8. Amplification et séquençage des acides nucléiques ADN chromosomique, plasmides (ADN bactérien), ARN messager Rupture cellulaire Isolation et purification des acides nucléiques Concentration et amplification et séquençage de l ADN ou de l ARN isolé 301
8.1 Extraction et isolation de l ADN (D après genetics.nbii.gov/ basic2.html) 302
Extraction et isolation de l ADN Échantillon de cellules ou de tissus Traitement avec une solution hypotonique ou avec des détergents (Triton X-100 et SDS) Rupture cellulaire et dissociation des complexes ADN-protéine Incubation séquentiel avec un enzyme protéolytique (protéinase K) et la ribonucléase Élimination de protéines et d ARN Extraction de l ADN dans de l éthanol Seules les longues chaînes d ADN précipitent dans l EtOH; les nucléotides simples et les produits de la digestion de l ARN restent dans la phase aqueuse. 303
Centrifugation par gradient de densité: Une méthode alternative pour l isolation de l ADN est la séparation de protéines, ARN et ADN selon des différences dans leurs densités flottantes ou poussées. Une telle séparation est effectuée en centrifugeant à haute vitesse l échantillon brut dans une éprouvette contenant un gradient de densité formé (ex. 1.6 à 1.8 g/ml) par une solution de CsCl. Lors de la centrifugation, les macromolécules (protéines, ADN, ARN) présentent dans la solution de CsCl forment des bandes distinctes selon leurs densités flottantes. (D après D. Holme et H. Peck, Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998) 304
L ADN chromosomique peut être séparé des plasmides par centrifugation par gradient de densité en présence du bromure d éthidium (EtBr). (D après D. Holme et H. Peck, Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998) L EtBr est un fluorophore qui se lie entre deux brins d ADN. En se liant à l ADN, l EtBr diminue la densité flottante de celle-ci, dû à un déroulement partiel de la double hélice. Il y a plus d EtBr qui se lie à l ADN chromosomique (ADN linéaire) qu aux plasmides (ADN circulaire). La densité de l ADN chromosomique est diminuée par 0.125 g/ml, tandis que que celle des plasmides est diminuée par 0.085 g/ml. 305
8.2 Isolation de l ARN L isolation de l ARN n est pas aussi simple que celle de l ADN: Les échantillons sont facilement contaminés par de la ribonucléase (omniprésente) qui cause la fragmentation de l ARN. Des d inhibiteurs sont ajoutés pour empêcher l activité endogène de la ribonucléase et l activité exogène est minimisée par l utilisation de verrerie stérile et de produits chimiques de haute pureté. L ARN est fortement associé à des protéines (polysomes). Des traitements agressifs sont nécessaires pour libérer l ARN. Deux méthodes communément employées pour l isolation de l ARN sont la méthode de la protéinase K (enzyme protéolytique qui cause la dissociation des complexes ARNprotéine et la digestion des protéines) et le traitement au thiocyanate de guanidine. 306
Méthode de la protéinase K Échantillon de cellules Traitement avec une solution hypotonique Centrifugation Rupture cellulaire; le noyau demeure intacte Élimination du débris et noyau cellulaire; l ARN cytoplasmique demeure dans le surnageant Traitement du surnageant avec la protéinase K Dissociation des complexes ARNprotéine et la digestion des protéines Extraction avec du phénol/chloroforme Extraction avec de l éthanol Élimination des produits de la digestion enzymatique Précipitation de l ARN dans 307 la phase aqueuse avec de l EtOH
Traitement au thiocyanate de guanidine Échantillon de cellules Traitement avec du thiocyanate de guanidine et du 2-mercaptoéthanol Rupture cellulaire et dénaturation de la ribonucléase Centrifugation du surnageant sur du CsCl (5.7 mol/l) à 100 000 g pendant 18 h Isolation de l ARN au fond du tube La pelote d ARN est dissout dans du tampon L ARN est concentré par précipitation dans de l éthanol froid Séparation et purification de l ARNm par chromatographie par affinité (oligo-dt-cellulose ou poly(u)-sépharose) 308
