Olivier Lascols Faculté de Médecine ierre et Marie Curie Généralités s sur les voies de signalisation 1 I. Caractérisation risation d une d voie de transduction d un d signal Exemple du Signal Mitogénique de l EGF 1. Quel récepteur? 2. Quels relais intracellulaires? 3. Spécificité de ces relais intracellulaires? II. Le réseau r de la signalisation cellulaire 1. Interactions et transducteurs 2. léïotropie d un signal 3. Intégration de signaux par la cellule 2
La transduction des signaux: généralitg ralités Début des années 1980 ligand Système d amplification arrivée du signal membrane R transduction par récepteur? émission intracellulaire du signal quels seconds messagers? quels relais? Cibles cellulaires effets biologiques 3 La transduction des signaux aujourd hui ligand 1 ligand 2 ligand 3 Stratégie de signalisation : Directe : ligand 1 Indirecte: ligand 2 ou 3 R Transports R R Etablissement de réseaux complexes par les progrès en biologie cellulaire et moléculaire : Clonage de gènes NOAU Métabolisme Modèles cellulaires : Modification d expression de protéines Mutagénèse dirigée Modèles animaux : Souris Knock-out Souris Knock-in 4
I. Caractérisation risation d une d voie de transduction d un d signal Exemple du Signal Mitogénique de l EGF (Epidermal( Growth Factor) 1. Quel récepteur? Méthodologie d étude des récepteurs localisation, nature, spécificité, activité, clonage, structure/fonction 2. Quels relais intracellulaires? a. Méthodes d étude test de protéines connues, recherche de nouveaux partenaires, localisation b. La voie d activation des MA Kinases par l EGF 3. Spécificité de ces relais intracellulaires? a. Méthodes d étude inhibiteurs pharmacologiques, stratégie antisens, transgénèse b. Intégration des 3 dimensions : nature, lieu, temps 5 Méthodologie d éd étude des récepteursr ETAE MATERIEL METHODES RESULTATS Localisation. tissus. Test de liaison. cellules -autoradiographie - microscopie prolifération électronique différenciation. Effets biologiques apoptose Localisation.membranes. fractionnement Cellulaire. cytosol subcellulaire capacité. test de liaison spécificité Caractérisation protéines. solubilisation. Structure. Activité solubilisées. test de liaison nature, taille enzyme. électrophorèse. immunoprécipitation. test d activité Sélection. récepteurs. chromatographie purifiés d affinité (Ab, ligand). test de liaison Clonage. ADNc. Criblage de banque. Séquence protéique. Domaines spécialisés. Expression du récepteur Structure /. récepteurs. Mutagénèse dirigée. Mode de transduction Fonction mutés. transfection. cellules cystéine transmb TK tyrosines 6
Interaction Ligand Récepteur L + R Spécificité *L : ligand radioactif LR LR totale *L + R + X *LR + *LX fixation totale *L + R *LR fixation spécifique L : excès de ligand «froid» *L + L + X *LX + LX fixation non spécifique Réversible spécifique non spécifique Saturable : nombre de site récepteur défini = Ro 7 Etude de la structure du récepteurr Structure fixant l EGF liaison de 125 I-EGF 125 I-EGF + R 125 I-EGF/R pontage covalent 125 I-EGF + R 125 I-EGF/R électrophorèse en SDS autoradiographie Identification par Western blot DSS 8
Clonage d une d protéine cellule rotéine purifiée ARNm séquence partielle en acides aminés Lys-prol-trp-tyr-asp-ser-cys-ala séquence nucléotidique AAGTCCTGCGGTGACAACGGTCG = SONDE ADNc vecteur recombinant Banque d ADNc Criblage de la banque Séquence I en aa de la protéine ADNc du gène Séquence nucléotidique complète Expression de la protéine Mutagénèse dirigée roduction d anticorps 9 Etude structure fonction Construction de mutants du récepteur à l EGF Répétitions riche en leucine Domaine riches en cystéine Autophosphorylation des mutants EGFR Domaine Tyrosine Kinase Domaine C-terminal 10
