UNIVERSITE PAUL SABATIER TOULOUSE III U.F.R Sciences de la Vie et de la Terre THESE

UNIVERSITE PAUL SABATIER TOULOUSE III U.F.R Sciences de la Vie et de la Terre THESE En vue de l obtention du DOCTORAT DE L UNIVERSITE DE TOULOUSE Délivrée par l Université Toulouse III-Paul Sabatier Spécialité : Physiopathologie Moléculaire, Cellulaire et Intégrée Présentée par Delphine MILHAS RÔLE DES CASPASES ET DES SPHINGOLIPIDES DANS LA SIGNALISATION CYTOTOXIQUE DU RECEPTEUR FAS DANS LES LYMPHOCYTES T Soutenue le 14 Décembre 2007 devant le jury : M. Frédéric. RIEUX-LAUCAT Rapporteur Directeur de recherche, INSERM, Paris M. Ali BETTAIEB Rapporteur Professeur, Université de Bourgogne-EPHE, Dijon M. Patrick LEGEMBRE Examinateur Chargé de recherche, INSERM, Bordeaux M. Justin TEISSIE Examinateur Directeur de recherche, CNRS, Toulouse M. Bernard DUCOMMUN Président du Jury Professeur, Université Paul Sabatier, Toulouse Directeurs de thèse : M. Hervé BENOIST Professeur, Université Paul Sabatier, Toulouse III M. Bruno SEGUI Maître de conférences, Université Paul Sabatier, Toulouse III INSERM U858, I2MR, 1 Avenue Jean Poulhès, 31432 Toulouse Cedex 4

J adresse mes sincères remerciements aux membres du jury pour avoir accepté de juger ce travail : Monsieur le Docteur Frédéric Rieux Laucat et Monsieur le Professeur Ali Bettaieb, je suis très honorée de l intérêt que vous avez porté à mon travail et je vous remercie d avoir accepté d en être les rapporteurs. Monsieur le Docteur Patrick Legembre, je suis très heureuse de vous compter parmi les membres du jury. Monsieur le Professeur Justin Teissié, je tiens à vous remercier pour notre collaboration et pour votre présence dans ce jury de thèse. Monsieur Bernard Ducommun, je vous remercie vivement d avoir accepté de présider ce jury, malgré une invitation tardive. Je tiens également à remercier Le Docteur Bruno Ségui : merci pour tout ce que tu m as enseigné pendant ces 4 années, pour ta disponibilité, ta rigueur, ta franchise, ton humour et ta passion que j admire. Le Professeur Hervé Benoist : merci pour votre esprit critique, vos conseils et pour vos remarques pertinentes qui ont souvent permis de soulever des discussions scientifiques enrichissantes. Le Professeur Thierry Levade : merci pour votre accueil chaleureux dans le monde des sphingolipides, pour votre connaissance et votre perspicacité scientifique remarquables, votre disponibilité, votre générosité et votre bonne humeur à toute épreuve. Je remercie tous les membres de l ex-u466 avec qui j ai pu travailler, en particulier : le professeur Robert Salvayre pour m avoir accueilli dans son unité, Jean-Claude Thiers pour m avoir enseigner l art d observer comme il se doit nos précieuses cellules, Marie Françoise pour sa disponibilité et tout le temps gagné

grâce à son organisation. Merci à Nathalie, Cécile et Stéphanie. Merci à tous les étudiants qui sont passés dans le laboratoire : Sabine, Claudine, Babeth, Audrey, Nicolas Carmen et Dimitri. Merci également à Jean-Claude Lepert pour son aide précieuse en cytométrie. Merci aussi à toute l équipe du thème 3 pour son accueil chaleureux : Nelly pour son écoute et ses conseils, Mogens pour les chocolats de Bruxelle et le fameux gloug, Torsten pour m avoir permis de m entraîner à parler en anglais. Nicole pour ta connaissance et ton aide technique mais aussi pour toutes nos conversations et nos rigolades, Patricia pour ton aide précieuse et pour avoir partagé avec moi les aléas des western, Houda, «la pompom girl», pour ta bonne humeur et nos rigolades, Dani, pour tes astuces informatiques et ta gentillesse. Merci à tout ceux qui ont partagé, pour un temps, l aquarium avec moi: Yann, Bertrand, Nargis, Bénédicte et Lucie. Merci à Sylvain et Toto pour la bonne ambiance que vous avez pu instaurer et nos fameuses conversations. On attend toujours le calendrier! Dans la nouvelle équipe «sphingolipidique», merci à : Nathalie pour ta gentillesse, tes conseils scientifiques et personnels. Steph pour m avoir appris à dompter les sphingolipides, pour ton aide et ta bonne humeur. Virginie merci pour ton accueil lors de mes brefs passages à l école des ARN Jean-Pierre pour ton American accent et ton sérieux lors des réunions. Merci au trio de choc des 3 postdoc, Caro, Fred et Blandine pour nous faire profiter de votre expérience, à nous petits thésards. Maintenant le sifflement de Christian est remplacé par celui de Raphaël : merci pour ta bonne humeur. Et les petits derniers, Yayha, Guillaume, Elodie, Virginie et Julie, bon courage pour la suite.

