Contrôle de l'expression génétique :

Contrôle de l'expression génétique : Les régulations post-transcriptionnelles

L'ARNm, simple intermédiaire entre le génome et les protéines? gène protéine

L'ARNm, simple intermédiaire entre le génome et les protéines? gène pré-arnm protéine ARNm ARNm

L'ARNm, simple intermédiaire entre le génome et les protéines? gène épissage pré-arnm stabilité protéine transport ARNm ARNm localisation traductibilité

Vue "classique" de l'expression génétique

Vue "contemporaine" de l'expression génétique

Contrôle du métabolisme des ARNm Le métabolisme des ARNm est contrôlé par deux grandes familles de facteurs : - Les protéines de liaison aux ARNm (RNA-BP) - Les ARN micro (mirna)

Les protéines de liaison aux ARN Les protéines de liaison aux ARN se lient à des séquences régulatrices présentes sur le pré-arnm ou l'arnm et servent d'adaptateurs aux différentes machineries contrôlant le métabolisme Des ARN. Formation de complexes mrnp hautement dynamiques

Les protéines de liaison aux ARN

Les protéines de liaison aux ARN - Les protéines à domaines RRM (RNA Recognition Motif) ou RBD (RNA Binding Domain) Caractéristiques : 80 à 90 acides aminés avec deux motifs très conservés appelés RNP1 (R/K-G-F/Y-G/A-F/Y-V-X- F/Y) et RNP2 (L/I- F/Y-V/L-G/K-G/N-L) 1 à 5 domaines par protéine Structure : 1 feuillet β formé de 4 chaînes antiparallèles (β4 β1 β3 β2) + 2 hélices α Topologie : βαββαβ ARN cibles : ARN simples brins, tiges boucles, boucles internes

Les protéines de liaison aux ARN - Les protéines à domaines RRM (RNA Recognition Motif) ou RBD (RNA Binding Domain) Caractéristiques : 80 à 90 acides aminés avec deux motifs très conservés appelés RNP1 (R/K-G-F/Y-G/A-F/Y-V-X- F/Y) et RNP2 (L/I- F/Y-V/L-G/K-G/N-L) 1 à 5 domaines par protéine Structure : ARN cibles : 1 feuillet β formé de 4 chaînes antiparallèles (β4 β1 β3 β2) + 2 hélices α Topologie : βαββαβ ARN simples brins, tiges boucles, boucles internes

Les protéines de liaison aux ARN - Les protéines à domaines KH (hnrnp K homologue) Caractéristiques : 60 à 70 acides aminés avec un motif très conservé : V I G X X G X X I 1 à 10 domaines par protéine Structure : 1 feuillet β formé de 3 chaînes antiparallèles + 3 hélices α Topologie : βααββα ARN cibles : ARN simples brins

Les protéines de liaison aux ARN - Les protéines à domaines Ds-RBD (Double strand RNA Binding Domain) Caractéristiques : Environ 70 acides aminés Structure : 1 feuillet β formé de trois chaînes antiparallèles + 2 hélices α Topologie : αβββα ARN cibles : ARN partiellement ou complètement doubles brins

Maturation différentielle du pré-arnm : l'épissage alternatif

Maturation du pré-arnm ADN génomique transcription coiffe coiffage AUG polyadénylation pré-arnm exon intron exon épissage stop (A)n ARNm coiffe AUG stop (A)n export NOYAU CYTOPLASME coiffe AUG stop (A)n dégradation traduction proteine

I. Rappels sur la maturation du pré-arnm A. Le coiffage

Rappels sur la maturation du pré-arnm B. La polyadénylation Complexe de clivage AAUAAA Site de clivage CA U/GU-riche Site de Clivage 10-30 nt 30 nt Clivage USE AAUAAA Site poly(a) DSE Aux DSE 5 3 AAUAAA Riche en U Hautement CA Riche en U conservée et GU U/GU-riche Dégradation Addition de la queue poly(a) AAUAAA

Rappels sur la maturation du pré-arnm C. L Epissage exon SR intron exon GU site 5 Site de branchement séquence polypyrimidine AG site 3 S. Cerevisiae Vertébrés GUAUGU GUA A G U (GURAGU) UACUAAC C C C U G A C (YNCURAY) Réalisé au sein d'un complexe ribonucléoprotéique : Comprend : - 5 ARNsn : U1, U2, U4, U5, U6 associés à des protéines pour former les snrnp U1, U2, U5 et la disnrnp U4/U6.