8.3 L amplification des acides nucléiques par réaction de polymérisation en chaîne La quantité d ADN dans un échantillon est souvent insuffisante pour le séquençage et l analyse. L amplification en chaîne par polymérase (ACP) est un procédé d'amplification enzymatique in vitro d'une séquence définie d'adn (Kary Mullis, Prix Nobel 1993). Une seule molécule d ADN suffit pour l ACP. Avec l ACP, plusieurs tâches qui avant étaient impossible sont maintenant devenues de routine (ex. identification d un coupable avec un seul cheveu ou spermatozoïde et l identification rapide de maladies infectieuses). Principes de l ACP ACP en temps réel (mesure semi-quantitative des produits de l ACP durant la réaction) Transcription inverse de l ARN en ADN complémentaire 309
8.3.1 Principes de l ACP La réaction d amplification est effectuée dans un seule éprouvette qui est placée dans un thermocycleur. L éprouvette contient: (1) l échantillon d ADN à amplifier (2) un excès de 2 amorces, i.e. des oligonucléotides, constitués de 10 à 30 bases, ayant des séquences complémentaires aux bouts de l ADN cible (3) un excès des 4 acides désoxyribonucléiques (datp, dctp, dgtp et dttp) (4) l ADN polymérase, une enzyme qui synthétise, à partir des amorces, le brin complémentaire de celui qui sert de matrice (5) un tampon qui maintient le ph à une valeur constante et fournit les ions Mg 2+ qui sont nécessaires à la réaction 310
La réaction d amplification est constituée de 3 étapes principales: Étape 1- dénaturation de l'adn (séparation des deux brins de la double hélice) à température élevée (94-95 C). Étape 2- positionnement des amorces en face de leurs séquences complémentaires, sur les brins d'adn, et fixation sur ces cibles (hybridation). 5 Étape 3- phase d'extension dans laquelle l'adn polymérase synthétise, à partir des amorces, le brin complémentaire de celui qui sert de matrice. (D après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 311
312
Les 3 étapes, dénaturation de l ADN, hybridation des amorces et extension des amorces, constituent un cycle. L ACP comporte généralement 20 à 35 cycles successifs d'amplification. Le chauffage et refroidissement répétitif du mélange réactionnel est communément appelé cycle thermique. Chaque étape dure 30 à 120 s. Seule la 1 ère étape de dénaturation dure 5 min. Une ACP de 30 cycles peut être donc complétée dans 1 à 2 hres. (D après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 313
En théorie, le nombre de copies d ADN est doublé dans chaque cycle. Le nombre théorique de molécules d ADN (double brins), N m, à la fin de la réaction dépend du nombre initial de molécules d ADN (double brins), N o, dans le mélange réactionnel et du nombre de cycles, n: N = 2 m N o n Ce nombre théorique n est jamais atteint dus à des facteurs limitants, tels que l épuisement des réactifs et l amplification de chaînes plus longues durant les premiers cycles. En pratique, le nombre de molécules d ADN peut être estimé selon l équation: N = N ( 1+ x) où x est l efficacité de la réaction (valeur de 0 à 1). m o n 314
Par exemple, pour une réaction d amplification de 20 cycles (n=20) avec une seule molécule d ADN à double brins (N o =1), le nombre théorique de copies à la fin de la réaction est > 10 6 (=2 20 ). Si on suppose une efficacité de la réaction de 0.7 (x), la réaction est estimée à produire une amplification d environ 40 000 (=1.7 20 ). L efficacité et le rendement ne sont pas les seuls indicateurs de la réaction d amplification. La spécificité (génération de la séquence cible uniquement) et fidélité (un nombre négligeable d erreurs dans la séquence des chaînes synthétisées) de la réaction sont aussi des caractéristiques importantes. 315
8.3.2 Vitesse d amplification séquence cible (à amplifier) (D après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 316
La réaction d amplification atteint éventuellement un plateau, le nombre de copies n augmente plus. Ceci est dû à l épuisement de réactifs (amorces et nucléotides), à l inhibition enzymatique par des phosphates libérés durant la réaction, à la détérioration thermique de l ADN polymérase et à l hybridation des brins plus long d ADN à des températures élevées au dépit de l hybridation de l ADN à simple brin avec des amorces. (D après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 317
