Brucella B. abortus as viewed by electron microscopy Cells are approximately 0.5-0.7 µm in diameter and 0.6-1.5 µm in length
Projet BBSRC-ZELS: contrôle multisectoriel de la brucellose dans les principales zones de production laitière péri-urbaines d Afrique de l Ouest et du Centre Formation : diagnostic sérologique de la brucellose John McGiven (john.mcgiven@apha.gsi.gov.uk)
Plan de la présentation Qui suis-je? Objectifs de l atelier? Brucella Diagnostic sérologique de la brucellose (vue d ensemble) Standardisation des sérodiagnostics La sérologie dans le cadre du projet ZELS Méthodes : ELISA indirect (lait) ELISA par compétition (sérum) Test au Rose Bengale Protocole de test Contrôle de compétences Sérologie ZELS : développement d analyses DIVA et dispositifs portatifs
John McGiven Animal & Plant Health Agency = Agence pour la santé animale et végétale (Weybridge) Laboratoire National et International (OIE) de Référence pour la Brucellose Collaboration avec la FAO et l OMS pour le diagnostic de la brucellose Diagnostic sérologique de routine (commerce/surveillance/insémination artificielle) Culture bactériologique Recherche appliquée et développement Épidemiologie et diagnostic moléculaires (ADN) Développement de méthodes de diagnostic immunologiques
Objectifs de l atelier Enseigner les méthodes de sérologie conventionnelle, dans le but de les appliquer au sein du projet ZELS. Développer les compétences nécessaires pour que vous puissiez les appliquer dans vos laboratoires respectifs Créer un accès direct aux fournisseurs de tests diagnostiques dès aujourd hui Développer un réseau de collaborateurs Assurer la réussite de l enquête de séroprévalence
La brucellose Causée par Brucella, bactérie intracellulaire Cocco-bacille Gram négatif Le genre contient 6 espèces principales (B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. canis, B. ovis & B. neotomae), B. abortus, B. melitensis & B. suis sont lisses (recouvertes de polysaccharide O = OPS) et sont les plus pathogènes pour le bétail et l Homme B. ovis & B. canis sont rugueuses (ont naturellement perdu leur OPS)
Spectre d hôtes Les représentants du genre Brucella peuvent être isolés chez un grand nombre d hôtes (bétail, chien, cheval, sanglier, rongeurs, lièvre, camélidés, bison, renne, élan, alpaga, chamois, phoque, dauphin, marsouin, babouin, crapaud, renard.) Cependant, chaque espèce présente un tropisme accru pour un certain nombre d hôtes, dits primaires. Le pouvoir pathogène chez les hôtes secondaires est faible ou nul. L infection des hôtes secondaires peut par contre être importante sur le plan épidémiologique. Les différentes espèces de Brucella sont très proches et les bases de la préférence d hôtes sont encore mal comprises. Hôtes primaires pour chaque espèce: B. abortus : grands ruminants B. melitensis : petits ruminants B. suis biovars 1, 2, or 3 : porcs B. ovis : moutons B. canis : chiens B. ceti : dauphins ou marsouins (selon clade) B. pinnipedialis : phoques
Sérologie en quoi est-ce important? Maladie silencieuse (animaux): signes cliniques absents ou frustes Culture de Brucella sp. : difficile à réaliser, coûteux et dangereux PCR sur sang ou tissus : peu fiable actuellement Echantillons de sérum facilement accessibles et coût relativement faible de la sérologie. Il existe de nombreux tests sérologiques, permettant de s ajuster aux besoins et aux conditions de laboratoire Possibilités d effectuer de nombreux tests à la chaine Les analyses sérologiques présentent une bonne sensibilité car l OPS de Brucella déclenche une réponse immunitaire humorale importante. Dans toutes les techniques de diagnostic sérologique de routine (approuvées par l OIE), l antigène utilisé est contient une grande proportion d OPS. Selon la technique, l antigène utilisé est: cellule entière (RBT/SAT/CFT) slps (i/c ELISA) OPS (FPA) La sérologie constitue le socle des programmes d éradication et de surveillance destiné à obtenir ou conserver le statut officiellement indemne de brucellose de l OIE.