Rappels sur la maturation du pré-arnm L Epissage exon SR intron exon GU site 5 Site de branchement séquence polypyrimidine AG site 3 S. Cerevisiae Vertébrés GUAUGU GUA A G U (GURAGU) UACUAAC C C C U G A C (YNCURAY) Réalisé au sein d'un complexe ribonucléoprotéique : le splicéosome Comprend : - 5 ARNsn : U1, U2, U4, U5, U6 associés à des protéines pour former les snrnp U1, U2, U5 et la disnrnp U4/U6.

Rappels sur la maturation du pré-arnm snrnp U1

Rappels sur la maturation du pré-arnm L Epissage exon SR intron exon GU site 5 Site de branchement séquence polypyrimidine AG site 3 S. Cerevisiae Vertébrés GUAUGU GUA A G U (GURAGU) UACUAAC C C C U G A C (YNCURAY) Réalisé au sein d'un complexe ribonucléoprotéique : le splicéosome Comprend : - 5 ARNsn : U1, U2, U4, U5, U6 associés à des protéines pour former les snrnp U1, U2, U5 et la disnrnp U4/U6. - Une centaine de protéines différentes = facteurs d'épissage.

Rappels sur la maturation du pré-arnm complexe E Mise en place séquentielle du spliceosome complexe A complexe B (+ATP) (+ATP) 1ère réaction de transestérification complexe C (+ATP)

Rappels sur la maturation du pré-arnm complexe E Mise en place séquentielle du spliceosome complexe A complexe B (+ATP) (+ATP) 2ème réaction de transestérification complexe C (+ATP)

Reconnaissances des sites 5' et 3' d'épissage intron GU site 5 Site de branchement séquence polypyrimidine AG site 3 S. Cerevisiae Vertébrés GUAUGU GUA A G U (GURAGU) UACUAAC C C C U G A C (YNCURAY)

Reconnaissances des sites 5' et 3' d'épissage 5' 3' 5' 3' 5' 3'3' 5' 5' 5' 3'

Reconnaissances des sites 5' et 3' d'épissage U2 U1 U1 U2 U1 U2 U1 U1 U2 U2 U2 U1 U2 U1 U2 U1 5' 3' 5' 3' 5' 3'3' 5' 5' 5' 3'

Reconnaissances des sites 5' et 3' d'épissage U2 U1 U2 U1 U2 U2 U2 U1 U2 U1 U2 5' 3' 5' 3' 5' 3'3' 5' 5' 5' 3' U1 U1 U1 U1 U1 U1

Reconnaissances des sites 5' et 3' d'épissage U1 U1 U2 U2 U1 U2 U1 5' 3' 5' 3' 5' 3'3' 5' 5' 5' 3' U1 U2 U1 U2 U1 U2 U1 U1 U1 U2

Définition intronique versus définition exonique SR 70K ex 5 U1 U2 65 35 U2AF ex 3 Définition intronique - levure - drosophile U2 65 SR 70K 65 35 U2AF SR U1 Définition exonique - vertébrés

Définition intronique versus définition exonique Définition intronique SR U2 3' U1 U2 U2 5' 3' 3'

Définition intronique versus définition exonique Définition intronique SR U2 U1 U2 U2 3' 5' 3' 3'

Définition intronique versus définition exonique Définition intronique SR U1 U2 3' 5' 3' 3' Définition exonique SR U2 U2 U1 U2 3' 3' 5' 3'

Définition intronique versus définition exonique Définition intronique SR U1 U2 U2 3' 5' 3' 3' Définition exonique U2 U2 SR U1 U2 3' 3' 5' 3'

Définition intronique versus définition exonique Définition intronique SR U1 U2 3' 5' 3' 3' Définition exonique SR U2 U2 U1 3' 3' 5' 3'

