Les préparations d insuline

Pharmacie galénique 4 ème année pharmacie Chapitre 3 : Les préparations d insuline Page 1 sur 14

Sommaire 1. Définition... 4 2. Structure et propriétés physico-chimiques de l insuline... 4 2.1. Structure... 4 2.2. Propriétés physico-chimiques... 5 3. Fabrication... 5 3.1. Obtention du principe actif (insuline) à partir du pancréas... 5 3.1.1. Obtention par extraction... 6 3.1.2. Obtention par génie génétique... 6 3.1.3. Obtention par hémi synthèse... 6 3.2. Obtention de la préparation prête à l emploi... 6 4. Les différentes préparations d insuline... 7 4.1. Insuline soluble... 8 4.2. Insuline biphasique... 8 4.3. Insuline isophane... 8 4.4. Insuline isophane biphasique... 9 4.5. Insuline amorphe (suspension)... 9 4.6. Insuline cristalline (suspension)... 9 4.7. Insuline zinc (suspension)... 10 5. Contrôle... 10 6. Les analogues de l insuline... 11 6.1. Analogues rapides... 11 6.1.1. Insuline Lispro... 11 6.1.2. Insuline Aspart... 11 6.1.3. Insuline Glulisine... 12 6.2. Analogues lents... 12 6.2.1. Insuline glargine... 12 6.2.1. Insuline Détémir... 12 Page 2 sur 14

7. Insuline par voie pulmonaire... 13 8. Etiquetage et conservation... 13 8.1. Conservation... 13 8.2. Etiquetage... 13 Page 3 sur 14

1. Définition L insuline est le principe antidiabétique naturel, sécrété par le pancréas de bœuf ou de porc puis purifié. La préparation d insuline contient une teneur comprise entre 95% et 105% d insuline porcine ou bovine. L insuline humaine est une protéine ayant la structure de l hormone antidiabétique produite par le pancréas humain. Cette insuline ne provient pas d un pancréas humain! (elle est plutôt obtenue par génie génétique ou par hémi synthèse.) L insuline est produite par modification enzymatique puis purification à partir d un pancréas de bœuf ou de porc. Les préparations injectables d insuline appartiennent aux préparations parentérales donc stériles, contenant de l insuline bovine ou porcine. Elles sont présentées sous forme de solutions, suspensions ou en combinant solution et suspension. 2. Structure et propriétés physico-chimiques de l insuline 2.1. Structure : Structure primaire : (figure p 22) L insuline est une hormone hypoglycémiante, c est un polypeptide de PM = 5803 daltons, formée de 2 chaines A et B. La chaine A est à caractère acide, contient 21 AA : le 1 er AA est la glycine, le dernier AA est l asparagine ou l acide β amido-aspartique, avec un pont disulfure S-S entre la cystéine 6 et la cystéine 11. La chaine B est à caractère neutre, contient 30 AA : le 1 er est la phénylalanine, le dernier est la thréonine. Page 4 sur 14

Ces 2 chaines A et B sont reliées entre elles par 2 ponts S-S (si ces ponts sont rompus, l activité hypoglycémiante disparaît!) Structure secondaire Structure tertiaire Structure quaternaire : Elle résulte de l auto-association des monomères d insuline pour obtenir des dimères ou des hexamères (exploités pour fabriquer les analogues de l insuline). L insuline hexamère est constituée de 3 dimères associés autour de 2 ions Zn 2+. Le Zn 2+ assure la stabilité de la molécule. La conformation des molécules d insuline dans l hexamère peut avoir 2 états (T et R) qui correspondent respectivement à une conformation allongée et à une conformation α-hélicoïdale. L hexamère R est obtenu en présence de phénol ou de métacrésol. 2.2. Propriétés physico-chimiques : ph isoélectrique = 5.4 (à ce ph, l insuline est insoluble, elle précipite) solubilité : l insuline est soluble dans l eau en milieu acide ou alcalin et dans l alcool de titre <80%. Elle précipite avec l alcool de titre proche de 90%. stabilité : les solutions aqueuses d insuline sont stables en milieu acide et résistent à des T proches de 80 pendant 30mn. Elles sont altérées en milieu alcalin par la chaleur. Toutes les insulines sont inactivées par les enzymes protéolytiques (trypsine, chymotrypsine ). cristallisation : l insuline peut cristalliser quand on change de système donc on doit maîtriser la forme polymorphe qu on va utiliser. Cette dernière agit sur la solubilité qui va influencer l activité de la molécule. 3. Fabrication 3.1. Obtention du principe actif (insuline) à partir du pancréas : Page 5 sur 14

