DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE DES URETRITES

Micro 1 CSB System DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE DES URETRITES 1. Généralités sur les urétrites Intérêt de l examen des sécrétions urétrales 1.1. Principaux aspects cliniques Une urétrites se manifeste par une brûlure à la miction associée à écoulement purulent ou séreux 1. L urétrite aiguë est la plus caractéristique :l écoulement est abondant et presque toujours purulent, la douleur à la miction très marquée. Les signes cliniques d une urétrite subaiguë peuvent être, par contre, très discrets et la maladie passer inaperçue (l écoulement peu abondant est dans ce cas presque toujours sérieux). Non traitée, ou mal traité, une urétrite aiguë ou subaiguë évolue souvent vers la chronicité : l infection gagne alors les territoires voisins de l urètre et prend la forme d épididymites, de prostatites et, de façon plus exceptionnelle, de lésions articulaires. Le laboratoire de bactériologie ne sera d aucune utilité. 1.2. Les agents infectieux Niesseria gonrrhoe ( voir Annexe1 page 28) et Chlamydia tranchomatis. On leur attribue40 à 70 % des urétrites. Trichomonas est plus rares (1 % ). 90 % des urétrites sont d origine gonococcique, 90 % des urétrites subaiguë sont non gonococciques, elles sont en général dues à Chlamydia trachomatis ou à des Mycoplastes. Dans un cas sur quatre environ, aucun germe pathogène ne peut être isolé. Les cas d urétrites (10 à 20 %) sont due à des «germes banaux», parmi lesquels : Les Entérobactéries (E.coli, Klesiella, Proteus) Les Streptocoques du groupe B (et plus rarement du groupe A) Hæmophilus parainfluenzæ, quelquefois influenzæ Staphycoccus aureus Des bactéries anaérobies de la flore de Veillon ( Bactéroïdes, Streptococcus ) Gardnerella vaginalis les deux microorganismes les plus fréquemment mis en cause sont 1 Candida albicans On observe également des urétrites à plusieurs germes (7 à 8 des

2 prélèvements) : associations Gonocoques/germes banaux, Chlamydia/germes banaux, germes banaux entre eux. 2. Les critères de l infection (au laboratoire) Une flore commensale (peu abondante) peuple l urètre antérieur de l homme. On y trouve surtout des Corynébactéries, des staphylocoques non pathogènes, des Entérocoques, des Entérobactéries,quelquefois des Streptocoques du groupe B. Isoler un gonocoque, un Hæmophilus, un streptocoque A, ne laisse donc aucun doute quant à leur rôle dans l infection. Par contre, isoler une Entérobactérie ou encore un Streptocoque du groupe B ne suffit pas pour parvenir au même degré de certitude ; certaines conditions doivent être remplies, en particulier : Observer à l examen direct un nombre de leucocytes par champ suffisant (au moins c est à dire plus de 5 leucocytes, par champ). Le tableau ci-dessous rapportant les statistiques de 122 prélèvements d urétrites à germes banaux (F.W. Goldein, P.Duc Goiram et J.-F. Acar),montre bien en l absence de leucocytes, il est difficile d envisager l hypothèse d une infection urétrale : Résultat de la culture Absence de leucocytes Présence de leucocytes Gonocoques Autres germes figurés Négatives 1 ( 2 %) 8 (15.7 %) 42 (82.3 %) 93 ( 23.8 %) 114 ( 29.2 %) 183 ( 46.9 %) Total 51 390 Observer des images de phagocytose de ces bactéries dans les polynucléaires. Obtenir la bactéries incriminées en culture, très abondante, si ce n est exclusive (à l exception bien sur des cas d associations mentionnées au 1.2). Le cas des mycoplasmes est assez particulier. Les mycoplasmes du genre Ureaplasma (et plus particulièrement Ureaplasma urealiticum sont en effet retrouvés chez un nombre important de porteurs sains. On ne peut en fait les considérer comme commensaux car l introduction de ces micro-organismes à des volontaires provoque presque à coup sur une urétrite. Pour incriminer une un Mycoplasme dans une infection urétrale, il faudrait donc en faire la numération dans le prélèvement. Quand on sait que ces bactéries ne se cultivent pas aisément (elles exigent pour se développer des 2