Activation d un d récepteur r tyrosine kinase (TK) Mb 2. hosphorylation sur des résidus tyrosines de substrats endogènes TK AT TK AD 1. Autophosphorylation sur des résidus tyrosines du récepteur substrat substrat AT AD 11 Activation par dimérisation et transphosphorylation Apport de la cristallographie et de la bioinformatique : Structure 3D a. Forme repliée d EGFR: -faible affinité de liaison de l EGF - pas d activité kinase b. Fixation de l EGF: - changement conformationnel du monomère (allostérie) - démasquage de la boucle de dimérisation. b. Dimérisation: - dos à dos - activation de la tyrosine kinase 12
I. Caractérisation risation d une d voie de transduction d un d signal Exemple du Signal Mitogénique de l EGF 1. Quel récepteur? Méthodologie d étude des récepteurs localisation, nature, spécificité, activité, clonage, structure/fonction 2. Quels relais intracellulaires? a. Méthodes d étude test de protéines connues, recherche de nouveaux partenaires, localisation b. La voie d activation des MA Kinases par l EGF 3. Spécificité de ces relais intracellulaires? a. Méthodes d étude inhibiteurs pharmacologiques, stratégie antisens, transgénèse b. Intégration des 3 dimensions : nature, lieu, temps 13 Etude des interactions : entre molécules connues Activation par le ligand Immunoprécipitation des complexes formés avec anticorps spécifique Séparation des constituants du complexe par électrophorèse Visualisation des protéines par immunoblot avec des anticorps spécifiques 14
Application Implication de Grb2 dans la voie de signalisation induite par EGF I : immunoprécipitation IB : immunoblot Lors de l activation par EGF: 1. Le récepteur à l EGF change de taille apparente 2. Le récepteur à l EGF est phosphorylé sur une tyrosine 3. Induction d une interaction entre EGFR et Grb2 15 Clonage d un d nouveau partenaire Fragment EGFR marqué Banque d expression d ADNc - 125 I Criblage de la banque Clones positifs radioactifs Séquençage des ADN Expression de la protéine roduction d anticorps Immunoprécipitation Immunoblot 16
Système double hybride (1) BD : Binding Domain AD : Activating Domain UAS : Upstream Activating Sequence 17 Système double hybride (2) Criblage d une d librairie d expressiond 18
Etude de la localisation d un d relais ADNc de protéine relais ADNc de protéine TAG ADNc de protéine chimère Expression de la protéine chimère stimulation par le ligand Localisation de la protéine chimère si TAG fluorescent Ex: GF Green Fluorescent rotein si TAG non fluorescent Ab fluorescent anti-tag Microscopie confocale en lumière fluorescente 19 b. La voie d activation d des MAK par l EGF l : recrutement d un d premier relais par EGFR activé Domaine SH2 Domaine SH3 Mb TK TK TK TK Grb2 : Growth Receptor Bound rotein sos : son of sevenless Grb2 sos 1. Complexe Grb2/sos 2. Interaction entre Tyr- et SH2 Grb2 sos Grb2 sos 3. Localisation à la membrane de sos 20
Activation d un d 2ème 2 relais membranaire Mb TK TK Grb2 sos ras GD ras GT ras : petite protéine G myristoylée localisation membranaire 1. Interaction sos ras 2. Echange GD-GT 21 Cycle d activationd activation-inactivation inactivation de la protéine ras ras GD i GT GTase GA SIGNAL rotéine d échange ras GD GT rotéine Effectrice Conduction du SIGNAL rotéine G : régulation allostérique activité GTase sos : protéine d échange Raf1 : protéine effectrice GA : GTase activating protein 1. ras.gd inactive 2. Echange GD-GT 3. Ras GT active 4. Interaction protéine effectrice 5. Hydrolyse du GT 22