Sérologie classique = techniques utilisant la cellule entière comme antigène Agglutination sérique = test de Wright (1897) Test de fixation du complément (1963) Test au Rose Bengale (RBT) (1967), épreuve à l antigène tamponné sur plaque (BPAT) (1984) Le contrôle et l éradication de la brucellose grâce à ces techniques SONT possibles (par exemple, Grande- Bretagne 1985)
Sérologie contemporaine Objective & quantitative slps ielisa (1976) slps celisa (1989) OPS FPA (1996) Tous ces tests sont efficaces car l antigène OPS est immuno-dominant. Attention, ils doivent être standardisés afin de garantir un pouvoir diagnostic optimal.
OIE: Le manuel terrestre et les laboratoires de référence Procédures reconnues au niveau international dans le secteur du diagnostic et de la vaccination Méthodes standardisées et détaillées Analyses requises pour le commerce international Surveillance épidémiologique pour prouver l absence de maladie Révisé et mis à jour par des experts internationaux de chaque pathologie Les laboratoires de référence de l OIE ont une mission de formation et de diffusion des bonnes pratiques de laboratoire. L APHA est l institution qui compte le plus de laboratoires de référence OIE
Standardisation des tests sérologiques Manuel OIE, Chapitre 2.4.3. Brucellose Bovine (2. Sérologie) http://www.oie.int/fileadmin/home/eng/health_standards/tahm/2.04.03_bovi NE_BRUCELL.pdf Description des protocoles standards pour la production d antigène et les procédures de diagnostic (RBT, BPAT, CFT, ielisa, celisa, FPA ) Décrit également l utilisation des Séra de référence OIE pour s assurer que chaque analyse répond aux standards en terme d efficacité diagnostique. Afin de pouvoir interpréter les résultats d analyse en fonction des valeurs de référence et des données historiques, il est impératif de respecter les normes OIE: L antigène utilisé pour le RBT est standardisé afin que le Sérum Standard International de l OIE soit positif à une dilution au 1/45 et négatif à une dilution au 1/55, lorsque le protocole standard est respecté. Les kits ELISA sont standardisés de manière à fournir des résultats positifs et négatifs respectivement avec les échantillons de référence OIE positifs et négatifs, sous réserve que le protocole standard soit appliqué et que les conditions de contrôle interne soient respectées. Seules des analyses de bonne qualité fournissent des bons résultats!
OPS: l antigène humoral immuno-dominant Non-reducing end c2 c1 c1 c2 c1 c2 c1 c2 c6 c4 L OPS (poly-saccharide O) des souches lisses de Brucella (B. abortus, B. melitensis & B. suis) est un homo-polymère non-ramifié de 4-6-dideoxy-4-formamido-mannopyranosyl (D-Rha4Fo), longueur moyenne ~ 44 unités Reducing end Image adapted from Haag et al 2010
ABTS (Absorbance max à 405 nm) Brucella slps ELISA indirect (ELISA-i) Les plaques d ELISA sont pré-sensibilisées (antigène fixé) Ajouter le lait/sérum et laisser incuber Plaque ELISA en polystyrène Anticorps de lapin anti-igg 1 de bovin, marqué avec enzyme HRP Rincer Ajouter l anticorps anti-igg1 conjugué à l enzyme HRP (peroxidase) Rincer Ajouter le substrat de l HRP et laisser incuber Arrêter la réaction et lire l absorbance
ELISA-i lait Brucella (pour la détection des anticorps anti-brucella slps) Ajouter 50 µl de solution tampon dans chaque puit de la plaque (sensibilisée avec le slps) Ajouter 50 µl des échantillons à tester (lait) dans chacun des puits de la plaque ELISA (colonnes 1-10) Ajouter 50 µl des échantillons contrôles (lait) dans les puits des colonnes 11 et 12 laisser le puit H12 vide (pas de lait) Laisser incuber 30 minutes à température ambiante sur un agitateur rotatif puis rincer la plaque 5 fois. Ajouter 100 µl de conjugué anti-bovin/hrp (dilué au préalable à la concentration adéquate) dans chaque puit. Laisser incuber 30 minutes à température ambiante sur un agitateur rotatif puis rincer la plaque 5 fois. Ajouter 100 µl de substrat ABTS-H 2 O 2 (dilué au préalable à la concentration adéquate) et laisser incuber à température ambiante sur la paillasse pendant ~ 15 minutes Ajouter de l azoture de sodium pour stopper la réaction et lire l absorbance de chaque puit (densité optique, DO) à 405 nm