3 milieux riches en cholestérol et l addition d antibiotiques), on comprend que cette pratique ne soit encore du ressort que de laboratoires spécialisés) (voir Micro CSB Myco). 3. Différentes étapes de l analyse 3.1. Prélèvement Les prélèvements sont effectués à l anse, à la pipette ou à l écouvillon. En cas d urétrite aiguë Après nettoyage de l orifice de l urètre, le pus est ramené en exprimant le canal. En cas d urétrite chronique Le prélèvement est effectué après réactivation éventuelle. On peut étudier les filaments présents dans le canal de l urètre. Exceptionnellement le prélèvement est précédé d un massage prostatique. En cas d urétrite subaiguë Un prélèvement à l aide d une petite curette, permettant de réaliser une véritable biopsie, est souvent indispensable. Le prélèvement peut être fait à l écouvillon en exerçant une pression suffisante pour ramener des cellules (voir un cours sur Chlamydia trachomatis). Si l ensemencement doit être différé, les prélèvements sont placés dans un milieu de transport. Celui de Young et Stuart assure la survie des gonocoques pendant 24 heures 2. Lorsque l écoulement est faible ou inexistant, l étude est faite sur l urine du premier jet (on travaille alors sur le culot de centrifugation). On peut aussi pratiquer un prélèvement en profondeur (à 4 cm environ du méat) à l aide d une curette à bout mousse. 3.2. Examen direct 3.2.1. préparation à l état frais Elle se révèle très utile pour rechercher Trichomonas vaginalis et Candida albicans. 3.2.2. coloration de Maygrunwald Giemsa Elle permet la recherché des inclusions de Chlamydia dans les cellules épithéliales. Ces inclusions s observent prés du noyau et sont décrites en forme de mitre. Leur recherche est cependant assez aléatoire et suppose un raclage à la curette du canal urétral. Sur la même lame, on pourra apprécier dans les meilleures conditions l intensité de la réaction inflammatoire. 3

4 L évaluation du nombre de leucocytes est faite au fort grossissement sur une moyenne de 20 champs : de1 à15 leucocytes par champ.on rend 1+ de 5 à 20 leucocytes par champ..on rend 2+ plus de 20 leucocytes par champ.on rend 3+ Cette préparation au MGG est aussi fort utile pour la recherche de Trichonomas bien que la morphologie du parasite soit moins caractéristique sur un prélèvement urétral que sur un frottis vaginal. 3.2.3. Coloration de Gram et au bleu de méthylène a. Intérêt de ces colorations pour la recherche du gonocoque L examen direct après coloration peut être décisif dans le cas d une urétrite gonococcique aiguë. Le gonocoque a, en effet, la propriété de se multiplier dans les phagocytes. Sur un frottis, sa répartition est essentiellement intracellulaire ; les localisations extracellulaires étant surtout le fait d éléments libérés par la lyse des polynucléaires (les germes sont observés alors au voisinage des débris cellulaires). La présence de diplocoques Gramen «grains de café», intracellulaires, associés à une forte leucocytose, suffit pour affirmer le résultat. La coloration au bleu de méthylène, peut être traumatisante pour les cellules, trouve dans cette recherche tout son intérêt. La coloration de Gram sera parfois d interprétation plus délicate car moins douce, plus mutilante que la précédente, elle peut provoquer l éclatement des polynucléaires les plus fragilisés : la proportion des germes extracellulaires sera alors plus élevée. Au fur et mesure que l affectation devient plus ancienne, l exsudat se modifie. Des cellules épithéliales, des macrophages, accompagnent les leucocytes. Une flore associée abondante se surajoute à la flore pathologique, ce qui rend l interprétation de l examen plus délicate. Les cultures sont alors indispensables. b. Cas des urétrites à germes banaux ou à Candida En dehors du cas de la blennorragie, la coloration de Gram sera utilisé pour orienter le diagnostic et choisir les milieux d isolement. On précisera l abondance, sur le frottis, de chaque type de germe observé. Les résultat, consignés sur le 4

