gluténine (dans le blé : gluténine) à proportion égale. Le gluten est utilisé dans les produits alimentaires pour en améliorer la texture et la forme, de par ses caractéristiques physico-chimiques. La maladie cœliaque est une perturbation auto-immune de l intestin grêle, causée par une réaction au peptide toxique 33-mer. Le seul traitement efficace consiste en une alimentation sans gluten tout au long de sa vie. Le «Codex Standard 118-1979» a imposé un seuil maximal de 20 mg/kg pour les produits «sans gluten» (y compris les fractions de prolamines de l orge, du seigle et de l avoine), et une teneur allant de 20 à 100 mg/kg pour les «produits alimentaires à teneur réduite en gluten». Principes du test AgraQuant Gluten G12 Assay (4-200 ppm) Le kit Agraquant Gluten G12 est un test ELISA de type sandwich. Le gluten est extrait de l échantillon à l aide d un tampon d extraction. Les anticorps monoclonaux directement dirigés contre le fragment toxique du gluten (G12) sont précoatés à la surface des micropuits. Les extraits d échantillons ou les standards sont distribués dans les puits et le gluten se lie aux anticorps. Après une étape de lavage, un conjugué enzymatique spécifique à la protéine G12 du gluten est ajouté dans les puits et incubé. Après une seconde étape de lavage, un substrat enzymatique est ajouté et une coloration bleue se développe. L intensité de la couleur est directement proportionnelle à la concentration de Gluten G12 présent dans l échantillon ou le standard. L ajout d une solution stop transforme la coloration bleue en jaune. La densité optique des micropuits est lue à l aide d un lecteur de micropuits à 450 nm (DO 450 ). Les densités optiques des échantillons sont comparées à celle des standards permettant de déterminer le résultat.
Précautions 1. Stocker les réactifs à 2-8 C quand ils ne sont pas utilisés. Ne pas utiliser après la date d utilisation indiquée sur l étiquette du kit. 2. Respecter les temps d incubation indiqués dans le protocole. En cas de non-respect de ces temps d incubation, les résultats ne sont pas garantis. 3. En raison du très haut risque de contamination croisée, tous les équipements doivent être nettoyés avec soin avant toute préparation d échantillon. 4. La solution stop contient de l acide. Eviter tout contact avec la peau et les yeux. En cas d exposition, rincer à l eau. 5. La solution d extraction contient des réactifs chimiques dangereux pour la santé. L extraction des échantillons doit se faire sous hotte chimique et tout contact avec la peau doit être évité. 6. Porter des gants et des lunettes de protection lors de l utilisation du kit. 7. Eliminer l ensemble des consommables, dispositifs et matériaux correctement après utilisation. Materiél fourni dans le kit 96 micropuits coatés avec des anticorps (12 barrettes de 8 puits) sur un support de micropuits (dans sachet en aluminium hermétique) 5 flacons de standards Gluten G12 de 1,2 ml (0, 4, 20, 80 et 200 ppm) 1 flacon de 12 ml de solution conjuguée (bouchon vert) 1 flacon de 15 ml de solution substrat (bouchon bleu) 1 flacon de 15 ml de solution stop (bouchon rouge) 1 flacon de 20 ml de tampon de dilution 5X concentré 1 flacon de 60 ml solution de lavage 10 X concentrée 1 flacon de 105 ml de solution d extraction prête-à-l emploi 1 sachet de 10 g de gélatine de poisson Materiél nécessaire non fourni dans le kit Procédure d extraction Poudre de lait écrémée pour échantillons contenant des tannins *EQOLE1025 : Agitateur ou fiole hermétique avec son couvercle ou mortier *EQOLE1010 : Balance, 400 g *EQOLE1050 : Cylindre gradué, 100 ml Eau distillée ou désionisée pour la dilution des tampons concentrés Solution éthanol/eau 80/20 (v/v) Contenant d une capacité minimum de 10 ml Agitateur de flacons (Stuart SF1 ou équivalent) Centrifugeuse, micro-centrifigeuse ou papier filtre et entonnoir Tubes de centrifugation Test ELISA Micropipettes simple ou multi-pipette à 8 canaux pour distribuer 100 µl et cônes *EQOLE1300 : chronomètre *COKAD1150 : pissette de lavage Eau distillée ou désionisée