8.3.3 Réactifs 1. ADN polymérase: La polymérase catalyse la synthèse de brins complémentaires d ADN. Des polymérases qui sont résistantes à la chaleur sont utilisées, telles que la Taq polymérase (Thermus aquaticus), la Tth polymérase, la Pwo polymérase et la Pfu polymérase. L enzyme doit être capable de synthétiser des longues séquences d ADN (i.e. bonne activité de polymérisation). De plus, les polymérases de type Pwo et Pfu exhibent une activité exonucléase 5-3 ; des mauvais nucléotides sont reconnus, enlevés et remplacés par les bons nucléotides. L activité exonucléase 5-3 augmente la fidélité de réplication de l ADN. 318
2. Amorces: Des amorces sont des courts oligonucléotides, dont les séquences de nucléotides sont complémentaires aux bouts des régions ciblés de l ADN à amplifier. Deux amorces distincts sont utilisés pour l ACP: un amorce qui synthétise de gauche à droite et un autre qui synthétise de droite à gauche. Chaque amorce se lie à un brin de l ADN original. amorces 319
O O - P O - La synthèse d ADN procède toujours dans la direction 5 à 3. Le 1 er nucléotide à être incorporé réagit avec l OH-3 libre de l amorce. Le bout 5 de l amorce est bloqué. La paire d amorces doit être choisie spécifiquement pour 5' l échantillon d ADN. CH 2 A O La longueur des amorces est H3' H généralement entre 10 et 30 H H O H nucléotides et leur séquence doit 5' être complémentaire pour une O P O CH 2 T O section unique de l ADN matrice. O - H3' H Idéalement, chaque amorce H H O H contient un nombre équivalent de 5' nucléotides. O P O CH 2 G O Pour éviter la formation de O - H3' H dimères entre les amorces, il ne H H O H doit pas y avoir de complémentarité 5' intra- ou intermoléculaire entre les O P O CH 2 C O amorces. O - H3' H La température de dénaturation H H OH H des amorces doit être similaire, ainsi qu être située entre 55 C et 80 C. 320 O
3. Désoxynucléotides triphosphates: Le mélange réactionnel doit contenir un excès des 4 désoxynucléotides triphosphates (datp, dctp, dgtp et dttp) puisqu ils sont consommés durant l ACP. O - O P O - O O P O - O O P O- O O H H OH dntp Base H H H NH 2 N N NH 2 N H 3 C O NH N O NH N O N N N O N N NH 2 Cytosine Adénine Thymine Guanine La concentration de chaque désoxynucléotide doit être égale. 321
4. Tampon: Le ph et la force ionique du tampon est choisi selon la polymérase utilisée. La force ionique a une influence importante sur la spécificité de l ACP. Une solution tampon typique possède une force ionique d environ 50 mm, un ph de 8.3 et contient du Tris-HCl et du KCl ou du NaCl. La solution tampon contient aussi du MgCl 2 à une concentration entre 0.5 et 5 mm. Les ions Mg 2+ forment un complexe soluble avec l ADN et la polymérase. Le rôle des ions Mg 2+ est d amener la polymérase à proximité de l ADN et de balancer les charges négatives sur les molécules d ADN. De plus, les ions Mg 2+ stimule l activité de la polymérase. La [Mg 2+ ] est liée à la spécificité et au rendement de la réaction d amplification. À des concentrations faibles de Mg 2+, l activité enzymatique de la polymérase est diminuée. Un excès de Mg 2+ résulte en une dénaturation incomplète de l ADN puisque la forme double brins de l ADN est stabilisée par ces ions. De plus, une [Mg 2+ ] élevée augmente la liaison des amorces aux mauvais sites, résultant en une perte de spécificité. 322
8.4. L ACP en temps réel On peut suivre le progrès de la réaction d amplification en chaîne par polymérase en utilisant un marqueur fluorescent pour quantifier les produits formés durant chaque cycle. L augmentation des produits de la réaction peut être quantifier en mesurant l augmentation de l intensité de fluorescence. Un graphique de l intensité de fluorescence en fonction du nombre de cycles d amplification donne une idée plus précise de la cinétique qu une mesure de l accumulation des produits après un nombre fixe de cycles. Deux différents types d essaies peuvent être utilisés pour l ACP en temps réel: essaie par liaison d un colorant et essaie basé sur des sondes. 323