3.1.1. Obtention par extraction : (Figures p 23-24). 3.1.2. Obtention par génie génétique : (figure p 25) On peut produire de l insuline par la bactérie intestinale Escherichia coli ou encore par les levures du boulanger Saccharomyces cerevisiae. On isole le brin d ADN humain contenant le gène d insuline, puis on l intègre dans les plasmides qui sont des molécules d ADN circulaires se trouvant dans les bactéries E-coli. En se multipliant dans le bioréacteur, ces bactéries synthétisent une insuline pratiquement identique à celle produite par un organisme humain sain. On prépare respectivement la chaine A et la chaine B de l insuline, puis on les combine par des réactions chimiques (introduction des ponts S-S). 3.1.3. obtention par hémi synthèse : Elle consiste en la conversion enzymatique de l insuline porcine par biosynthèse : l alanine terminale de la chaine B de l insuline porcine est remplacée par la thréonine (qui est l AA terminal de la chaine B de l insuline humaine). Cette technique est de moins en moins utilisée. 3.2. Obtention de la préparation prête à l emploi : Pour obtenir une préparation stérile, on doit travailler en asepsie dans une Zone à Atmosphère Contrôlée (ZAC) où le nombre de particules dans l air est contrôlé. Pour la forme solution, on peut faire aussi une filtration stérilisante (ce n est pas le cas pour la forme suspension!) Pour la suspension, on doit travailler dans la zone A qui est la plus propre des ZAC. Tous les équipements, matières premières et l eau pour préparation injectable (EPPI) doivent également être stérilisés à l avance : pour la matière première on contrôle la présence de particules pyrogènes, pour l EPPI on la stérilise par la chaleur. Le manipulateur est isolé de la préparation : il travaille dans un isolateur par le biais de gants. Page 6 sur 14

Pour la solution, on peut travailler dans la zone B. La préparation d insuline contient le principe actif (insuline), un agent isotonisant (glycérine ou glycérol), un tampon pour ajuster le ph et un conservateur antimicrobien (crésol, phénol ). NB : Les excipients ne doivent pas entraîner un désordre physiologique! La taille des particules doit être parfaitement maîtrisée! La préparation est réalisée à basse température! 4. Les différentes préparations d insuline Il y a 3 catégories de préparations d insuline selon le délai d action et la durée d action. Délai d action Durée d action Insuline à action rapide 15-30mn 5-8h Insuline à action semi 30mn - 2h30 11-24h lente Insuline à action lente 1-6h 26-36h Page 7 sur 14

Le délai et la durée d action changent selon la forme galénique : la forme solution possède le délai et la durée d action les plus courts c est une forme d urgence injectée en IV en cas de coma diabétique. Par contre, la forme suspension a une solubilité moindre ce qui prolonge la durée d action. Elle n est jamais utilisée en urgence! La prolongation de l action de l insuline consiste à ralentir sa résorption après administration SC en modifiant sa solubilité par 2 moyens : ajout d une protéine (protamine) et/ou du zinc. On doit également maîtriser la granulométrie qui, en augmentant, la vitesse de dissolution diminue et donc la biodisponibilité diminue aussi. 4.1. Insuline soluble : La préparation injectable d insuline soluble est stérile, neutre soit d insuline bovine ou porcine, soit d insuline humaine. Caractères : liquide incolore non opalescent exempt de substances étrangères, mais des traces de sédiment très fins peuvent se déposer durant la conservation. Donc on doit toujours agiter avant emploi. On ne doit jamais injecter ce type de suspensions directement par IV car ces petits cristaux ont une action fatale! Les suspensions sont injectées en SC. 4.2. Insuline biphasique : La préparation injectable d insuline biphasique est une suspension stérile de cristaux contenant de l insuline bovine dans une solution d insuline porcine (différence de solubilité entre l insuline bovine et l insuline porcine). Caractères : suspension blanche. L aspect de la plupart des particules sont des cristaux rhomboédriques de taille > 10μm et dépassant rarement 40μm (si la taille est < 10μm alors il y aura une rapidité d action). 4.3. Insuline isophane : La préparation injectable d insuline isophane est une suspension stérile soit d insuline bovine ou porcine, soit d insuline humaine, formée par complexation de l insuline à du sulfate de protamine 1 ou une autre protamine appropriée, d où la modification de la vitesse de dissociation de l insuline. Les protamines 1 : protéines basiques obtenues à partir du sperme de saumon ou de truie de mer. Page 8 sur 14