Définition exonique des exons terminaux Exon 5' terminal Exon interne Exon 3' terminal

II. L'épissage alternatif Définitions : Epissage alternatif : sélection différentielle de sites d'épissages fonctionnels à l'intérieur d'un même pré-arnm Polyadénylation alternative : sélection différentielle de signaux de polyadénylation fonctionnels à l'intérieur d'un même pré-arnm

A. Les différents évènements d épissage alternatifs exon cassette exons mutuellement exclusifs site 5' alternatif site 3' alternatif intron alternatif

Plusieurs groupes d'exons alternatifs peuvent être présents dans un préarnm 12 X 48 X 33 X 2 = 38000 combinaisons théoriques!

B. Les différents évènements de polyadénylation alternative pa1 pa2 AUG stop 1 2 Signaux de polyadénylation en tandem pa1 AUG stop stop pa2 1 2 3 Exons 3' terminaux alternatifs pa1 AUG stop stop pa2 1 2 2' 3 Exon composite interne/terminal site 5'

C. Prévalence de l épissage alternatif Trois méthodes pour l'étudier : 1. Analyse et comparaison des séquences EST 2. Analyse de puces ADN dédiées à l'épissage 3. Séquençage massif des ARNm présents dans différents tissus

C. Prévalence de l épissage alternatif 1. Analyse et comparaison des séquences EST Séquence EST : Expressed Sequence Tag : Séquence partielle d'un ADNc issue d'un séquençage massif et systématique des clones contenus dans une banque ADNc 5' 3' Les séquences EST sont représentatives de l'expression d'un gène dans un tissu donné.

C. Prévalence de l épissage alternatif EST muscle squelettique EST cerveau 1 ) comparaison des séquences EST entre elles

C. Prévalence de l épissage alternatif 2 ) comparaison des séquences EST avec le génome Muscle squelettique Cerveau

C. Prévalence de l épissage alternatif 2. Analyse de puces ADN dédiées à l'épissage Rappels puces à ADN Les niveaux d'expression de milliers de gènes dans une cellule peuvent être déterminés en mesurant la quantité d'adn lié sur chaque site

C. Prévalence de l épissage alternatif Utilisation de puces avec des séquences qui correspondent aux exons et aux différentes combinaisons de jonctions

C. Prévalence de l épissage alternatif 3. Séquençage massif des ARNm présents dans différents tissus Séquenceurs de nouvelles générations 454 1 million de séquences (500 pb) par run Solexa > 100 millions de séquences (30 pb) par run Solid > 100 millions de séquences (30 pb) par run

C. Prévalence de l épissage alternatif alignement sur le génome ou un transcriptome de référence

C. Prévalence de l épissage alternatif alignement des "reads" sur le génome ou un transcriptome de référence Tissu 1 Tissu 2

C. Prévalence de l épissage alternatif Chez l'homme?? % des gènes avec plusieurs exons produisent des transcrits alternatifs. Références : A Global View of Gene Activity and Alternative Splicing by Deep Sequencing of the Human Transcriptome Marc Sultan et al. Sciences 2008 321 pp. 956-960 Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Pan Q et al. Nat. Genet. 2008;40 pp 413-1415,

C. Prévalence de l épissage alternatif Chez l'homme 95 % des gènes avec plusieurs exons produisent des transcrits alternatifs. Références : A Global View of Gene Activity and Alternative Splicing by Deep Sequencing of the Human Transcriptome Marc Sultan et al. Sciences 2008 321 pp. 956-960 Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Pan Q et al. Nat. Genet. 2008;40 pp 413-1415,

D. Fonctions biologiques de l épissage alternatif 1. Synthèse de protéines différentes Ex : le pré-arnm CT/CGRP inhibiteur de la résorption osseuse neurotransmetteur + vasodilatateur

D. Fonctions biologiques de l épissage alternatif 2. Synthèse de nombreuses isoformes Les exons correspondent souvent à des domaines fonctionnels

D. Fonctions biologiques de l épissage alternatif 2. Synthèse de nombreuses isoformes Changement de localisation Ex : le pré-arnm des immunoglobulines

