Régulation de la transcription - Fixation de facteurs spécifiques sur l ADN - Méthylation de l ADN - Structure de la chromatine - Localisation nucléaire
Activation de la transcription Démethylation de l ADN Ouverture de la chromatine (acétylation/méthylation des histones) Localisation nucléaire Fixation de facteurs spécifiques sur l ADN Ouverture chromatine Au niveau du promoteur Recrutement et/ou activation du PIC
Modèles d interaction enhancers-promoteurs Looping E P Tracking E P Linking E Temps
Interaction enhancer-promoteur : indépendante de la distance et de l orientation du promoteur Enh Enh Enh Pb : Séparation des unités transcriptionnelles indépendantes? MAR/SAR : zone d attachement à la matrice nucléaire Organisation structurale des chromosomes
Propriétés des isolateurs
Identification des isolateurs Expériences de transgenèse Enh Gène rapporteur
Expériences de transgenèse Identification des isolateurs Chromatine condensée Enh Gène rapporteur Chromatine «ouverte»
Chromosomes polytènes Larves de drosophile Soumises à la chaleur Découverte des isolateurs : specialized chromatin structures puff Udvardy et al, 1985, J. Mol. Biol. Locus 87A ZW5 BEAF Immunodétection de ZW5 sur chromosomes polytènes de larves de drosophile ADN : rouge ZW5 : vert Interaction ZW5 avec SCS Nbreux sites de fixation ZW5 Blanton J et al. Genes Dev. 2003;17:664-675
Découverte des isolateurs : specialized chromatin structures Expériences de transgenèse Ex scs chez la drosophile E white SCS
Examples d isolateurs chez la drosophile Rétrotransposon gypsy
Colocalisation de Su(Hw) et Mod(mdg4) sur de nombreux sites
Examples d isolateurs chez la drosophile Au locus Abd-B Lin Q et al. PNAS 2007;104:3237-3242
Isolateurs chez la drosophile - 5 isolateurs différents caractérisés par leurs facteurs trans: - Su(Hw) (gypsy) - BEAF (boundary associated factor) (scs ) - Zw5 (Zeste white 5) (scs) - GAF (GAGA factor) (Abd-B, Fab7) - dctcf (Abd-B, Fab8) DNA binding proteins - CP190 (centrosomal protein 190) Protéine du centrosome interagissant avec les microtubules CP190 composant de l isolateur gypsy (Corces, Mol cell, 2004) CP190 interagit avec dctcf (2007) CP190 Facteurs trans isolateur Séquence Cis
ChIP-seq
Genome-wide localization of insulator proteins in drosophila genome. Bushey A M et al. Genes Dev. 2009;23:1338-1350 Colocalisation CP190 avec BEAF(1678/2531) 66% Su(Hw) (1365/3403) 40% dctcf (1394/2251) 62% Deux familles d isolateurs BEAF et dctcf : proximité TTS associés à des gènes transcrits Su(Hw) : régions intergéniques associés à des gènes transcrits et non transcrits
The role of CP190 insulators in chromatin organization. Bushey A M et al. Genes Dev. 2009;23:1338-1350 Modèle de régulation Su(Hw) and dctcf may primary level of chromatin organization. BEAF and dctcf could then fine-tune this organization around highly expressed genes (yellow arrows). The interactions between insulator proteinbinding sites may be facilitated by CP190.
