Biologie Cellulaire Chapitre 2 : Méthodes d études en biologie cellulaire Docteur Laurent PELLETIER MED@TICE PCEM1 - Année 2006/2007 Faculté de Médecine de Grenoble - Tous droits réservés.
Méthodes d études Cellule animale : 10-20 µm Microscopie photonique 0,2 μm à 1 mm 1838 : Doctrine cellulaire de Schleiden et Schwann Microscopie électronique 1940 : 1-22 nm Fixation, colorations
Méthodes d étude Histologie Fixation Inclusion / Congélation (ultra-)microtome Coloration
DNA : Méthodes d étude 1944 O.T. Avery 1953 J.D. Watson & F.H.C. Crick Genetic code : 1961-1966 1966 M. Nirenberg & H.G. Khorana DNA cloning : 1972 P. Berg Hybridization : 1975 E.M. Southern Fast Sequencing : 1977 W. Gilbert & F. Sanger PCR : 1983 K. Mullis Historique Transgenesis : 1993 S. Spielberg Human genome sequenced : 2001
Méthodes d étude Génomes séquencés Organisme taille approx. (nbre gènes) H.influenzae 1 743 C.jejuni 1 643 Y.pestis 2 000 E.coli 4 285 S.cerevisiae 6 200 C.elegans 20 000 H.sapiens 30 000 autres (souris, plasmodium, etc...)
Méthodes d étude Adipocyte Même génomeg Neurone Expression différente
Méthodes d étude Genome 30 000 gènesg Transcriptome Proteome 100 000 protéines Statique, connu Dynamique, dépendant du context, inconnu Dynamique, dépendant du context, inconnu
Etude des gènes Méthodes d étude Southern blot : ADN northern blot : ARN PCR : Polymerase Chain Reaction Puce d ADN Enzymes de restriction Clonage Séquençage
Méthodes d étude Les techniques de ciblage moléculaire Immuno-histochimie Immuno-fluorescence Hybridation In Situ
Méthodes d étude Les techniques de ciblage moléculaire Immuno-histochimie CD31
Méthodes d étude Les techniques de ciblage moléculaire Immuno-histochimie Colon - tissu normal Fort immuno-marquage nucléaire PCNA des cellules épithéliales (glandes). Marquage modéré dans les cellules musculaires.
Méthodes d étude Les techniques de ciblage moléculaire Immuno-fluorescence ICAM-2 2 (FITC) Actine α-sm (Cy5) Immunohistochemistry markers to distinguish between vascular smooth muscle and endothelial cells. A cryosection of mouse heart ventricle was simultaneously stained with FITC-conjugated smooth muscle α-actin antibody (A) and an antibody against the apical endothelial membrane protein, ICAM-2 (B). The secondary antibodies to detect ICAM-2 was Cy-5 conjugated donkey anti-rat (pseudo-colored red for clarity). Panel C is an overlay of the preceding two panels.
Méthodes d étude Les techniques de ciblage moléculaire Hybridation in situ (HIS) Section de cerveau de souris : Les points noirs indiquent l expression d un gène dans des régions spécifiques A cross-section through the
Méthodes d étude Immuno-histochimie, Immunofluorescence, FACS, Hybridation In Situ, Southern-blot, western blot, northern-blot même combat! Enzyme, fluorochrome Secondaire Sonde Cible
Southern blot Coloration BEt
Southern blot Transfert par capillarité puis par courant électrique.
Southern blot
Les puces d ADN Objectif : Comparer les cdna (gènes exprimés) de cellules normales et cancéreuses
Les puces d ADN Cellules normales Cellules cancéreuses GCAT GACT GACT TCAG CGTA CTGA ATGC AGTC Membrane + sondes
Les puces d ADN vert = normal rouge = cancer Rouge&vert = normal & cancer noir = pas d expression
Les puces d ADN
Les puces d ADN Principe généralg Analyse informatisée e du signal d'hybridation (Station de travail ) 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Obtention d'un profil d'expression de gènesg gène A gène B gène C gène D gène E gène F corrélation avec les données cliniques
FACS Cytométrie trie en flux (FACS FACS : Fluorescence Activated Cell Sorter)
FACS 4 N 4 N 2-44 N 2 N 2 N 4 N
FACS DNA Analysis Nombre de cellules 75 150 225 300 Pic d aneuploïdie (DNA index 1.21) 0 200 400 600 800 1000 2 N 4 N Intensité de Fluorescence