5 compte rendu, seront confrontées à ceux des cultures. 3.3. Cultures Selon l examen microscopique, on pourra ensemencer (le problème se pose de façon presque identique à celui des prélèvements vaginaux) : a. un milieu pour gonocoque Rappelons les exigences culturales de ce germe : du gélose des facteurs de croissance (NAD, cystéine ou méthionine, bases puriques et pyrimidiques, vitamines du groupe B) absence d acide gras et de cholestérol qui inhibent (ainsi que certains acides aminés) sa croissance. Ces substances toxiques pour le gonocoque sont neutralisées par l addition de sang ou d amidon de maïs un degré hygrométrique élevé une atmosphère riche en co 2 une température comprise entre 30 et 38 C la gélose chocolat enrichie avec un mélange polyvitamique ou bien le milieu GC + hémoglobine + glucose, conviennent aux exigences nutritive du gonocoque. Sur un tel milieu la flore associée prolifère abondement. Il sera donc nécessaire de le rendre sélectif par l addition d un mélange de trois antibiotiques : Vancomycine, Colimycine, Nystatine (mélange VCN). La Vancomycine inhibe les germes gram +, la Colimycine les Gram -, la Nystaline les champignons. Ce milieu apparaît très sélectif : quelques staphylocoques ou Proteus résistants peuvent s y développer mais le nombre de colonies est rarement élevé. Par contre, 3 % des gonocoques, sensibles à la Vancomycine, ne seront pas isolés. L incubation de ce milieu sera effectuée à l étuve à Co 2 b. Un milieu pour les levures le plus utilisé est le milieu de Sabouraud au chloramphénicol et l Actidione. c. un milieu «polyvalent» permettant la culture de la plus part des germes aérobies Gélose chocolat enrichie en facteurs de croissance d. un milieu sélectif pour Gram- Le milieu de Drigalski, le milieu EMB, ou celui de Mac Conkey sont particulièrement adaptés. Comme dans le cas des prélèvements vaginaux, on a intérêt à 5

6 systématiser l emploi du milieu polyvalent et du milieu sélectif pour gonocoque. Après 24 ou 48 heures d étuve, on pratique l orientation du diagnostic sur chaque type de colonies. L identification et l antibiogramme sont conduits à partir des colonies correspondant à des germes pour lesquels on a pu réunir les critères d infection décrits au 2. 4. Le cas particulier de Chlamydia trachomatis Les bactéries du genre Chlamydia possèdent en commun avec les virus leur parasitisme intracellulaire et leur parasitisme énergétique. Les autres caractères biologiques permettant cependant de les classer parmi les bactéries : le génome est important, la paroi nettement différenciée présente plusieurs points communs avec celle des bactéries à Gram négatif. Un corps élémentaire pénétrant dans une cellule par endocytose s y multiplie en formant près du noyau une véritable colonie intracellulaire. La mise en évidence de Chamydia Trachomatis dans un prélèvement revient avec celle des inclusions juxtanucléaires. 4.1. prélèvement De la qualité du prélèvement dépend la fiabilité de l analyse. Le 6 prélèvement doit obligatoirement ramener des cellules. On utilise une petite curette ophtalmologique. L écouvillonnage classique est aussi utilisable à condition d être appuyé. Si le prélèvement n est pas effectué au laboratoire, il est placé dans un milieu de transport contenant une solution tampon (phosphate 0.02 M),du saccharose et des antibiotiques. 4.2. Les méthodes du diagnostic La présence de Chlamydia trachomatis dans un prélèvement urétral peut être décelée par trois méthodes différentes et complémentaires. 4.2.1. L examen direct Les inclusions juxtalinéaires peuvent être révélées par une coloration au MGG. On parlait jadis «d urétrites à inclusion». cependant, ces dernières ne recoupent pas, et de loin, la totalité des urétrites à Chlamydia. On préfère aujourd hui utiliser l immunofluorescence. Les frottis sont fixés à l acétone à 20 C et mis au contact d un immono-sérum anti- Chlamydia. Depuis 1985 un anticorps monoclonal (donc particulièrement spécifique) est commercialisé (Biosoft) et donne d excellents résultats. Après lavage, on recouvre d un sérum antiglobuline marqué à la fluorescéine et on recherche