D. Fonctions biologiques de l épissage alternatif 2. Synthèse de nombreuses isoformes Modification de l activité enzymatique, de la capacité de liaison Ex : le pré-arnm FGFR2 IIIb IIIc IIIb IIIc Isoforme liant le FGF Isoforme liant le FGF et le KGF

D. Fonctions biologiques de l épissage alternatif 2. Synthèse de nombreuses isoformes Modification de la capacité d interaction protéines/protéines Ex1 : le pré-arnm du facteur de transcription kruppel

D. Fonctions biologiques de l épissage alternatif 2. Synthèse de nombreuses isoformes Modification de la capacité d interaction protéines/protéines Ex2 : le pré-arnm du facteur de transcription Pbx2

D. Fonctions biologiques de l épissage alternatif 3. Régulation de l expression d un gène via le NMD Le NMD (Nonsense Mediated Decay) :

D. Fonctions biologiques de l épissage alternatif 3. Régulation de l expression d un gène via le NMD Le NMD (Nonsense Mediated Decay) : mécanisme de surveillance de l ARNm qui reconnaît et dégrade rapidement les ARNm contenant un codon stop prématuré. Nécessite la traduction de l'arnm Règle du NMD chez les vertébrés

D. Fonctions biologiques de l épissage alternatif 3. Régulation de l expression d un gène via le NMD Les jonctions exons/exons sont marquées par le dépôt d un complexe protéique : EJC (Exon Junction Complex) transcription ADN génomique pré-arnm cap AUG exon intron exon stop (A)n épissage ARNm cap AUG -24-24 EJC stop (A)n L EJC comporte plusieurs protéines Il s assemble : - durant l épissage NOYAU CYTOPLASME - 24 nt en amont de la jonction exon/exon - indépendamment de la séquence en ARN

D. Fonctions biologiques de l épissage alternatif 3. Régulation de l expression d un gène via le NMD pre-arnm épissage Le noyau de l'ejc est formé de 4 protéines ARNm ARNm Magoh eif4aiii noyau cytoplasme Y14 MLN51

D. Fonctions biologiques de l épissage alternatif 3. Régulation de l expression d un gène via le NMD Pre-ARNm cap AUG exon intron exon stop (A)n splicing EJC ARNm cap AUG TAP/p15 stop (A)n La composition de l'ejc évolue au cours de la vie de l'arnm Upf3 export Noyau Cytoplasme Upf2 traduction cap AUG stop (A)n cap AUG stop (A)n

D. Fonctions biologiques de l épissage alternatif 3. Régulation de l expression d un gène via le NMD

D. Fonctions biologiques de l épissage alternatif 3. Régulation de l expression d un gène via le NMD

D. Fonctions biologiques de l épissage alternatif 3. Régulation de l expression d un gène via le NMD Ex 1 : le pré-arnm FGFR2 IIIb IIIc stop IIIb IIIc IIIb stop IIIc NMD isoforme liant le FGF Isoforme liant le FGF et KGF NMD

D. Fonctions biologiques de l épissage alternatif 3. Régulation de l expression d un gène via le NMD Ex 1 : le pré-arnm FGFR2 IIIb IIIc CAU GGA GCC... AG A CGT AAA ATG AGC CAU GGA GAA... AG A CGT AAA ATG AGC CAU GGA ACG TAA AAT GAG CAU GGA GCC... AG AAN G AC GTA AAA TGA GC G...

D. Fonctions biologiques de l épissage alternatif 3. Régulation de l expression d un gène via le NMD Ex 2 : le pré-arnm PTB 9 10 11 12 9 10 11 12 PTB 9 10 11 12 PTB stop 9 10 12

D. Fonctions biologiques de l épissage alternatif 3. Régulation de l expression d un gène via le NMD Ex 3 : les pré-arnm des protéines SR autorégulation par l'épissage d'un exon "poison" stop + protéine SR

D. Fonctions biologiques de l épissage alternatif 4. Production d'arn possédant des séquences 3' UTR différentes stop stop 3' UTR1 3' UTR2 Conséquences sur : - La stabilité de l'arnm - La localisation de l'arnm - La traductibilité de l'arnm