8.4.1 Essaie par liaison d un colorant Dans un tel essaie, on utilise un colorant qui fluoresce après liaison à l ADN à double brins. Puisque de plus en plus de molécules d ADN à double brins sont produites après chaque cycle d ACP, l intensité de fluorescence augmente. Les colorants se lient soit entre les bases appariées ou au sillon mineur de la double hélice d ADN. (D après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 324
8.4.2 Essaie basé sur des sondes Cette méthode est basée sur la dégradation d une sonde cible par l activité exonucléase 5-3 de la polymérase. La sonde est un court oligonucléotide dont la séquence est complémentaire à une région de l ADN cible se trouvant entre les deux amorces. Un fluorophore est attaché au bout 5 de la sonde et l extincteur est lié au bout 3. La proximité de l extincteur réduit la fluorescence du fluorophore. La sonde est ajoutée au mélange réactionnel et se lie à l ADN dénaturé. Sa fluorescence est éteinte. Durant l élongation des amorces, le fluorophore est enlevé de la sonde due à l activité exonucléase de la polymérase. Le fluorophore libéré fluoresce dans le mélange réactionnel. L intensité de fluorescence est directement proportionnel au nombre de cycles d amplification (i.e. nombre de molécules amplifiées). (D après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 325
8.5 Transcription inverse de l ARN 5' 3' ARNm 72 C 5' 3' amorce 42 C 5' 3' 3' 5' transcriptase inverse 5' 3' 5' 5' 3' 3' 5' ARNm ADN 94 C ACP de l'adn 326
8.6 Séquençage des acides nucléiques Puisque la séquence des nucléotides dans une molécule d ADN ou d ARNm détermine sa fonction, le séquençage des acides nucléiques est une tâche bioanalytique importante. Le développement de méthodes rapides et automatisées pour le séquençage des acides nucléiques a attiré beaucoup d intérêt dans les dix dernières années, surtout dans le contexte du projet du génome humain. Méthodes de séquençage: microréseaux d ADN (pour des oligonucléotides courts) - méthode de Maxam-Gilbert - méthode de Sanger 327
8.6.1 L usage d enzymes de restriction L ADN extrait des cellules ou des tissus est souvent trop long pour être directement séquencé. L ADN doit avant être coupé en plus petits fragments de jusqu à 800 paires de bases. Les endonucléases de restriction sont employées. Ces enzymes reconnaissent une séquence spécifique de 4 à 8 bases dans une molécule d ADN à double brins et coupent les deux brins à un point spécifique prêt du site de reconnaissance. Une digestion (ou plusieurs digestions séquentielles) avec des enzymes de restriction produit une série de fragments qui peuvent être dénaturés et séparés par électrophorèse sur gel. Après séparation, les fragments d ADN à simple brin peuvent être séquencés. 328
Exemple d enzymes de restriction (D après http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/biologypages/r/restrictionenzymes.html) 329
8.6.2 Méthode de Maxam-Gilbert Le séquençage des fragments d ADN à simple brin débute avec le marquage radioactif du bout 5 avec du phosphore- 32 (voir figure de droite). Les fragments d ADN sont ensuite traités avec un réactif chimique qui coupe l ADN à un site spécifique. La réaction chimique est effectuée dans des conditions de rendement faible pour que chaque molécule d ADN est coupé seulement une fois à un site donné. Les fragments obtenus sont séparés selon leur taille par SDS-PAGE. La position des fragments sur le gel est détecté par autoradiographie. Pour un séquençage complet, un échantillon d ADN est généralement séparé en quatre parties et chaque partie est traitée avec un réactif différent. 5 3 (D après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, 330 Bioanalytical Chemistry, 2004)
1. Coupure de la guanine (G): Traitement avec le diméthyl sulfate (DMS) et la pipéridine. 8 9 7 N N O 5 6 4 N 3 1 Guanine NH 2 NH 2 (D après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 331