FACS PMT 4 Flow cell Dichroic Filters PMT 1 Bandpass Filters PMT 2 Laser PMT 3 Purdue University Cytometry Laboratories, modified by R.F. Murphy
ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) Dosage d un anticorps Dosage d un antigène
ELISA
ELISA Enzymes Phosphatase alcaline Peroxydase (HRP) Substrats PNPP incolore (4-nitrophényl-phosphate) OPD + H 2 O 2 (orthophénylène diamine) Luminol + H 2 O 2 Produits Jaune Orange Luminescent ELISA anticorps anti-hiv GP120 http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/lafont/dosages/d3.html
Western blot Séparation & transfert des protéines + détection d protéine d intd intérêt = WB Electrophorèse en gel d acrylamided ou PAGE-SDS (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis Sodium Dodecyl Sulfate) Coloration des protéines au bleu de Coomassie
Western blot Préparation et séparation s des protéines
Western blot Electro-transfert transfert sur nylon ou nitrocellulose
Western blot
Electrophorèse 2D SDS-PAGE (PM) IEF (pi)
Spectrométrie de masse N-Laser TOF-MS Detector Quantité relative Analyse d un d échantillon tumoral 0 50 000 100 000 150 000 Masse (Da)
Spectrométrie de masse 8 500 9 000 9 500 10 000 15 10 5 0 15 10 5 0 15 10 5 0 15 10 5 0 15 10 5 0 15 10 5 0 Tumeur A-1 Tumeur A-2 Tumeur A-3 Tumeur NA-1 Tumeur NA-2 Tumeur NA-3
Spectrométrie de masse 8 500 9 000 9 500 10 000 15 10 5 0 15 10 5 0 15 10 5 0 15 10 5 0 15 10 5 0 15 10 5 0 Tumeur A-1 Tumeur A-2 Tumeur A-3 Tumeur NA-1 Tumeur NA-2 Tumeur NA-3 Echantillons Pics protéiques Tumeur A-1 Tumeur A-2 Tumeur A-3 Tumeur NA-1 Tumeur NA-2 Tumeur NA-3
Culture cellulaire Culture cellulaire 1907 : doctrine neuronale Explants tissulaires Cellules isolées Dissociation mécanique, enzymatique, EDTA Sélection EDTA : Acide éthylène diamine tétracétique
Sélection Marquage direct Culture cellulaire Marquage indirect
Culture primaire Culture cellulaire Culture secondaire Cellule unique (clonage) Culture secondaire Culture primaire : Population polymorphe de cellules Culture secondaire
Culture cellulaire Cellules Observation Hela Contraste Microscopie de phase à contraste de phase Vidéo-microscopie Contraste interférentiel
Culture cellulaire Observation Immunofluorescence Labelling of mitochondria, F-actin network, and nuclear DNA
Culture cellulaire Conditions de culture 37 C, ph, sels, CO 2 Milieu de culture Milieu de base +/-Sérum Facteurs de croissance Support
Culture cellulaire Immortalisation Les cellules non tumorales ont un nombre de divisions limité Croissance cellulaire
Culture cellulaire Immortalisation Introduction d un oncogène (SV 40, Myc) qui immortalise la cellule sans la rendre tumorale Cellules tumorales exple : He(nrietta) La(cks)
Culture cellulaire Cellule normale Cellule immortalisée Cellule transformée Divisions Ancrage, Fact. Croiss., Inhib. Contact. Cellules normales cellules cancéreuses
Culture cellulaire Intérêts Fondamental Diagnostique Thérapeutique
Culture cellulaire Mélanocytes tumoraux en culture
Culture de cellules de moelle osseuse humaine Culture cellulaire Ulex Europeaus Agglutinin-1 (UEA-1) Facteur de Von Willebrand (vwf) Collagène IV
Culture cellulaire Microscopie Electronique à Transmission (MET)
Culture cellulaire C B Actine α SM A vwf
Techniques d étude des fonctions cellulaires A Aspirating canula B Ultrasonic dissociation Dissociated tissues "human auto-culture medium" C D E
Méthodes d étude in vivo Greffes de cellules cellules souches cellules tumorales Transfert de gènes Souris transgéniques souris mucoviscidose souris prédisposées au cancer Souris Knock-out
Méthodes d étude in vivo Modèles de tumorigenèse Contrôle AE-941 Volume tumoral (cm 3 ) 60 Témoin Æ-941 40 20 0 0 3 6 9 12 15 Temps (jours)
Méthodes d étude in vivo Transfert de gènes : Modifications expérimentales du patrimoine génétique Transfert de gènes in vitro ou in vivo Vecteurs viraux ou non viraux Une expérience heureuse ou malheureuse à l hôpital Necker?
