Régulation du Glypican-3 par de nouveaux MicroARNs dans le Carcinome Hépatocellulaire Flora Cartier Sous la direction de Christophe Grosset Laboratoire de Physiopathologie du Cancer du Foie INSERM U1053 Université de Bordeaux Directeur: Jean Rosenbaum 24 septembre 2014
Nous déclarons aucun conflit d intérêt Régulation du Glypican-3 par de nouveaux MicroARNs dans le Carcinome Hépatocellulaire 24/09/14 2
Contexte scientifique Régulation des gènes par les micro-arns dans le cancer du foie chez l enfant et l adulte Carcinome hépatocellulaire (CHC) Le plus fréquent de tous les cancers primitifs chez l adulte Incidence mondiale annuelle: 500 000 nouveaux cas/an Foie pathologique (cirrhose) Principales étiologies: VHB, VHC, alcool, diabète, obésité Mauvais pronostic 15% de survie après 5 ans 24/09/14 3
Le Glypican-3 (GPC3): une cible thérapeutique d intérêt Plusieurs anticorps anti-gpc3 en cours d essai précliniques et cliniques Protéine extramembranaire : Famille des protéoglycanes à sulfates d héparane Surexpression chez 72 % des patients atteints d un CHC Cytoplasme Marqueur diagnostique et pronostique Corécepteur: Activation de la voie Wnt/βcaténine (Midorikawa Y et al, 2003, Filmus J et al, 2013) Noyau Carcinogenèse hépatique 21/03/14 4
Les microarns: Des régulateurs post-transcriptionnels de l expression génique Les micro-arns: petits ARNs non codants ( 20 nucléotides) Régulateurs généralement négatifs de l expression génique Dégradation de l ARN messager Inhibition de la traduction Coiffe 5 RISC (RNA-induced silencing complex) 3 AAAAA Expression fortement altérée dans le cancer: OncomiRs: mir-21 Suppresseurs de tumeur: Let-7, mir-34a Noyau 24/09/14 5
Objectif de notre étude: Identification des microarns régulateurs de l expression du GPC3 mir-1271 (Maurel M et al, 2013, Hepatology) Rôle dans la carcinogenèse hépatique 24/09/14 6
1712 Principe du crible fonctionnel: Dual Fluorescence FunReg Crible 1 aire : Sélection de 30 microarns (Fold change GFP/Tomato - 0,5 et 0,5) 30 microarns Elimination de 10 faux positifs Crible 2 aire Spécificité de ciblage des 20 candidats 24/09/14 7
Effet des micrornas sélectionnés sur l expression endogène du GPC3 mirnas designation Effect /Probable site of interaction Membrane expression by Flow cytometry (% of effect) Total expression by Western blot (% of effect) N=4 Mann Whithney test, mean of percentage inhibition, *p 0.05, **p 0.01, p 0.001. GPC3 mir-a -/ 3 UTR - 0,50-0,60 mir-e -/ 5 UTR - 0,50-0,36 mir-f - /3 UTR - 0,35-0,5 mir-g - /3 UTR - 0,35-0,3 * mir-d mir-b - /3 and 5 UTR - /3 and 5 UTR - 0,27 * - 0,30 * - 0,07 NS - 0,34 * mir-h - /3 UTR - 0,26 * -0,35 * mir-i - /3 UTR + 0,15 NS + 0,70 mir-c - /5 UTR - 0,22 NS -0,32 * mir-j - /3 UTR + 0,65 + 0,30 * mir-k + /3 UTR + 0,09 NS - 0,20 NS mir-l + /3 UTR - 0,20 NS - 0, 2 NS mir-m + /3 UTR 0 NS 0 NS mir-n - /3 UTR -0,09 NS 0 NS mir-o - /3 UTR - 0,10 NS -0,26 NS mir-p - /3 UTR 0 NS - 0,03 NS Si-GPC3 mir-q - /3 UTR 0 NS + 0,08 NS Si-ctl mir-a mir-e mir-f mir-g mir-j mir-b mir-h mir-c mir-d mir-r -/3 UTR - 0,05 NS -0,2 NS 24/09/14 8 mir-i Quantification par rapport à la quantité de protéines totales
4 micrornas sont moins exprimés dans le foie tumoral/péritumoral 19 patients atteints d un CHC mir-a Tissu tumoral Tissu péri-tumoral mir-b Mann Whitney test, mean + SD,*p 0,05, **p 0,01 p 0,0001. 2.5 1007 1.1 1009 1.5 1010 1.1 1012 (copy/µg total RNA) (copies/µg total RNA) 2.0 1007 1.5 1007 1.0 1007 5000000.0 0.0 mir-c 2.5 1007 2.0 1007 1.5 1007 1.0 1007 5000000.0 0.0 NTL NTL Tumor ** Tumor (copies/µg total RNA) (copies/µg total RNA) 3.4 1007 1.0 1006 3.3 1004 1.3 1008 6.7 1007 3.4 1007 1.7 1007 8.4 1006 4.2 1006 2.1 1006 1.0 1006 NTL NTL umor umor (copies/µg total RNA) 1.0 1010 5.0 1009 0.0 NTL mir-d 24/09/14 9 (copies/µg total RNA) 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 NTL Tumor * Tumor (copies/µg total RNA) (copies/µg total RNA) 3.4 1010 1.1 1009 3.4 1007 1.0 1006 3.3 1004 1.0 1003 3.4 1007 1.7 1007 8.4 1006 4.2 1006 2.1 1006 1.0 1006 5.2 1005 2.6 1005 NTL NTL umor umor