ELISA-i lait Brucella (pour la détection des anticorps anti-brucella slps) Ajout des échantillons de lait: 1. Echantillons à tester: colonnes 1-10, 1 échantillon par puit (T) 2. Contrôle positif: A11 H11 (+) 3. Contrôle intermédiaire: A12 - D12 (M) 4. Contrôle négatif : E12 G12 (-) 5. Vide: H12 (B)
ELISA-i lait Brucella: analyse des résultats Effectuer les vérifications numériques (Quality Control Calculations) indiquées ci-dessous sur les valeurs des contrôles afin de vérifier que la qualité des données est suffisante pour pouvoir utiliser les résultats. DO (densité optique) du puit vide < 0,1 Soustraire la valeur du puit vide de toutes les autres valeurs de DO avant de poursuivre les calculs. Moyenne des DO des contrôles négatifs < 0,1 Moyenne des DO des contrôles positifs > 0,7 Le Coefficient de liaison (Binding Ratio) est > 10 (Moyenne des contrôles positifs / Moyenne des contrôles négatifs) La moyenne des contrôles intermédiaires vaut 10% à 30% de la moyenne des contrôles positifs Si tous ces critères sont satisfaits, les résultats des tests peuvent être utilisés. Calcul de la valeur finale pour chaque échantillon testé: (DO échantillon / moyenne des DO des contrôles positifs) x 100 (exprimé en %) Les résultats supérieurs ou égaux à 10.0% sont considérés positifs.
ELISA-i lait Brucella : la crème du lait Dans certains cas, la crème présente dans l échantillon de lait peut causer une réaction faussement positive à cause de sa viscosité. Eviter d ajouter la partie crémeuse de l échantillon de lait dans les puits d ELISA. Afin d éviter de prélever la crème, l embout de la pipette doit traverser la couche de crème afin d aspirer uniquement le lait situé en dessous. De plus, l embout de la pipette doit être essuyé avant de déposer le lait sur la plaque ELISA. Dans certains cas, le récipient contenant l échantillon de lait peut être retourné avant de l ouvrir. Ainsi on peut aspirer la petite quantité de lait qui a été retenue dans le couvercle. Si un doute existe sur le fait que la viscosité de l échantillon ait pu influer sur un résultat positif, l échantillon doit être re-testé en prenant les précautions mentionnées ci-dessus.
ELISA-c sérum Incubation simultanée de sérum et d anticorps IgM anti- Brucella slps (marquee par l enzyme HRP) Absence d anticorps sériques anti-slps liaison des IgM et réaction enzymatique colorée Présence d anticorps sériques compétition entre ces anticorps et les IgM pour la liaison au slps IgG de souris anti-slps de Brucella, marqué par enzyme HRP Anticorps sérique antislps de Brucella Brucella slps Negative Positive
ELISA-c (pour la détection des anticorps anti-brucella slps) Ajouter 20 µl de sérum à tester dans les puits de la plaque ELISA préimprégnée avec le slps (colonnes 1 10) Ajouter 20 µl de sérum contrôle positif dans les puits F11 H12 Ajouter 20 µl de sérum contrôle négatif dans les puits A11 C12 Ajouter 100 µl d IgM marquées par l HRP (dans du diluant tamponné) dans tous les puits. Agiter énergiquement pendant 2 minutes pour mélanger le sérum et le conjugué. Laisser incuber pendant 30 minutes à température ambiante sur un agitateur rotatif puis rincer la plaque 5 fois. Ajouter 100 µl de substrat ABTS H 2 O 2 (dilué au préalable) dans tous les puits ELISA et laisser incuber à température ambiante sur la paillasse pendant ~ 15 minutes Ajouter 100 µl d acide citrique pour stopper la réaction dans tous les puits puis lire les valeurs d absorbance (densité optique, DO) à 450 nm.