La libération de l insuline de fait par dissociation du complexe insulineprotamine via la dégradation de la protamine par les protaminases. Caractères : suspension blanche présentant au repos un sédiment blanc et un liquide surnageant incolore ou pratiquement incolore. Le sédiment est facilement remis en suspension par simple agitation. L aspect de la plupart des particules sont des cristaux en aiguilles de taille > 1μm et dépassant rarement 60μm. 4.4. Insuline isophane biphasique : La préparation injectable d insuline isophane biphasique est une suspension tamponnée stérile d insuline porcine ou humaine, associée par complexation à du sulfate de protamine 1 ou à une autre protamine appropriée dans une solution d insuline de la même espèce. Caractères : suspension blanche présentant au repos un sédiment blanc et un liquide surnageant incolore ou pratiquement incolore. Le sédiment est facilement remis en suspension par simple agitation. L aspect de la plupart des particules sont des cristaux en aiguilles de taille > 1μm et dépassant rarement 60μm. 4.5. Insuline amorphe (suspension) : La préparation injectable d insuline amorphe est une suspension stérile, neutre, soit d insuline bovine ou porcine, soit d insuline humaine. Caractères : suspension blanche présentant au repos un sédiment blanc et un liquide surnageant incolore ou pratiquement incolore. Le sédiment est facilement redispersible par simple agitation. L aspect de la plupart des particules sont des cristaux de taille non uniforme, dépassant rarement 2μm. 4.6. Insuline cristalline (suspension) : La préparation injectable d insuline cristalline est une suspension stérile, neutre, soit d insuline bovine ou porcine, soit d insuline humaine, se présente sous forme de cristaux insolubles dans l eau. Page 9 sur 14

Caractères : suspension blanche présentant au repos un sédiment blanc et un liquide surnageant incolore ou pratiquement incolore. Le sédiment est facilement redispersible par simple agitation. L aspect de la plupart des particules sont des cristaux rhomboédriques de taille > 10μm et dépassant rarement 40μm. 4.7. Insuline zinc (suspension) : La préparation injectable d insuline zinc est une suspension stérile, neutre, soit d insuline bovine ou porcine ou les 2 à la fois, soit d insuline humaine, contenant un sel de zinc approprié. L insuline est présente sous forme insoluble dans l eau. Il s agit du mélange dans un rapport de 7 à 3 de la suspension injectable d insuline zinc cristalline (70%) à de la suspension injectable d insuline zinc amorphe (30%). Caractères : suspension blanche présentant au repos un sédiment blanc et un liquide surnageant incolore ou pratiquement incolore. Le sédiment est facilement redispersible par simple agitation. L aspect de la plupart des particules sont des cristaux rhomboédriques de taille > 10μm et dépassant rarement 40μm. Il y a une proportion considérable de particules à aspect non uniforme et de taille < 2μm : ce sont les particules de la forme amorphe. 5. Contrôle Le contrôle des préparations d insuline concerne : *la stérilité et recherche des pyrogènes. *détermination du ph (6.9 7.8) qui a un rôle dans la stabilité et la solubilité. *détermination de l insuline dans le surnageant (pour la forme suspension) : % = 100 S/T (< ou = 2.5%) % : teneur pour cent de l insuline en solution S : teneur en insuline du liquide surnageant T : teneur totale de l insuline dans la préparation Page 10 sur 14