Isolateurs chez les vertébrés Felsenfeld, 1993, Cell : identification 1 ier isolateur vertébré : 5 chs4 et hhs5 du locus β-globine
Isolateurs chez les vertébrés Felsenfeld, 1993, Cell : identification 1 ier isolateur vertébré : 5 chs4 et hhs5 du locus β-globine Isolateurs de vertébrés fonctionnent chez la drosophile
Isolateurs chez les vertébrés Identification des facteurs trans de l isolateur chs4 de β-globine Felsenfeld, 1999, Cell : La protéine CTCF est nécessaire pour l activité de blocage des enhancers Felsenfeld, 2004, Mol Cell : USF1 nécessaire pour activité de barrière chromatinienne Felsenfeld, 2010, PloS Genetics : VEZF1 protège contre la méthylation de l ADN 5 HS4 insulator 3 HS insulator Condensed chromatin r β H β A ε FR OR Core 250 bp I II III IV V VEZF1 CTCF VEZF1 USF VEZF1 β/ε enhancer VEZF1 : vascular zinc finger 1 Vascular development USF : upstream stimulatory factor Lipid and glucose homeostasis CTCF : CCCTC-binding factor
CTCF bloque interactions enhancer-promoteur I II III IV V enhancer CTCF promoteur I II III IV V + enhancer promoteur Domaine II : enhancer blocking
Rôles des différentes protéines interagissant avec chs4 dans sa fonction de barrière chromatinienne Domaine I, III, IV, V : barrière chromatienne Felsenfeld, 2010, PloS Genetics
USF1 recrute des histones acétyl et methyl transférase SRC-1 PRMT1 Felsenfeld, 2004, Mol Cell Felsenfeld, 2007 Mol Cell Biol
CTCF : principale protéine impliquée dans la fonction des isolateurs CTCF Protéines interagissant avec CTCF et ayant un rôle dans sa fonction d isolateur -nucleophosmin : protéine de l architecture nucléaire -cohesines : interaction des chromatides soeurs -Kaiso : facteur de transcription -ARN polymerase II -Suz12 (appartient groupe polycomb)
Mécanismes d action des isolateurs 1 Modèles structuraux : Effet sur la transcription = conséquence de l organisation des chromosomes 2 Modèles transcriptionnels blocage des interactions enhancers-promoteurs
Technique : chromosome conformation capture (3C) Identification des régions d ADN qui interagissent dans le noyau
Mécanismes d action : Localisation nucléaire Drosophile Interaction de dtopors avec la lamina nucléaire et les protéines isolatrices dtopors : ubiquitin ligase mais pas d ubiquitination des protéines Vertébrés Interaction de CTCF avec la nucleophosmine Drosophila Topoisomerase I-interacting RS protein (dtopors) Corces, Mol Cell. 2005 Oct 7;20(1):105-16 Felsenfeld, Mol Cell. 2004, 13: 291
Interchromosomal interaction via CTCF Localisation dans les transcription factories Science. 2006 Apr 14;312(5771):269-72 Trends Genet. 2006 Dec;22(12):637-9. Science. 2006 Apr 14;312(5771):207-8
FISH 3D Localisation nucléaire et transcription factories
Mécanismes d action des isolateurs : modèle transcriptionnel RT-PCR ChIP 3C HS2 ε Tracking model Blocage par CTCF Nucleic Acids Res. 2004 Sep 15;32(16):4903-19.
Mécanismes d action des isolateurs : modèle transcriptionnel 3C looping model Blocage par CTCF Hou C et al. PNAS 2008;105:20398-20403
Régulation de la fonction des isolateurs 1 Inhibition de fixation des facteurs trans 2 Modification post-traductionnelle des facteur trans 3 Complexe interagissant avec les facteur trans Facteurs trans Séquence Cis
Inhibition de fixation des facteurs trans Inhibition de fixation de CTCF par méthylation de l ADN Ex de l ICR (Imprinted Control Region) Genomic Imprinting = epigenetic mark leading to allele-specific expression of some mammalian genes (~80) which depends on the allele s parental origin Action of the Imprinting Control Region (ICR) at the mouse Igf2/H19 locus :. The transcriptional insulation by the ICR is maternally inherited Nat Genet. 2003 Jan;33(1):66-9 Ohlssen, Genes Dev. 2003 Mar 1;17(5):586-90 Ohlssen, Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Jul 11;103(28):10684-9
Inhibition de fixation des facteurs trans Inhibition de fixation de CTCF due à la transcription d ARN non codant Ex du locus du lysozyme de poulet - LPS - + LPS + CTCF Bonifer, Mol cell, 2008; 32, 129
Bonifer, Mol cell, 2008; 32, 129 Modèle d inhibition de l isolateur au locus du lysozyme
Modifications post-traductionnelles de CTCF Poly(ADP-ribosyl)ation de CTCF : indispensable pour activité d isolateur d ICR Ohlssen, Nature Genetics 36, 1036-1037 (2004)
Modifications post-traductionnelles de CTCF SUMOylation de Su(Hw) et CP190 : activité isolateur effet sur localisation nuclaire pas d effet sur liaison ADN EMBO J. 2006 May 3;25(9):1906-14. SUMOylation de CTCF : Effet sur activité isolateur? Mol Cell Biol. 2009 Feb;29(3):714-25.
Composition du complexe trans associé à l isolateur Rôle de la cohésine Cohesine : nécessaire à la fct insulateur de CTCF Cohesine effet sur expression génique
Modèle d action de la cohésine 3 HS1 Modèle de régulation au locus de la β-globine
Composition du complexe trans associé à l isolateur Rôle de la cohésine Modèle de régulation au locus IGF2/H19 PLoS Genet. 2009 Nov;5(11):e1000739.
Composition du complexe trans associé à l isolateur Rôle des ARNs Insulateur Droso : Su(Hw) Rm62 : RNA helicase implicated in dsrna silencing, heterochromatin formation and transposon silencing Corces, Nature Genetics 38, 936-941 (2006) Insulateur vertébré : CTCF? Voir Felsenfeld, Genes Dev. 2010 Oct 21.