Structure de la Kinase Raf-1 CR : conserved region CRD : cystein rich domain RBD : ras binding domain S : sérine T : thréonine : tyrosine 23 Modèle d activation d de Raf-1 1 2 3 4 1. Ras et raf inactives 2. Activation ras - interaction raf 3. Activation de raf et déplacement de la protéine 14.3.3 4. raf: sérine/thréonine kinase, phosphorylable par Src ou prot X (Current Opinion in Cell Biology (1997) 9:174-179) 24
Activation d une d cascade de Kinases Raf1 MEK Ser Ser AT AD Ser Ser Noyau MAK Thr Tyr AT AD Thr Tyr activation de la transcription MEK : MAK ou ERK Kinase MAK : Mitogen-Activated rotein Kinase 1. Raf1 ser/thr kinase sur MEK 2. MEK thr/tyr kinase sur MAK 3. Translocation MAK nucléaire 25 I. Caractérisation risation d une d voie de transduction d un d signal Exemple du Signal Mitogénique de l EGF 1. Quel récepteur? Méthodologie d étude des récepteurs localisation, nature, spécificité, activité, clonage, structure/fonction 2. Quels relais intracellulaires? a. Méthodes d étude test de protéines connues, recherche de nouveaux partenaires, localisation b. La voie d activation des MA Kinases par l EGF 3. Spécificité de ces relais intracellulaires? a. Méthodes d étude inhibiteurs pharmacologiques, stratégie antisens, transgénèse b. Intégration des 3 dimensions : nature, lieu, temps 26
Inhibition pharmacologique des voies de signalisation oints d impact sur la voie mitogénique de l EGF Facteur de croissance RTK Inhibiteur Tyrosine Kinase Inhibiteur de SH3 Anticorps SH2 Grb2, Shc Inhibiteur de SH2 sos Inhibiteur d échange Ras Inhibiteur de Ras Raf Inhibiteur de Raf Inhibiteur de MAKK LCg I3K T Inhibiteur de farnésylation de Ras MAKK MAK Inhibiteur Inhibiteur Inhibiteur Inhibiteur de MAK Noyau 27 Inhibition pharmacologique des voies de signalisation 28
Stratégies de modification d une d voie de signalisation (1) Antisens RNA silencing Transfection cellulaire Transgénèse chez l animal Antisens RNA silencing Théorie du RNAi (RNA interférence) rix Nobel de médecine et de physiologie 2006 : Andrew Fire et Craig Mello. Éléments de régulation cellulaire Outils d étude 29 Stratégies de modification d une d voie de signalisation (2) RNA silencing Dicer: hélicase/rnase RISC : RNA-induced silencing complexes Application: synthèse in vitro de sirna ciblé et transfection dans les cellules 30
Stratégies de modification d une d voie de signalisation (3) Transfection cellulaire Transfection d un gène normal ou muté dans une cellule hôte Surexpression de forme mutée «dominant négatif» 31 Stratégies de modification d une d voie de signalisation (4) Transgénèse chez l animal Surexpression d un gène : transgénèse additive Invalidation d un gène : transgénèse substitutive par recombinaison homologue : souris Knock-Out (KO) Cellules ES : cellules souches embryonnaires 32
Stratégies de modification d une d voie de signalisation (5) Invalidation d un gène : souris hétérozygotes et homozygotes Knock-out conditionnel et spécifique de tissu: système CRE-Lox rocessus de recombinaison sous contrôle d un promoteur spécifique de tissu Substitution d un gène par un autre : souris Knock-in (KI) 33 b. Intégration des 3 dimensions : nature, lieu, temps Quelle spécificité du signal? Car nombreux éléments communs : rincipes d activation Intermédiaires communs Interactions protéine-protéine Effets biologiques Régulation spatio-temporelle : Compartimentalisation Cinétique des activations 34
Nature : spécificit cificité des signaux et des récepteurs r (1) Diversité des ligands Dimérisation de diverses isoformes du récepteur à l EGF : - HER1 (ou EGFR ou erbb1), HER2, HER3 et HER4. Rq: HER3 est dépourvu d activité tyrosine kinase. - Homo- ou hétérodimères - Expression variable 35 Nature : spécificit cificité des signaux et des récepteurs r (2) Dimérisation et diversité des effets biologiques. 36