*détermination des impuretés de MM > à celle de l insuline et des protéines apparentées par des méthodes chimiques ou chromatographiques. *détermination du zinc total et du zinc en solution par spectrophotométrie d absorption atomique (SAA). NB : on doit connaître la quantité du sel de zinc dans la matière première et dans le produit fini. *autres : isotonie. 6. Les analogues de l insuline 6.1. Analogues rapides : 6.1.1. Insuline Lispro (Humalog flacons, cartouches et stylos) : Elle diffère de l insuline humaine par l inversion de la position de la lysine B29 et de la proline B28, ce qui entraîne l élimination des interactions hydrophobes et permet donc une dissociation plus rapide des hexamères en dimères et monomères de Lispro. Elle appartient aux analogues à action très brève, obtenus par modification de la molécule d insuline humaine afin de réduire sa tendance à l auto-association améliorer la solubilité délai d action plus court : l activité maximale est obtenue au bout de 30 à 70mn après l injection. Ces changements sont localisés dans la partie C terminale de la chaine B. 6.1.2. Insuline Aspart (Novorapid flacons, cartouches et stylos) : Sa structure primaire est identique à celle de l insuline humaine sauf que la proline en position B28 est remplacée par l acide aspartique. Il s agit aussi d une solution d analogue à action ultra-rapide : l activité maximale est obtenue au bout de 1 à 3h après l injection. Page 11 sur 14

6.1.3. Insuline Glulisine (Apidra flacons et stylos) : Il s agit d un analogue dans lequel l acide aspartique en position B3 de l insuline humaine est remplacée par la lysine, et la lysine en position B29 est remplacée par l acide glutamique, ce qui favorise l absorption de l insuline Glulisine. NB : l absorption de l insuline Glulisine est 2 fois plus rapide que celle de l insuline humaine rapide c.à.d. que le délai d action est raccourci (environ 15mn) et l activité maximale est obtenue au bout de 55 à 60mn après l injection. 6.2. Analogues lents : 6.2.1. Insuline glargine (Lantus ) : Comparée à l insuline humaine, elle comporte 2 modifications majeures : addition de 2 charges positives (2 arginines) sur la partie C terminale de la chaine B. Cette modification se traduit par une augmentation du phi qui passe à 6.7, ce qui rend la molécule plus soluble dans un milieu légèrement acide et plus soluble au ph physiologique. remplacement de l asparagine A21 par la glycine. Cette modification permet d avoir une solution à ph = 4 pour éviter la désamidification et la dimérisation de l insuline glargine. 6.2.2. Insuline Détémir (Levemir ) : On a aussi 2 modifications : suppression de la thréonine en position B30. acétylation de la lysine en position B29. L acide gras ajouté permet la liaison de l insuline Détémir à l albumine dans le plasma. Contrairement aux autres insulines à effet prolongé, après injection, l insuline Détémir est rapidement absorbée mais sa libération se fait de manière continue et lente : il y une importante liaison aux protéines plasmatiques la demi-vie plasmatique (t 1/2 ) est élevée. Page 12 sur 14

7. Insuline par voie pulmonaire Ce sont des préparations d insuline sous forme de spray nasal commercialisées aux USA. Elles sont contre-indiquées chez les patients présentant une maladie respiratoire chronique ou une maladie pulmonaire obstructive chronique (BPCO). La molécule n est plus commercialisée mais bénéficie encore de l AMM. Projets et nouveautés : nanoparticules et liposomes qui pourraient protéger l insuline de la dégradation par les enzymes protéolytiques de l estomac. 8. Etiquetage et conservation 8.1. Conservation : La conservation se fait dans des récipients stériles à fermeture inviolable, à l abri de la lumière et à une T de 2 à 8 C. Les préparations d insuline ne doivent pas être congelées! Par contre, la matière première peut être conservée à basses T. 8.2. Etiquetage: L étiquette doit mentionner : l activité (en UI / ml). la concentration (en mg d insuline / ml). Si la préparation renferme à la fois de l insuline bovine et de l insuline porcine, alors la concentration est exprimée comme la somme des 2 insulines. le fait que la substance soit préparée par modification enzymatique de l insuline porcine, si c est le cas. le fait que la substance soit préparée par la méthode de l ADN recombinant, si c est le cas. l espèce animale d origine, dans les cas appropriés. Page 13 sur 14

Il faut préciser : que la préparation ne doit pas être congelée. que les suspensions doivent être remises en suspension avant usage, dans les cas appropriés. les conservateurs utilisés dans la préparation, car certains peuvent être à effet notoire 1. NB : actuellement, on a développé dans chambres implantables (sites implantables) : ce sont des systèmes implantés généralement dans le thorax, et la préparation est injectée dans cette chambre (exemple : toutes les 24h) à partir de laquelle le principe actif diffuse progressivement. Excipient à effet notoire 1 : excipient pouvant entraîner des intolérances individuelles. Page 14 sur 14