Les circuits neuronaux responsables du Sommeil paradoxal

Les circuits neuronaux responsables du Sommeil paradoxal Pierre-Hervé Luppi DIU Physiologie et Pathologie du Sommeil, Lyon, Jeudi 18 Décembre 2014

Le sommeil paradoxal est présent chez le chat pontique Jouvet, 1962, Arch. Ital. Biol. A: animal intact B: decortication totale (chat pontique) C: section mésencephalique

Absence de SP ou SP sans atonie après lésion du noyau Sublaterodorsal (SLD) chez le chat Jouvet, 1962, Arch. Ital. Biol.

Le comportement onirique du chat Sastre et coll., 1979, Physiology & Behavior

Le comportement onirique du chat Sastre et coll., 1979, Physiology & Behavior Le trouble du comportement en SP

07h00 19h00 07h00 Organisation du cycle veille-sommeil chez le rat Waking SWS or nonrem sleep EEG EEG EMG EMG EOG Paradoxical (REM) sleep EOG EEG EMG EOG Hypnogram of 24h Sommeil total 12h50 (SL 10h50 min - SP 2h00 min) PS SWS W

Quel est le neurotransmetteur des neurones SP-on du SLD? Glutamate, acétylcholine ou GABA? Hybridation«In situ» du transporteur vésiculaire 2 du glutamate (vglut2) ou immunohistochimie de la GAD67 etde la cholineacétyltransférase (ChAt) combiné avec l immunohistochimie du C-Fos après hypersomnie de SP Coupe du SLD section marquée avec vglut2 et CFos neurones CFos/ vglut2 Conclusion: Les neurones SP-on du SLD expriment vglut 2 et sont glutamatergiques Clement et al., 2011

The inactivation of glutamate transmission of SLD neurons in rats using short hairspin RNA for vglut2 induces a RBD like behavior: In situ hybridization of vesicular glutamate transporter 2 (vglut2) mrna in the SLD Valencia Garcia et al., unpublished

Mise en évidence du réseau neuronal responsable du SP à l aide du modèle du rat en contention Implantation: - électrodes (EEG, EMG et EOG) - pièce de contention Séance quotidienne d enregistrement Traitement des coupes C-Fos J1 J3 J13 J16 J23 J26 Récupération Habituation à la contention Electrophysiologie Pharmacologie Ejection PHAL Electrophy Pharmaco Pharmaco Ejection CTbPerfusion du rat scp scp 5 1mm 1mm Injection de PHAL dans Injection le SLD de CTb dans le S

Mise en évidence du réseau neuronal responsable du SP à l aide de la neuroanatomie fonctionnelle D 1 D 2 D10 D 11-12 D 13-15 D 16 CTb Injection + Implantation EEG EMG post-operative recovery + Habituation Basal recordings 3 rats (48 hours) PS PS Rebound Deprivation 21 rat rats + Perfusion (72 hours) Mean PS quantities PS Control - Control : 14,6% SWS W - Deprivation : 0% PS SWS W Deprivation - Rebound : 50,4% PS SWS W Rebound 13 h 16 h

Induction de SP par l application d un agoniste glutamatergique, l acide kainique dans le SLD chez le rat vigile en contention (500 µm, 100 na, 5 mn)

Co-applications dans le SLD de bicuculline (antagoniste GABAergique) et d acide kynurénique (antagoniste glutamatergique) ou d atropine (antagoniste cholinergique) Boissard et al., 2002

Activité des neurones du SLD au cours du cycle veille-sommeil Etats Décharge (Hz) 9 neurones, 4 rats Sommeil Paradoxal 21.7±1.7 Eveil 1.1±0.2 Sommeil Lent 0.7±0.1

Pharmacologie des neurones SP-on du SLD au cours du cycle veille-sommeil (antagoniste GABAa) SP-like 67.1 Hz 12.3 Hz 12.4 Hz Luppi et al., 2004

Induction de SP par l application iontophorétique de longue durée de bicuculline dans le SLD (10 mm, 100 na, 90 mn) LDT scp SLD Localisation des neurones immunoréactifs au C-Fos dans le SLD après injection de 90 min de Bicuculline 500 µm Boissard et al., 2002

Efférences du SLD: double marquage C-Fos/PHA-L Neurones C-FOS positifs Fibres PHA-L positives Mc 50µm Mc

Effet de la strychnine sur les motoneurones pendant le SP chez le chat A. Control EEG EOG PGO EMG Membrane potential B. Strychnine EEG EOG PGO EMG Membrane potential Paradoxical sleep -60-70 30 s -60-70 Control Strychnine SWS PS (Soja et al., 1991) Des prémotoneurones glycinergiques hyperpolarisent les motoneurones pendant le SP