Ces 4 micrornas sont sous exprimés dans le foie tumoral/foie NT Foies non tumoraux N=20 CHC N=98 Relative expression of mir-4510 A 3.1 10-02 9.8 10-04 3.1 10-05 9.5 10-07 NT mir-a CHC Relative expression of mir-203a-3p B 3.2 1001 1.0 1000 3.1 10-02 9.8 10-04 3.1 10-05 9.5 10-07 NT mir-b * CHC Relative expression of mir-548aa C 1.0 1000 3.1 10-02 9.8 10-04 3.1 10-05 9.5 10-07 NT mir-c * CHC Relative expression of mir-548v D 3.1 10-02 9.8 10-04 3.1 10-05 9.5 10-07 NT mir-d 24/09/14 10 * CHC
Effet de ces microarns sur la prolifération des cellules tumorales Huh-7 J0: Transfection des microarns dans les cellules Huh-7 J1- J3- J6: Mesure de la prolifération cellulaire Si control (si-ctl) Absorbance (492nm) 2.0 1.5 1.0 0.5 Cell growth ** * si-ctl si-gpc3 mir-34a-5p Si-GPC3 200µm µm 200µm µm 0.0 Day 1 Day 3 Day 6 mir-34a-5p N=5 Two way ANOVA test, Bonferroni post test, *p 0,05, p 0.001. 200µm µm 24/09/14 11
Effet de ces microarns sur la prolifération des cellules tumorales Huh-7 mir-a Absorbance (492nm) 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 mir-4510 ** Day 1 Day 3 Day 6 si-ctl si-gpc3 mir-4510 mir-a N=5 200µm Two way ANOVA test, Bonferroni post test, **p 0,01, p 0.001. mir-b mir-203a-3p Absorbance (492nm) 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ** Day 1 Day 3 Day 6 si-ctl si-gpc3 mir-203a-3p mir-b N=5 200µm Two way ANOVA test, Bonferroni post test, **p 0,05, p 0.001. 24/09/14 12
Effet de ces microarns sur la prolifération des cellules tumorales Huh-7 mir-c Absorbance (492nm) 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 mir-548aa ** Day 1 Day 3 Day 6 si-ctl si-gpc3 mir-548aa mir-c N=5 200µm Two way ANOVA test, Bonferroni post test, **p 0,01, p 0.001. mir-d Absorbance (492nm) 2.0 1.5 1.0 0.5 mir-548v ** ** si-ctl si-gpc3 mir-548v mir-d 200µm 0.0 Day 1 Day 3 Day 6 N=5 Two way ANOVA test, Bonferroni post test, **p 0,01, p 0.001. 24/09/14 13
Effet des microarns sur l apoptose des cellules tumorales Huh-7 Etude de l activité des caspases 3/7 Marquage Annexine V- 7AAD Luminescence (RLU, Blank Subtracted) 150000 100000 50000 0 Caspase activity N=4 One way ANOVA test, Bonferroni post test, p 0.001. 24/09/14 14 si-ctl si-gpc3 mir-4510 mir-203a mir-548aa mir-548v Percentage of apoptotic cells (%) 30 20 10 0 si-ctl si-gpc3 Total apoptosis mir-4510 mir-203a mir-548aa mir-548v
CONCLUSION mirnas designation Effect /Probable site of interaction Membrane expression by Flow cytometry (% of effect) Total expression by Western blot (% of effect) Tumoral/Peri tumoral (19 patients) HCC (98)/ Heathy donors(20) Proliferation Apoptosis mir-a -/ 3 UTR - 0,50-0,60 YES mir-b - /3 and 5 UTR - 0,07 NS - 0,34 * NO mir-c - /5 UTR - 0,22 NS -0,32 * NO mir-d - /3 and 5 UTR - 0,27 * - 0,30 * NO 4 nouveaux microarns régulent l expression du GPC3 et sont sous-exprimés dans les tumeurs Ces 4 microarns inhibent la prolifération cellulaire mir-a induit l apoptose des cellules tumorales mir-1271 (Maurel M et al, 2013, Hepatology) La dérégulation de ces 5 microarns pourraient participer à la surexpression du GPC3 dans les tumeurs. 24/09/14 15
PERSPECTIVES Quel est le rôle des 4 microarns dans la carcinogenèse hépatique? Sénescence? Cycle cellulaire? Quel est le mode d action de mir-a? mir-a est prédit pour interagir avec l ARNm du GPC3 via sa région 3 NT mutation Quel est l effet de mir-a dans la croissance des cellules tumorales Huh-7 in vivo? Modèle de la CAM (membrane chorioallantoïdienne de poulet) 24/09/14 16
MERCI DE VOTRE ATTENTION Merci pour votre attention Laboratoire Physiopathologie du cancer du Foie, INSERM U1053 Jean Rosenbaum Remerciements: Equipe Cancer du foie: Christophe Grosset Sarah Lesjean Francis Sagliocco Emilie Indersie Martin Hagedorn Katarzyna Hooks Collaborateurs: INSERM U674 INSERM, Paris Jessica Zucman-Rossi Gabrielle Couchy Emilie Gelabale