E. Le contrôle tissulaire de l'épissage complexe E complexe A (+ATP) complexe B (+ATP) complexe C (+ATP)

1. Méthodes d'études de l'épissage alternatif L'épissage alternatif est étudié par une combinaison de différentes approches : - Approches génétiques - Approches in vivo - Approches in vitro et biochimiques - Approches génomiques - Approches bioinformatiques

2. Le modèle de la drosophile X 2L 2R 3L 3R 4 X Y Sexe déterminé par : nombre de chromosome X / nombre de jeu d autosomes ratio 0,5 ratio 1

Une cascade d'épissages alternatifs contrôle la détermination du sexe

Synthèse du facteur sxl (sex lethal) chez la femelle

sxl contrôle l'épissage de son propre pré-arnm stop 1 2 3 4 5 6 7 8 stop 1 2 3 4 5 6 7 8 stop 1 2 3 4 5 6 7 3 1 2 sxl sxl 4 5 6 7 8 1 2 4 5 6 7 sxl

sxl contrôle l'épissage du pré-arnm tra (transformer)

sxl contrôle l'épissage du pré-arnm tra (transformer) stop 1 2 2' 3 site 3' stop 1 U 2 AF 2 2' 3 stop 1 2 2' 3 1 sxl 2 U 2 AF 2' 3 1 2' 3 tra

tra contrôle l'épissage du pré-arnm dsx (double sex)

tra contrôle l'épissage du pré-arnm dsx (double sex)

3. Les éléments qui contrôlent l'épissage alternatif Les exons alternatifs sont définis par des sites faibles composition et longueur AAUAAA U ou G/U riche distance

3. Les éléments qui contrôlent l'épissage alternatif Des séquences régulatrices modulent la reconnaissance des sites d'épissages Ces séquences peuvent être : - activatrices ou inhibitrices - présentes dans les exons ou les introns ESE ESS ISE ISS Exonic Splicing Enhancer Exonic Splicing Silencer Intronic Splicing Enhancer Intronic Splicing Silencer

3. Les éléments qui contrôlent l'épissage alternatif Des RNA-BP se lient aux séquences régulatrices Ces RNA-BP appartiennent à trois grandes familles : les protéines SR les hnrnp les hnrnp-like

3. Les éléments qui contrôlent l'épissage alternatif hnrnp-like : Protéines de la famille CELF Protéines de la famille NOVA

3. Les éléments qui contrôlent l'épissage alternatif Les protéines SR SRp20 SC 35 SRp46 SRp54 9G8 SRp30c ASF/SF2 SRp40 SRp55 SRp75

3. Les éléments qui contrôlent l'épissage alternatif Les protéines SR

3. Les éléments qui contrôlent l'épissage alternatif Les protéines SR Les protéines SR se concentrent dans des régions inter chromatiniennes du nucléoplasme : les speckles

3. Les éléments qui contrôlent l'épissage alternatif Les enhancer exoniques (ESE) Favorisent la définition exonique

3. Les éléments qui contrôlent l'épissage alternatif Les enhancer exoniques (ESE) Favorisent la définition exonique Recrutement de facteurs : fonction dépendante du domaine RS Inhibition : fonction indépendante du domaine RS

3. Les éléments qui contrôlent l'épissage alternatif Différents mécanismes d'actions des ESS et ISS

3. Les éléments qui contrôlent l'épissage alternatif Les séquences régulatrices inhibitrices et activatrices sont très souvent chevauchantes Compétition pour la liaison de facteurs sur ces séquences + - ESE ESS Compétition dépendante - expression tissulaire des facteurs - concentration cellulaire des facteurs - affinité pour la séquence regulatrice

3. Les éléments qui contrôlent l'épissage alternatif Les séquences régulatrices inhibitrices et activatrices sont très souvent chevauchantes Formation d'un complexe activateur ou inhibiteur