Projections descendantes du SLD activées par l application de bicuculline: double marquage PHA-L/Glycine et C-Fos/Glycine IO 20µm 100µm GiV Neurones immunoréactifs à la glycine et au C-Fos Dans le noyau gigantocellulaire ventral (GiV) Boissard et al., 2002

Les neurones glycinergiques responsables de l atonie du SP sont aussi GABAergiques Résultats Fos/GAD «in situ» GiV PSC PSD PSR Sapin et al., 2009

Second model of RBD: Inactivation of the vesicular GABA/glycine transporter (vgat) in the ventromedial medullary reticular formation using transfection with adenoviral vector of short hairpin RNA targeting the vgat mrna GiV GiV Visualization of the transfected neurons using mcherry as a fluorescent reporter gene Neurons lack expression of vgat in a large medullary region including the GiV (demonstrated using vgat «in situ» hybridization) Valencia Garcia et al., unpublished

Second model of RBD: VGAT knockout in the ventromedial medullary reticular formation produces PS without atonia. Valencia Garcia et al., unpublished

Le réseau neuronal responsable de la genèse du sommeil paradoxal Thalamus GABA? SLD GLU LC NA GiV Glycine Gia-GiV Spinal Motoneurons

Etude des afférences GABAergiques responsables de l inhibition au cours de l éveil et du sommeil lent des neurones SP-on du SLD vlpag ddpme CTb/GAD neurons Boissard et al., 2003 vlpag: substance grise périaqueducale ventrolatérale ddpme: partie dorsale du noyau profond du mésencéphale Fos/GAD neurons Sapin et al., 2009 PS deprivation

Injection de muscimol (agoniste GABAa) dans la région vlpag/ddpme Delta (1.5-4H z) Th eta (4.5-8.5 Sig Hz) ma (9-14Hz) Gam ma Sapin et al., 2009 (rats) paradoxical sleep Control (n =6) 11,8% Muscimol (n= 9) 29,8% Lu et al., Nature 2006 (rats) (30-50Hz) Muscl Hypnogr e am PS W S S Aq DRN vlpa GdDP 4 Me 1000µm Mus 90min 30 60 90 120150180210 min % Sastre et al., 1996 Crochet and Sakai, 2006 (cats) paradoxical sleep Control 15% Muscimol 33,3%

Voies nerveuses responsables du SP Thalamus ddpme GABA SLD GLU GiV Glycine Gia-GiV Spinal Motoneurons

Utilisation du modèle du rat en contention pour déterminer si le GABA est responsable de l arrêt au cours du sommeil paradoxal des neurones responsables de l éveil

Effet de l application au cours du sommeil paradoxal d un antagoniste du GABA (la Bicuculline) sur un neurone du LC EMG SL SP EEG Unit BIC (100nA) GABA BIC (100nA) Taux De Décharge 4 0 0 20 40 60 80 100 120 140 secondes Gervasoni et al., 1998 Des neurones GABAergiques de type SP-off arrêtent les neurones noradrénergiques et sérotoninergiques au cours du SP

Effet de l'application de bicuculline sur un neurone 5-HT du NRD au cours du sommeil paradoxal SL SP EMG EEG Unit Taux De Décharge 4 0 BIC (70nA) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 secondes Gervasoni et al., 2000

Localisation des neurones GABAergiques responsables en combinant le traçage rétrograde et le marquage des neurones GABAergiques Sites d'injection de CTb dans le LC et le NRD Neurones immunoréactifs à la GAD et rétrogradement marqués

Projections GABAergiques sur le LC et le NRD potentiellement responsables de leur arrêt au cours du SP PAG NRD LC DPGi VLPO HP DPGi: noyau dorsal paragigantocellulaire HP: hypothalamus postérieur LC: locus coeruleus NRD: noyau du raphé dorsal PAG: substance grise périaqueducale VLPO: noyau préoptique ventrolatéral Le sommeil paradoxal est présent chez le chat pontique

Mise en évidence des neurones GABAergiques inhibant le LC au cours du SP en combinant l immunohistochimie du C-Fos et de la CTb sur un modèle de privation de sommeil paradoxal chez le rat J 1 J 2 J10 J 11-12 J 13-15 J 16 Injection CTb dans LC Récupération post-opératoire + Habituation + Implantation 3 EEG 3 EMG Enregistrements témoins 3 rats (48 heures) Privation SP 2 rats (72 heures) Rebond SP 1 rat + Perfusion

Double marquage immunohistochimique CTb et c-fos LC 45 Site d injection de 0µ CTb dans le LC m 100µm 24µm Double marquage CTb/c-Fos au niveau du DPGi après rebond de SP Verret et al., 2004

Activité électrophysiologique d un neurone du DPGi au cours du cycle veille-sommeil. PA des neurones SP-on Goutagny et al., 2004

Les neurones responsable de la genèse du SP sont restreints au tronc cérébral mais Jouvet, 1962, Arch. Ital. Biol.