7 les inclusions juxtanucléaires fluorescentes. 4.2.2. La mise en culture donnant encore une fluorescence spécifique. 4.3. Exploitation des résultats Elle est réalisée ensemençant des cellules de Mac Coy (Cf. annexe)en présence de cycloheximide. Après 72 heures d incubation, la culture est examinée en immunofluorescence indirecte. En cas de recherche positive, on observe des inclusions juxtanucléaires fluorescentes (en «chapeau phrygien»). C est une méthode de référence. 4.2.3. Le sérodiagnostic On, dans ce cas encore, l immunofluorescence indirecte. L antigène est préparé à partir de SCS vitellins d œufs embryonnés infectés par Chlamydia trachomatis. L antigène est fixé sur chacun des dix cercles d une lame pour IF. Après séchage, on fixe par l acétone à 20 C. Les lames (qui peuvent être conservées au congélateur) sont recouvertes de différentes dilutions du sérum en partant du 1/10 jusqu au 1/80 pour le dépistage, au-delà pour le tirage des sérums positifs. Après incubation en chambre humide et rinçage, on recouvre d un sérum antiglobuline fluorescent, on recherche la dilution la plus étendue 7 Les résultats de l examen directe concordent de façon satisfaisante avec ceux de la culture lorsque le prélèvement est correctement effectué. Certains travaux donnent jusqu à C est donc l examen de base. direct négatif 90 % de concordance. Une culture positive avec examen est souvent le fait d un prélèvement médiocre. A l opposé, l examen direct peut être trouvé positif avec une culture négative : ceci peut s expliquer par la présence dans le prélèvement de germes morts. Le sérodiagnostic est considéré comme positif au-delà d une dilution limite de 1/80 est significatif lorsqu on peut montrer une augmentation sensible du titre entre deux prélèvements successifs. Cependant, les infections génitales à Chlamydia étant souvent superficielles sont, de ce fait, immunogènes et le sérodiagnostic peut être faussement négatif. A l inverse, on peut observer des titres élevés chez des sujets dont l examen direct et la culture se sont révélés négatifs. On peut alors penser, soit à une infection ancienne (les anticorps se maintiennent longtemps à des titres élevés), soit à une infection plus profonde

8 (ceci est plus particulièrement valable chez la femme). 5. L isolement et l identification des Mycoplasmes urogénitaux Documents biomérieux, Micro CSB System ( Identification et Sensibilité ATB) Les Mycoplasmes sont des bactéries caractérisées par l absence de paroi. Cette particularité structurale explique : Leur non colorabilité au Gram Leur résistance aux antibiotiques Leur grande sensibilité au conditions de milieu (ph, température, pression osmotique, tensioactifs) Leur morphologie variable : au microscope électronique, on peut observer des formes filamenteuses, coccoïdes en chapelet Deux espèces sont rencontrées au cours d atteintes urogénitales : Mycoplasma hominis Mycoplasma urealyticum Les mycoplasmes sont responsables de 15 % des urétrites de l homme et peut être de 20 à 30 % des infections urogénitales de la femme. Des techniques rapides sont commercialisées pour les isoler, les identifier et les dénombrer. Trois milieux sont nécessaires : Le Bouillon et Bouillon urée arginine (qui contient aussi du glucose), pour l étude des caractères biochimiques La gélose A7 modifiée pour l observation des colonies et leur dénombrement. Ils sont particulièrement exigeants, leur culture nécessite l apport de plusieurs facteurs de croissance ainsi que diverses substances nécessaires pour visualiser les colonies et éliminer la flore associée. 8