Nature : voies des MAKs Familles de MAK : ERK1, 2, 3 JNK1, 2, 3 p38 α,β,γ,δ Activation par cascade de phosphorylation: MAKKK (MEKK) : ser/thr kinase MAKK (MEK): ser/thr et tyr kinases Signaux cellulaires: Cycle cellulaire Différenciation Survie/apoptose Localisation des cibles: Cytosolique Nucléaire 37 LIEU : SCAFFOLD, ANCHOR, DOCKING, ADATOR rotéines d assemblage d de complexes macromoléculaires culaires 3 rôles clés dans les voies de tranduction de signaux : 1. Reproupe les composants de la voie de signalisation dans un complexe multiprotéique très spécifique 2. Efficacité : présente les substrats aux enzymes séquentiellement et dans une orientation idéale pour une efficacité optimum. 3. Cible le complexe et donc le signal vers une localisation cellulaire spécifique 38
Complexe multiprotéique ique avec KSR Localisation cytosolique KSR constitutivement associé : MEK, 14-3-3, phosphatase inactive (2A) IM (impedes mitogenic signal propagation) kinases (C-TAK, etc ) Régulation par phosphorylation/dépho s-phorylation 39 Compartimentalisation et durée e du signal Réponses différentielles des ERK aux facteurs de croissance: EGF et DGF Réponse spatio- temporelle spécifique sur des fibroblastes 40
Bilan des régulations r spatio-temporelles temporelles d ERK et des réponses r cellulaires Effet spécifique dépend du type cellulaire Fibroblastes Cellules C12 : EGF : prolfération cellulaire NGF : différentiation neuronale Effet spécifique dépend de la durée, de l intensité et de la localisation cellulaire du signal. Ebisuya, M. et al. J Cell Sci 2005;118:2997-3002 41 II. Le réseau r de la signalisation cellulaire 1. Interactions et transducteurs a. Domaines spécialisés d interaction b. Familles de récepteurs c. Diversité des relais 2. léïotropie d un signal 3. Intégration de signaux par la cellule 42
Domaines protéiques pour des interactions spécifiques Site secondaire Site primaire SH2 I --X-X-hy- Domaine «Src Homology 2» 100 aa Spécificité: phosphotyrosine et environnement côté C-terminal SH3 Domaine «Src Homology 3» 60 aa Spécificité: proline TB I -hy-x-n--x-- Domaine «hospho-tyrosine Binding» 200 aa Spécificité: phosphotyrosine et environnement côté N-terminal --X-X--X- WW Domaine avec Tryptophane (W) 40 aa Spécificité: proline 14.3.3 I -R-S-X-S-X-- DZ Dimère de protéine 14.3.3 Spécificité: phosphosérine Domaine 100 aa Spécificité: extrémité C-terminale ---X-- H +++ +++ +++ hospholipides Domaine «leckstrin Homology» 100 aa Spécificité: interaction avec phospholipides membranaires -E-S/T-D-V-COOH 43 Familles de récepteursr 44
rotéines relais et Domaines d Interactiond 45 Activation de relais protéiques sans activité catalytique Amarrage «docking» Adaptateur rotéine G GD Inactif effecteur effecteur GT Activé 1 2 3 4 effecteur effecteur Interactions effectrices 3 1 2 4 effecteur GT effecteur 46
léï éïotropie d un signal (1) Récepteur à l EGF : protéine d amarrage Mb Shc Grb2 -sos LCγ rolifération Motilité Différenciation Apoptose I3K 47 léï éïotropie d un signal (2) 48
Intégration de différents signaux Régulation de la croissance cellulaire Inter-relations entre différentes voies de signalisation : a. S/u Gα activée pour différents récepteurs couplés aux protéines G b. Transactivation de récepteurs Tyrosine kinases par RCG c. Diversité liée à hétérodimérisation de RTK d. Interaction nucléaire avec les signaux stéroïdiens 49 Requiem du cancer Implication des voies de signalisation de la prolifération ration cellulaire. 50