Résultats L hypothalamus tubéral latéral (LHA) contient un très grand nombre de neurones cfos/gad après hypersomnie de SP Number of cells PSD rzi PSC PSD PSR mlh PSR PSC PSD PSR PeF Fos/GAD neurons PSC PSD PSR

Immunohistochimie Résultats de l Hormone de melanoconcentration (MCH) combinée avec l hybridation de GAD67 Approximativement 1/3 des neurones GABAergiques actifs pendant le SP localisés dans l hypothalamus tubéral expriment la MCH

Les neurones MCH sont spécifiquements actifs pendant le SP: SP-on Hassani et al., 2009

L injection intracérébroventriculaire (icv) de MCH induit le SP Verret, Goutagny et al., 2003 La stimulation optogenetique des neurones MCH induit le SP Jego et al., 2013, Konadhode et al. 2013 MCH is an hypnogenic factor: Treatment of insomnia?

Les neurones SP-on de l hypothalamus tubéral latéral (LHA) induirait le SP en inhibant les neurones SP-off GABAergiques de la vlpag/ddpme? PSC PSD PSD VLPAG Aq DR PSR DpMe 4N Fos MCH c-fos/ctb c-fos/ctb/mch MCH CTb L hypothalamus tubéral latéral contient 12,2% de la totalité des neurones CTb/c-Fos chez les animaux en hypersomnie de SP après injection de CTb dans la vlpag/ddpme 44% de ces neurones sont MCH+

L injection de muscimol dans le LHA induit le Sommeil lent et inhibe le SP : les neurones du LHA jouent un rôle majeur dans le SP SP (min) Etat de type SL Inhibition of PS

Réseau du SP CORTICAL ACTIVATION Thalamus intralaminaire vlpag ddpme GABA GABA DRN 5 HT LC NA VLPO GABA Hcrt PH SCN MCH/GABA TMN HIS SLD Glutamate DPGi GABA GiV Gly/GABA Spinal motoneurons W-on neurons SWS-on PS-on PS-off neurons Inhibitory pathways Excitatory pathways MUSCL

Cataplexy CORTICAL ACTIVATION Motor cortex Thalamus RT vlpag ddpme GABA GABA DRN 5 HT LC NA Hcrt Central PH Amygdala Excitatory? TMN HIS SLD Glutamate GiV Gly/GABA Luppi et al., 2010 Spinal motoneurons W-on neurons SWS-on PS-on PS-off neurons Inhibitory pathways Excitatory pathways MUSCL

Cataplexy CORTICAL ACTIVATION Motor cortex Thalamus RT vlpag ddpme GABA GABA DRN 5 HT LC NA Hcrt Central PH Amygdala GABA TMN HIS SLD Glutamate GiV Gly/GABA Luppi et al., 2010 Spinal motoneurons W-on neurons SWS-on PS-on PS-off neurons Inhibitory pathways Excitatory pathways MUSCL

Excessive sleepiness CORTICAL ACTIVATION Thalamus RT vlpag ddpme GABA GABA BF Ach VLPO GABA Hcrt PH SCN MCH TMN HIS DRN 5 HT LC NA LdT/PPT Ach SENSORY INPUT W-on neurons SWS-on PS-on PS-off neurons Inhibitory pathways Excitatory pathways Fort P et al. Eur J Neurosci 2009;29:1741 53.

REM sleep behaviour disorder (RBD) CORTICAL ACTIVATION Motor cortex Thalamus RT SLD Glutamate GiV Gly/GABA Spinal motoneurons W-on neurons SWS-on PS-on PS-off neurons Inhibitory pathways Excitatory pathways MUSCL

Olivier Clément, Emilie Sapin, Damien Lapray, Romain Goutagny Romuald Boissard, Denise Salvert, Lucienne Leger, Laure Verret, Christelle Peyron, Damien Gervasoni and Patrice Fort Team "Physiopathology of the neuronal network of the sleep-waking cycle Centre of Neuroscience of Lyon UMR 5292 CNRS/U1028 INSERM, Lyon, France