2. Coupure de la guanine (G) et de l adénine (A): L adénine est aussi méthylée par le DMS à la position N3. Le traitement avec la pipéridine donne aussi lieu à la coupure de la base d adénine. La vitesse de coupure de l adénine est un cinquième de celle de la guanine. 8 7 N 9 N 5 6 4 NH 2 3 N Adénine 1 N 2 Par contre, si de l acide (i.e. acide formique) est ajouté au mélange réactionnel au lieu du DMS, la guanine et l adénine sont hydrolysées à des vitesses comparables. Les positions des adénines dans une chaîne sont établies en comparant les positions des guanines et des guanines + adénines. 332
3. Coupure de la cytosine (C) et de la thymine (T): Le traitement des fragments d ADN avec de l hydrazine et de la pipéridine libère des cytosines et des thymines. NH 2 N H 3 C O NH N O N O Cytosine Thymine (D après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 333
4. Coupure de la cytosine (C): Si la réaction avec l hydrazine est effectué dans une solution de 1.5 M NaCl, l ADN est coupé seulement avant une cytosine. Une comparaison des positions des cytosines + thymines et des cytosines permet de situer les thymines. Les conditions des quatre réactions sont ajustées pour que les bases sont relâchés en moyenne à une position aléatoire par molécule d ADN. La base située à l extrémité 5 ne peut pas être identifié puisque le nucléotide est détruit durant la réaction. De plus, la 2 è base est souvent impossible à résoudre par électrophorèse sur gel. Les 1 ère et 2 è bases doivent être identifiées par séquençage du brin complémentaire. 334
Exemple de séquençage d un fragment d ADN par la méthode de Maxam-Gilbert 5 Électrophorèse sur gel 3 (D après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 335
Électrophorèse sur gel Radiographie ADN D après http://www.chromosome.com/radiograph.html 336
8.6.3 Méthode de Sanger (méthode didéoxy ou méthode de terminaison de chaîne) La méthode de Sanger est basée sur la synthèse d un brin complémentaire de l ADN en utilisant les oligonucléotides à séquencer comme matrices (tel que pour l ACP). Contrairement à l ACP, la synthèse du brin complémentaire est effectuée en présence d un nucléotide de terminaison de chaîne. L échantillon d ADN à simple brin est divisé en 4 portions. Chaque portion est incubée avec de l ADN polymérase, les quatre désoxyribonucléotides triphosphates (datp, dgtp, dctp, dttp) et une amorce appropriée. Le brin complémentaire synthétisé est marqué en incorporant du 32 P, soit dans l amorce ou dans un des désoxyribonucléotides triphosphates, ou marqué avec les fluorophores pour détection par la fluorescence. Dans chacun des 4 mélanges réactionnels, est ajouté un 2,3 -didéoxynucléotide triphosphate (ddntp) en petite quantité. O O O - O P O P O P O O O - O - O- H H 3' H Base H H H ddntp 337
Dès que un ddntp est incorporé dans la chaîne croissante, la réaction se termine puisqu il n y aura pas de 3 -OH libre pour l incorporation d un autre nucléotide. L incorporation d un ddntp résulte dans une série de chaînes tronquées, chacune terminée par un analogue didéoxy dans la position de la base correspondante. Les produits de chacune des 4 réactions sont séparés selon leur taille par électrophorèse sur gel dans des voies parallèles. La séquence du brin complémentaire d ADN est déterminée par autoradiographie. Cette séquence est ensuite utilisée pour identifier la séquence de l ADN original. 338
Exemple de séquençage d un fragment d ADN par la méthode de Sanger Électrophorèse sur gel (D après D.J. Holme, H. Peck, Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998) 339
Exemple de séquençage d ADN par la méthode de Sanger marqueurs fluorescents 340 (D après http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/bcintro/list_of_figures.htm)
Marquage avec 32 P versus marquage avec 4 fluorophores (D après http://www.steve.gb.com/science/index.html#biochemical_methods) 341
342
(D après http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/biologypages/d/dnasequencing.html) 343
(D après http://www.sars.no/facilities/sequencing.php) 344