Ajout des échantillons de sérum ELISA-c (pour la détection des anticorps anti-brucella slps) 1. Echantillons à tester: colonnes 1-10, un échantillon par puit (T) 2. Contrôle positif: F11 H1211 (+) 3. Contrôle négatif: A11 - C12 (-) 4. Contrôle conjugué seul (IgM marquée): D11 E12 (C)
ELISA-c Brucella: analyse des résultats Effectuer les vérifications numériques (Quality Control Calculations) indiquées ci-dessous sur les valeurs des contrôles afin de vérifier que la qualité des données est suffisante pour utiliser les résultats. Moyenne des DO des 6 puits contrôles négatifs > 0.700 Moyenne des DO des 6 puits contrôles positifs < 0.100 Moyenne des DO des 4 puits conjugué seul > 0.700 Coefficient de liaison > 10 (moyenne des contrôles négatifs / moyenne des contrôles positifs) Si tous ces critères sont satisfaits, les résultats des tests peuvent être utilisés. Calcul de la valeur finale pour chaque échantillon testé: (DO échantillon / moyenne des DO des contrôles conjugué seul) x 100 (exprimé en %) Les résultats inférieurs ou égaux à 60.0% sont considérés positifs.
Traçabilité des données d ELISA Même si les analyses sont de bonne qualité, elles perdent leur valeur en l absence d un système de traçabilité des données. L identification des résultats doit impérativement correspondre à celle des échantillons. Toutes les données doivent être conservées : données brutes (DO brutes, tests et contrôles) et données calculées (pourcentages) La conservation des données brutes est essentielle pour pouvoir résoudre le problème d éventuelles valeurs extrêmes, dont on ne se rendrait compte que plus tard dans l étude. Les données brutes sont également nécessaires lorsqu on souhaite ajuster les seuils de positivité / négativité pour s adapter aux conditions locales. Conservez tout!
L antigène du TRB doit être agité avant utilisation afin d homogénéiser les cellules en suspension. L antigène du TRB doit être remis à température ambiante avant utilisation (prélever et réchauffer seulement le volume nécessaire à l analyse il faut éviter de refroidir et réchauffer de manière répétée la solution mère). Ajouter 30 µl de sérum sur une lame (ou céramique) & 30 µl d antigène. Un contrôle positif et un contrôle négatif doivent être réalisés à chaque fois qu une analyse est effectuée. Mélanger avec un instrument propre (ex: embout de pipette) Placer sur l agitateur à balancement pendant 4 minutes Lire l agglutination : le Negative résultat est soit positif soit négatif. Test au Rose Bengale (TRB) Positive
Travaux pratiques Atelier pratique : 2 demi-journées par groupe ELISA-i lait, ELISA-c sérum & TRB Chaque participant aura l occasion de pratiquer, n hésitez pas à poser des questions L objectif est d appliquer ces techniques dans vos laboratoires respectifs L APHA (John McGiven) vous enverra les kits d analyse. Il vous sera également envoyé un panel de sérums pré-testés. Ce panel est destiné à effectuer une vérification en aveugle de votre capacité à réaliser chaque test correctement. Nous vous demandons de tester ce panel d échantillons et de nous renvoyer les résultats. Nous vous enverrons ensuite une compilation des résultats de tous les participants. Les résultats seront codés de manière à ce que chaque personne puisse identifier uniquement ses propres résultats (seuls les coordinateurs du projet auront accès à l ensemble des identifiants).