Méthodes d étude in vivo
Méthodes d étude in vivo Transfert de gène Promoteur Profil d expression spatial et temporel cdna Gène d intérêt Intron AAAA Transgène <1kb to >200kb AAAA
Méthodes d étude in vivo Transfert de gène Promoteur 1- Ubiquitaire 2- Spécifique d un tissu (Cerveau, foie, muscle ) 3- Inductible (tétracycline, interféron...) cdna Gain de fonction - Gène sauvage -mutant Perte de fonction - dominant négatif -antisens
Méthodes d étude in vivo Gène rapporteur : Promoteur du gène X Gène X Promoteur du gène X Gène rapporteur - β galactosidase - Luciférase - GFP - autres. Aequorea victoria GFP : Green Fluorescent Protein
Méthodes d étude in vivo neurogenin 1
Méthodes d étude in vivo FVB/N-TgN(MMTVneu)202Mul Promoter: MMTV, mouse mammary tumor virus Gene : Erbb-2 (HER-2; HER2; Neu; Neu oncogene; c-erbb2; c- neu; neu protooncogene) Souris homozygotes viables et fertiles Pas de phénotype chez les mâles Expression du transgène détectable dans l épithélium mammaire normal, les glandes salivaires et le poumon. Tumeurs focales apparaissent autour de 4 mois
Méthodes d étude in vivo
Méthodes d étude in vivo Green Fluorescent Protein (GFP) Témoin 9.5 day embryos
Méthodes d étude in vivo GFP Témoin Adulte
Méthodes d étude in vivo
Méthodes d étude in vivo Cellules de moelle osseuse Transfert du gène GFP (rétrovirus) Cellules de moelle osseuse Cellules GFP
Méthodes d étude in vivo Cellules de moelle osseuse GFP Coupes de cervelet 4 semaines 15 semaines Souris irradiée léthalement? Cellules sanguines
Méthodes d étude in vivo Hémisphère témoin A Hémisphère lésé B 1 j Après lésion C D 14 j Après lésion
En bio cell : Problème A Il y a des QCM et des QCMproblèmes à l examen B Il y a toujours au moins 1 réponse exacte (1 à 5) C Chaque QCM vaut 1 à 3 point(s) D J ai 1 ; 0.5 ; 0.2 ; 0 point(s) si je fais 0 ; 1 ; 2 ; 3 erreur(s), respectivement E Y a plus qu à
Problème Concernant cette population cellulaire Cel0 : A - Le sérum permet la survie B - Le sérum permet la prolifération C - L EGF est indispensable à la survie D - Le plateau de croissance atteint à 96h de culture indique que les cellules ont conservé leur inhibition de contact E - Ces caractéristiques sont compatibles avec la croissance de cellules transformées EGF : Epermal Growth Factor
Problème A propos de cette expérience : A - L iodure de Propidium est un agent fluorescent qui se lie à l ADN et permet ainsi d en estimer la quantité B - Le premier pic (gauche) correspond aux cellules en phase G1 C - Le second pic (droite) correspond aux cellules en phase S D - Les cellules Cel2 prolifèrent plus que les cellules Cel1 E - La population Cel2 est aneuploïde
Problème Les cellules Cel5 et Cel6 sont transfectées avec un plasmide comprenant : - Le promoteur du gène EGF-R devant le gène codant la GFP et avec un second plasmide comprenant le gène codant la - BFP (protéine fluorescente bleue) sous le contrôle du promoteur du gène fos. Des cellules normales de même origine subissent les mêmes modifications. Inducteur X Pro-EGFR Pro-EGFR EGFR Inducteur Y Pro-Fos Pro-Fos Fos GFP BFP
Problème Pro-EGFR GFP Pro-EGFR EGFR Pro-Fos Fos Expression Induction Pro-Fos BFP Si activé EGF-R
Problème Auantité (unités arbitraires) 30 25 20 15 10 5 0 GFP Cellules témoins Cel5 Cel6 BFP = EGF-R = Fos A propos de cette expérience : On mesure les quantités des deux protéines fluorescentes produites par les deux populations cellulaires. A - Les gènes GFP et BFP sont des gènes rapporteurs B - L expression de la GFP reflète celle du récepteur à l EGF C - L expression de la protéine BFP, comme celle de fos, est sous le contrôle de l activation de la voie de signalisation de EGF-R D - Le récepteur de l EGF est sur-exprimé dans les cellules Cel5 E - La voie de signalisation en aval de EGF-R est sur-activée dans les cellules Cel5 et Cel6
Exemple de thérapie génique Alain Fischer, Hôpital Necker, Paris - 2000 Déficit Immunitaire Combiné Sévère lié à l X (DICS-X) Moelle osseuse : cellules précurseurs γc : sous-unité des R des IL-2, 4, 7, 9, 15 γc absente ou inopérante
Exemple de thérapie génique Alain Fischer, Hôpital Necker, Paris - 2000 Déficit Immunitaire Combiné Sévère lié à l X (DICS-X) 10 patients de 1-9 mois Aspiration médullaire Selection des progéniteurs CD34+ Exposition à des vecteurs rétroviraux contenant le cdna de la chaîne γc Greffe des cellules
Exemple de thérapie génique Alain Fischer, Hôpital Necker, Paris - 2000 Suivi précoce : T, NK Reconstitution normale du pool Réponses vaccinales normales 3 mois : Retour à la maison
Exemple de thérapie génique Alain Fischer, Hôpital Necker, Paris - 2000 Science 17 th October 2003 Octobre 2002 : 2 patients développent une leucémie Vecteur rétroviral intégré dans ou à proximité de LMO2 Surexpression de LMO2
Exemple de thérapie génique Alain Fischer, Hôpital Necker, Paris - 2000 Intégration aléatoire Des rétrovirus NON!!! Insertion dans la chromatine ouverte transcriptionnellement active
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