Papier absorbant *3 réservoirs pour réactifs adaptés à micropipette multicanale à 8 canaux *Lecteur de microplaque avec un filtre à 450 nm En option : *puits de transfert pour le dépôt des échantillons et des standards du kit *Références disponible chez Romer Labs Préparation des solutions Ethanol 80% Pour utiliser avec la solution d extraction. Ajouter 120 ml d éthanol à 30 ml d eau distillée et bien agiter. Tampon de dilution Diluer le tampon de dilution concentré au 1 :5 avec de l eau distillée (par ex. ajouter 20 ml de tampon concentré à 80 ml d eau distillée). Stocker à 4 C. Le tampon de dilution dilué est stable pendant une semaine. Tampon de lavage Dans le cas d apparition de précipitations de cristaux lors du stockage, la solution concentrée doit être réchauffée jusqu à dissolution. Diluer la solution de lavage concentrée au 1 :10 avec de l eau distillée (par ex. mélanger 10 ml de tampon de lavage à 90 ml d eau distillée). Stocker à 4 C. Le tampon de lavage dilué se conserve une semaine. Procédure du test Préparation des échantillons/extraction 1. Prélever un échantillon représentatif et homogénéiser 5 g dans un mortier ou un broyeur 2. Peser 0,25 g de l échantillon homogénéisé (pour les échantillons contenant du chocolat ajouter également 0,25g de poudre de gélatine de poisson) et ajouter 2,5 ml de solution d extraction. Bien mélanger. 3. Incuber les extraits à 50 C pendant 40 minutes. 4. Laisser refroidir les extraits et ajouter 7,5 ml d éthanol à 80%. Bien mélanger. 5. Agiter en retournant les extraits pendant 1 heure à température ambiante (possible d utiliser un agitateur rotatif de laboratoire) 6. Centrifuger les échantillons pendant 10 minutes à 2000g pour obtenir une phase liquide claire entre les phases de particules et graisseuse. S il reste des particules dans le surnageant, filtrer le et récupérer le filtrat. 7. Diluer le surnageant au 1 :10 avec le tampon de dilution des échantillons pré-dilué (par ex. mélanger 100 µl de solution sans particules avec 900 µl de tampon de dilution).
Remarque : Le facteur de dilution 10 est déjà considéré dans le calcul final. Si les résultats obtenus sont au-dessus de la courbe de calibration, des dilutions complémentaires avec le tampon de dilution sont alors nécessaires. La dilution supplémentaire doit alors être incluse dans le calcul final. Test ELISA Remarque : Tous les réactifs et composants du kit doivent être ramenés à température ambiante (18-30 C) avant toute utilisation. Il est recommandé d utiliser une multi-pipette à 8 canaux lors du test. Dans le cadre de l utilisation d une multipipette à 8 canaux, un maximum de 48 échantillons et standards (24 en cas de dupliquas, soit 6 barrettes) pourront être testés simultanément. Sinon, dans le cadre de l utilisation d une micropipette simple, il est recommandé de ne pas utiliser plus de 16 puits simultanément (8 en cas de dupliquas, soit 2 barrettes) par test. Dans le cadre des Bonnes Pratiques de Laboratoire, il peut être recommandé de dupliquer certains ou tous les extraits dilués d échantillons et standards. Option : Méthode de Transfert des puits 1. Disposer le nombre approprié de puits de transfert (disponible sur demande) sur un support de microplaque. 2. A l aide d une micropipette monocanal, distribuer 150 µl de chaque solution standards prête-à-l emploi ou d échantillon préparé dans les puits correspondant. Changer de cône pour chaque standard et échantillon. Remarque : Bien s assurer que le cône soit complétement vidé. 3. Disposer le nombre correspondant de micropuits coatés aux anticorps sur un support de barrettes. Remettre les puits non utilisé dans le sachet aluminium avec le dessicant et le refermer. 4. A l aide d une multi-pipette à 8 canaux, transférer 100 µl de chaque standards prêt-à-l emploi et échantillon préparé dans les puits correspondant. Continuer en suivant la méthode standard ci-dessus à partir de l étape 3. Méthode standard 1. Disposer le nombre adapté de micropuits coatés à l anticorps sur le support de barrettes. Remettre les puits non utilisé dans le sachet aluminium avec le dessicant et le refermer. 2. A l aide d une micropipette simple distribuer 100 µl de chaque standard prêtà-l emploi ou d échantillon préparé dans les puits appropriés. Changer de cône pour chaque prélèvement de standard et d échantillon. Remarque : Bien s assurer que le cône soit complétement vidé. 3. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes.