3. Les éléments qui contrôlent l'épissage alternatif Régulation résulte d'une combinatoire entre : - des séquences cis régulatrices présentes sur le pré-arnm et - des RNA-BP agissant en trans Objectif déterminer le code tissulaire de l'épissage alternatif - identifier à l'échelle du transcriptome les sites de liaison des RNA-BP - identifier à l'échelle du transcriptome les exons dont l'épissage est modifié consécutivement à l'inactivation d'une RNA-BP

3. Les éléments qui contrôlent l'épissage alternatif Ex : PTBP1 (hnrnpi) Identification de l'ensemble des ARN liés par PTBP1 dans les cellules HeLa Conséquence de l'inactivation de PTBP1 dans les cellules HeLa Analyse sur puces ADN des évènements d'épissage alternatifs pour ~ 24000 gènes 196 exons alternatifs sont activés (réprimés en présence de PTBP1) 67 exons alternatifs sont réprimés (activés en présence de PTBP1) site 5' faible

4. Régulation co-transcriptionnelle de l'épissage alternatif Il existe un couplage fonctionnel entre la transcription et l'épissage Gènes placés sous le contrôle de promoteur pol I ou pol III - Pas d'épissage et de clivage/polyadénylation Transcription dirigée par une ARN pol II tronquée du domaine CTD - Pas d'épissage et de clivage/polyadénylation Interaction directe entre le domaine CTD de l'arn pol II et les facteurs de maturation du pré-arnm

4. Régulation co-transcriptionnelle de l'épissage alternatif Comparaison des profils d'épissage obtenus à partir de minigènes ou de pré-arnm transcrits in vitro. Effets de la structure des promoteurs sur le profil d'épissage EDI Exon EDI du pré-arnm de la fibronectine (FN)

4. Régulation co-transcriptionnelle de l'épissage alternatif Différence dans la vitesse d'élongation de la transcription Effet de la cinétique est dépendant de l'exon alternatif

4. Régulation co-transcriptionnelle de l'épissage alternatif Effet du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF (BRM) sur l'épissage du pré-arnm CD 44

4. Régulation co-transcriptionnelle de l'épissage alternatif SRp20 augmente le saut de l'exon EDI EDI Srp20 SRp20 - +

4. Régulation co-transcriptionnelle de l'épissage alternatif La délétion du domaine CTD augmente l'inclusion de l'exon EDI

4. Régulation co-transcriptionnelle de l'épissage alternatif SRp20 augmente le saut de l'exon EDI via le domaine CTD

4. Régulation co-transcriptionnelle de l'épissage alternatif Recrutement différentiel de facteurs d'épissage

F. Le saut d'exon thérapeutique (exon skipping) Espoir pour la myopathie de Duchenne... Dystrophine : Pré-ARNm : 79 exons ORF : 11055 nt Protéine : 427 kda X Mutations : décalage du cadre de lecture apparition d'un codon stop prématuré NMD pas de protéine

F. Le saut d'exon thérapeutique (exon skipping) Espoir pour la myopathie de Duchenne... Observation : des patients atteints de la myopathie de Becker (symptômes beaucoup moins sévères) expriment des dystrophines tronquées d'un certain nombre de motifs répétés Dystrophine normale Dystrophine chez des patients atteint de myopathie de Becker

F. Le saut d'exon thérapeutique (exon skipping) Espoir pour la myopathie de Duchenne... Observation : des patients atteints de la myopathie de Becker (symptômes beaucoup moins sévères) expriment des dystrophines tronquées d'un certain nombre de motifs répétés Dystrophine normale Dystrophine chez des patients atteint de myopathie de Becker Objectif sauter l'exon pour restituer le bon cadre de lecture X

F. Le saut d'exon thérapeutique (exon skipping) Espoir pour la myopathie de Duchenne... Plusieurs stratégies : - Cibler les séquences consensuelles d'épissage - Produire un ARN antisens à partir d'une construction virale

F. Le Le saut d'exon thérapeutique (exon skipping) Espoir pour la myopathie de Duchenne... Plusieurs stratégies : - Cibler les séquences ESE (plus spécifique) X51 - Injection d'oligonucléotides synthétiques tels que les morpholino oligonucléotides ARN antisens ciblant un ESE Plusieurs essais cliniques en cours phase II : recherche la plus petite dose efficace