Prochaine étape: test DIVA Les vaccins anti-brucella les plus protecteurs contiennent l antigène OPS (B. abortus S19 & B. melitensis Rev1) L OPS est un ingrédient clé pour la formulation d un vaccin optimal. Le principal inconvénient de ce type de vaccin est la production d anticorps anti-ops qui peuvent interférer avec la sérologie. Pour cette raison, il est difficile d utiliser de manière simultanée les deux types de prophylaxie, vaccination et dépistage/abattage dans les programmes de contrôle et d éradication de la maladie. Il est également difficile d estimer l efficacité des campagnes de vaccination car la sérologie n est pas utilisable. L OIE n attribue pas de statut officiellement indemne de brucellose lorsque la vaccination a été pratiquée depuis moins de 3 ans. Cependant, l arrêt de la vaccination au profit d un programme de dépistage/abattage présente un risque de réémergence de la maladie. Un test permettant de différencier les animaux infectés et vaccinés (DIVA) contribuerait à résoudre ce problème.
Généralités sur les analyses DIVA conventionnelles Elles consistent à utiliser des vaccins dépourvus d OPS et à utiliser l OPS (ou antigène apparenté) lors du dépistage. Cependant les vaccins non basés sur l OPS (souches rugueuses ou vaccins sub-unitaires) sont moins protecteurs (ex: B. abortus RB51) L objectif est de trouver une alternative à l OPS pour les tests de dépistage et éliminer l antigène cible du vaccin candidat, pour produire une combinaison vaccin / analyse DIVA. Problème : aucune alternative à l OPS et LPS n a été trouvée dans les tests de dépistage. Les tentatives pour trouver un antigène protéique magique permettant de différencier les animaux naturellement infectés par des souches lisses de Brucella des animaux vaccinés ont été reléguées dans les archives, principalement car la sensibilité et la spécificité des analyses basées sur les antigènes protéiques ne peuvent pas rivaliser avec celles basées sur le LPS (Chaves-Olarte et al., 2012) Les antigènes protéiques ne semblent pas être la solution.
Concept DIVA au sein du projet ZELS : utiliser des antigènes slps profonds La logique de cette approche est basée sur le fait que les animaux infectés naturellement produisent une réponse immunitaire antislps plus diversifiée que les animaux vaccinés, du fait de l intensité de l infection. Nous allons donc évaluer l utilisation de 2 antigènes slps profonds ( cachés ) comme antigènes de dépistage DIVA. Le premier est le LPS des souches rugueuses (absence d OPS) Le second est un OPS inversé présenté dans l orientation opposée à son orientation naturelle.
Antigènes DIVA potentiels Image adapted from Haag et al 2010 Antigène OPS purifié présenté à l envers rlps (lipide A et sucres centraux) = LPS des souches rugueuses
Test Développent d un dispositif d immunochromatographie (Lateral Flow Device) pour la détection des anticorps sériques anti-brucella Simple Portatif Fiable Sensible Spécifique Durable Standardisé Innovant (potentiellement)
Un dispositif de test utilisable sur le terrain directement Exemples de tests indirects: Virus FMD (Ferris et al 2009) Sample Virus de la maladie vésiculaire porcine (Ferris et al 2009) Antibovine anti-slps Serum antibody Brucella slps Anticorps anti- Anaplasma marginale (Nielsen et al 2009) Anticorps anti-brucella (Abdoel et al 2007)
Remerciements Defra (Gouvernement GB) APHA Brucella workgroup Dr Adrian Whatmore Laurence Howells Lucy Duncombe Andrew Taylor Lorraine Perrett The Royal Veterinary College Professor Javier Guitian Laura Craighead EISMV Professor Kone Professor Ayih-Akakpo