4. Vider le contenu des puits dans un conteneur à déchet. Laver en remplissant chaque puits avec 300 µl de solution de lavage diluée, puis renverser la solution des puits. Répéter cette étape 4 fois pour un total de 5 lavages. Remarque : soyez vigilant à ne pas faire tomber les barrettes de leur support au cours du lavage. 5. Disposer plusieurs couches de papier absorbant sur une surface plane et tapoter la microplaque sur le papier pour absorber tout le liquide résiduel des puits après les étapes de lavage. Sécher le dessous des micropuits à l aide d un chiffon ou de papier absorbant sec. 6. Mesurer la quantité nécessaire de solution de Conjugué du flacon à bouchon vert (~120 µl/puits ou 1 ml/barrette) et distribuer dans un réservoir adapté (par exemple pour l utilisation de multi-pipettes à 8 canaux). A l aide d une multipipette à 8 canaux, distribuer 100 µl de Conjugué dans chaque puits. 7. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes. 8. Vider le contenu des puits dans un conteneur à déchet. Laver en remplissant chaque puits avec 300 µl de solution de lavage diluée, puis renverser la solution des puits. Répéter cette étape 4 fois pour un total de 5 lavages. Remarque : soyez vigilant à ne pas faire tomber les barrettes de leur support au cours du lavage. 9. Disposer plusieurs couches de papier absorbant sur une surface plane et tapoter la microplaque sur le papier pour absorber tout le liquide résiduel des puits après les étapes de lavage. Sécher le dessous des micropuits à l aide d un chiffon ou de papier absorbant sec. 10.Mesurer la quantité nécessaire de solution de Substrat du flacon à bouchon rouge (~120 µl/puits ou 1 ml/barrette) et distribuer dans un réservoir adapté (par exemple pour l utilisation de multi-pipettes à 8 canaux). A l aide d une multi-pipette à 8 canaux, distribuer 100 µl de Substrat dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes à l obscurité (en la couvrant complétement par ex. ou en la plaçant avec précaution dans un placard ou un tiroir). 11.Mesurer la quantité nécessaire de Solution Stop du flacon à bouchon bleu (~120 µl/puits ou 1 ml/barrette) et distribuer dans un réservoir adapté (par exemple pour l utilisation de multi-pipettes à 8 canaux). A l aide d une multi-pipette à 8 canaux, distribuer 100 µl de Solution Stop dans chaque puits. La couleur doit virer du bleu au jaune. 12.Lire les DO des barrettes à l aide d un lecteur de puits équipé d un filtre à 450 nm. Reporter les résultats pour chaque puits. Remarque : les bulles d air doivent être éliminées avant la lecture car elles peuvent affecter les résultats. Remarques : Ne pas remettre les réactifs non utilisés dans les flacons d origine. Veiller à bien identifier la position des standards et des échantillons pendant le test.
Interprétation des résultats En utilisant les valeurs brutes de DO ou les valeurs de % de DO par rapport à la valeur de DO du standard 120 ppm, construire une courbe de calibration à l aide des 5 standards. La concentration en gluten étant connue dans les solutions standards, on en déduit la concentration dans chaque échantillon par interpolation de la courbe de calibration. Les résultats peuvent aussi être calculés par l intermédiaire de la feuille de calcul fournie par Romer Labs, gratuitement sur simple demande. Une valeur de DO inférieure à 1,1 d unités d absorbance pour le standard 200 ppm met en évidence une détérioration des réactifs. Si l échantillon contient une teneur en gluten supérieure à la teneur du standard le plus concentré (>200 ppm), l extrait d échantillon doit alors être dilué davantage avec le tampon de dilution des échantillons de façon à tomber dans la gamme 4-200 ppm, avant d être analysé de nouveau pour obtenir des résultats fiables. Le facteur de dilution doit être intégré lors du calcul du résultat. Enchantillons de l environnement La courbe de calibration Gluten peut être utilisée pour estimer la concentration en gluten dans un écouvillon pour le contrôle de surface, en suivant l exemple comme ci-dessous : Valeur lue pour l écouvillon sur la courbe : 5 ppm Conversion en ng/ml : 5 X 1000 = 5000 ng/ml Pas d étape d extraction nécessaire (extraction au 1/100) : 5000/100 = 50 mg/ml Performances du kit Limite de détection : Limite de quantification : Gamme de quantification : Pas de réactions croisées avec : 2 ppm Gluten 4 ppm Gluten 4-200 ppm (pour la quantification d échantillons avec une concentration supérieure à 200 ppm, les échantillons doivent être dilués pour être dans la gamme 4-200 ppm) Pecan, noix, amandes, noix de cajou, noix de macadamia, arachide, noisette, pignon de pin, pistache, graine de lin, graine de pavot, sésame, moutarde, soja, millet, sarrasin, quinoa, fenouil, pois chiche, coriandre, haricot a œil noir, lentilles du Puy, cardamone.