DOSAGE DE LA BILIRUBINE NON LIEE A L ALBUMINE (BNL) CHEZ LES NOUVEAUX-NES ICTERIQUES CLUB LX / DxC Beckman Coulter Mardi 12 Juin 2007

DOSAGE DE LA BILIRUBINE NON LIEE A L ALBUMINE (BNL) CHEZ LES NOUVEAUX-NES ICTERIQUES CLUB LX / DxC Beckman Coulter Mardi 12 Juin 2007

ICTERE NEONATAL (1) Ictère à Bilirubine non conjuguée (NC) avec risque d encéphalopathie hyperbilirubinémique séquellaire : «Ictère nucléaire» Toxicité de la Bilirubine NC: poison métabolique : chaîne respiratoire, glycolyse. passage de la BHE, fixation phospholipides membranaires, noyaux gris centraux

ICTERE NEONATAL (2) Facteurs de risque d Ictère nucléaire : Facteurs cliniques : hémolyse néonatale, prématurité, acidose, souffrance neurologique périnatale Facteurs biologiques : Hyperbilirubinémie, hypoalbuminémie, compétiteurs de la liaison bilirubine-albumine

LIAISON BILIRUBINE-ALBUMINE CARACTERISTIQUES Bilirubine NC+ Alb Bilirubine NC- Alb K = constante de liaison 10 7 l.mol -1 BNL = Bilirubine non liée à l albumine K très fort : BNL dans le plasma très faible 0 3 µg/dl ou 0 50 nmol/l - 1 site principal de fixation (sites secondaires d affinité plus faibles) - Site non spécifique ouvert à de nombreux compétiteurs endogènes et exogènes : in vivo, BNL ne peut être déduite du rapport Bilirubine NC /Alb

LIAISON BILIRUBINE-ALBUMINE INTERET DE L EXPLORATION BNL + Alb + Phospholipides Acidose compétiteurs Bilirubine NC- Alb Bilirubine NC Phospholipides membranaires Prend en compte 3 facteurs biologiques de risque d ictère nucléaire : hyperbilirubinémie, hypoalbuminémie, compétiteurs Permet donc d identifier des situations à risque mal appréciées par les dosages individuels de bilirubine et de l albumine

LIAISON BILIRUBINE-ALBUMINE TECHNIQUES D EXPLORATION 1969 : Odell et al : Salicylate Index 1966 : Porter et al : capacité résiduelle de liaison à l albumine par le colorant HBABA 1967 : Kaufmann et al : Bilirubine intra érythrocytaire 1967 : Jirsova et al : gel filtration sur Sephadex. 1974 : Jacobsen et al : Méthode à la péroxydase

PRINCIPE BNL + Alb Bilirubine NC- Alb H 2 O 2 Peroxydase O H 2 0 Leuco-dérivé BNL rapidement dégradée en un leuco-dérivé par l action d une peroxydase en présence d eau oxygénée, source de radicaux peroxydes. L étude de la cinétique de la réaction de peroxydation permet, connaissant la constante d activité de la peroxydase, de calculer la concentration en BNL.

CINETIQUE DE LA REACTION Peroxydase Mesure de la vitesse de Réaction Tampon Phosphate + H2O2 Echantillon

INSTRUMENTATION UB ANALYSER, Arrows, Co, Ltd, Osaka, Japon Instrument dédié (approuvé par la FDA) Utilisé au CNRHP (décembre 1987) Adaptation sur des automates ouverts de Biochimie : CX4-CE Beckman Coulter (Novembre 2006) DxC Beckman Coulter (Avril 2007)

REACTIFS ET PARAMETRES UB analyser CX4-CE DxC Echantillon plasma 25 µl 7 µl 7 µl Tampon Phosphate ph 7,4 + H2O2 1 ml 200 µl 200 µl Peroxydase 25 µl 6 µl 6 µl Type de réaction CINET1 décroissant CINET1 décroissant Longueur d onde primaire Longueur d onde secondaire 460 nm 470 nm 650 nm 470 nm 650 nm Température réaction 37 C 37 C 37 C Durée incubation tampon+échantillon variable 48 s 48 s Lecture du blanc Boîte noire 50 s 40s Début lecture après ajout peroxydase Boîte noire 3 s 10 s Durée lecture 30s,16points 30s

REACTIFS ET PARAMETRES Calibrage : 2 points Point 0 : eau distillée Point 1 : Etalon BNL préparé au CNRHP pour une valeur cible de BNL de 0.70 µg/dl Contrôles de qualité : Précibil (niveau moyen) Biorad (niveau élevé) Stabilité des réactifs : 1 journée à 4 C sur l appareil

PERFORMANCES ANALYTIQUES DxC IMPRECISION Répétabilité N Moyenne µg/dl Ecart-Type CV % NIVEAU 1 20 0.77 0.02 2.78 % NIVEAU 2 20 1.01 0.02 1.9 % Reproductibilité N Moyenne µg/dl Ecart-Type CV % NIVEAU 1 20 0.76 0.02 3.19 % NIVEAU 2 20 1.00 0.03 2.15 %

CORRELATION BNL UB ANALYSER/ CX4 µg/dl 1.50 1.25 1.00 N = 101 paires r² 0.9179 CX4 0.75 0.50 0.25 Slope Y-intercept when X=0.0 0.00 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 UB ANALYSER 0.9784 ± 0.02942 0.001441 ± 0.01698 µg/dl

CORRELATION BNL CX4/ DxC µg/dl 2.5 2.0 N = 87 r² 0.9698 BNL DxC 1.5 1.0 0.5 Slope Y-intercept when X=0.0 1.071 ± 0.02049 0.01551 ± 0.01021 0.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 BNL CX4 µg/dl

RELATION BNL ET BILI NC/Alb µg/dl 3.5 Pool de sérum humain normal enrichi en BILI NC rapports BILI NC /Alb croissants 3.0 BNL DXC 2.5 2.0 1.5 1.0 La réponse obtenue est conforme à la présence de 2 sites de fixation d affinité différente 0.5 0.0 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 BILIRUBINE/ALBUMINE

RELATION BNL BILIRUBINE TOTALE 673 Echantillons cliniques de nouveaux-nés ictériques 450 Risque d ictère nucléaire BILIRUBINE TOTALE µmol/l 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 BNL µg/dl Prématuré ou < 1500g Nouveau né à terme

CONCLUSION Travail Réalisé par Drs Agnès Mailloux, Yves Brossard, Marc Larsen CNRHP, Hôpital Saint-Antoine 184 Rue du faubourg St-Antoine 75012 PARIS Remerciements Bertrand Crayon : Beckman-Coulter Dr Michel Vaubourdolle : Service de Biochimie A, Hôpital St Antoine