A mes pintades adorées, Sandra, Cindy, Anne et Cat, merci pour votre amitié, tous ces moments inoubliables, vos bons petits plats et nos soirées facteur, pyjama, movida et salsa et surtout pour votre soutien dans les moments difficiles. Merci à Marie et Jean-Phi pour votre gentillesse et vos conseils. On se retrouvera aux States. Merci à Jean-Phi pour m avoir initié aux plaisirs du vertige et des toboggans. Merci à tous ceux que j ai rencontré brièvement lors des stages CIES et avec qui j ai partagé les joies et les peines de la thèse. Merci à toute l équipe pédagogique de biologie cellulaire pour son accueil et les conseils de tous les enseignants avec qui j ai travaillé, en particulier Arnaud Labrousse, Raoul Mazar, et Marjorie Fanjul. Merci à toi ma Jojo pour ta fidèle amitié. Merci à Alice, Delphine et Flore pour tous ces moments passés sur les bancs de la fac A toute ma famille et un hommage particulier à mon papi et à ma mamie A papa, maman et Romain pour votre soutien, tout votre amour et pour être là toujours, pour moi. A toi, Emilien, pour tes encouragements permanents, ton réconfort et pour avoir supporté mon stress et mes indécisions.

RESUME La mort des lymphocytes T est un processus essentiel pour le maintien de l homéostasie lymphocytaire et le contrôle de la réponse immunitaire. Le récepteur Fas (CD95) et son ligand FasL (CD95-L) jouent un rôle clé dans la mort des lymphocytes T. Chez l homme, des mutations affectant Fas, FasL ou les caspases-8 et -10 sont responsables d ALPS (Autoimmune lymphoproliferative syndromes), soulignant l importance de ces protéines en physiopathologie. La caspase-8 a été montrée comme essentielle dans l apoptose induite par la stimulation de Fas. Toutefois, des travaux récents suggèrent l existence de voies de signalisation indépendantes de la caspase-8. Le céramide, un sphingolipide bioactif, joue un rôle potentiel dans l induction de la mort cellulaire. L objectif de notre travail a été de clarifier le rôle des caspases et du céramide dans la mort de lymphocytes T induite par FasL. Nos résultats indiquent que la caspase-10 est capable de se substituer à la caspase-8 dans la signalisation apoptotique de Fas, en clivant Bid (Bcl-2 interacting domain) et en activant la cascade des caspases dans des cellules Jurkat. De plus, nous montrons que les caspases-8 et - 10 jouent un rôle dans la production de céramide et dans l induction d une mort nécrotique, indépendamment de leur activité catalytique. Une inhibition de l activité de la sphingomyéline synthase (SMS), une enzyme qui convertit le céramide en sphingomyéline, est détectée en réponse à la stimulation de Fas dans des cellules sensibles mais pas dans des cellules résistantes. L inhibition préalable de la SMS, par approche pharmacologique ou épigénétique (sirna), favorise l augmentation du taux intracellulaire de céramide et la mort en réponse à FasL. L incubation de cellules Jurkat en présence d analogues exogènes de céramide s accompagne d une toxicité, suggérant un rôle du céramide dans la signalisation cytotoxique de Fas. L ensemble de nos résultats mettent en évidence le rôle essentiel des caspases-8 et -10 dans la mort apoptotique et nécrotique des lymphocytes T induite par FasL. De plus, l inhibition de l activité de la SMS favorise l accumulation intracellulaire de céramide et pourrait participer activement à la mort des lymphocytes T induite par FasL. Interférer avec le métabolisme sphingolipidique et notamment avec l activité de la SMS, pourrait représenter une nouvelle stratégie thérapeutique capable de sensibiliser des cellules résistantes à FasL ou aux traitements anticancéreux.

ABSTRACT Fas (CD95) engagement by FasL (CD95L) plays a crucial function in the regulation of T cell homeostasis and in the control of immune response, essentially through cell death induction in activated-t cells. In humans, gene mutations affecting either FasL, Fas or initiator caspases-8 and -10 are responsible for ALPS (Autoimmune Lymphoproliferative Syndrome). Fas crosslinking triggers activation of both caspase-dependent and -independent pathways. In contrast to caspase-8, controversy exists as to the ability of caspase-10 to mediate apoptosis in response to FasL. FasL-induced caspase-independent signaling pathway remains largely unknown. The ceramide, a bioactive sphingolipid, plays a potential role in cell death. The aim of our study was to clarify the role of caspases and ceramide in FasL-induced T lymphocyte death. Ours results indicate that caspase-10 can substitute to caspase-8 as an initiator caspase in Fas signaling leading to Bid (Bcl-2 interating protein) processing, caspase cascade activation, and apoptosis of human leukemia Jurkat T cells. Moreover, initiator caspases-8 and -10 can trigger cell death independently of their catalytic activities, and are absolutely required for FasL-induced ceramide production and cell death, including necrosis. The ceramide is converted to sphingomyelin (SM) by SM synthase (SMS). In Jurkat cells, FasL treatment inhibits SMS activity in a dose- and time-dependent manner. The inhibition of ceramide conversion to SM, by pharmacological approach or by sirna, enhances FasLinduced death of Jurkat and activated T cells. Novel ceramide analogs elevate endogenous ceramide content and promote Jurkat cell death, suggesting a role of ceramide in cytotoxic Fas signaling. Altogether our results highlight the essential role of caspases-8 and -10 in FasL-induced apoptotic and necrotic leukemia cell death. Moreover the inhibition of SM synthesis may facilitate FasL-induced ceramide increase and lymphocytes death. Inhibiting SMS activity may represent an interesting therapeutic strategy to sensitize cells to FasL or to anti-cancer treatments.

LISTE DES ABBREVIATIONS ACAD : Activated T Cell Autonomous Death ADN (c) : Acide DésoxyriboNucléique (complémentaire) AICD : Activation-Induced Cell Death AIF : Apoptosis Inducing Factor ALPS : Autoimmune LymphoProliferative Syndrome Apaf-1 : Apoptotic protease-activating factor-1 APC : AlloPhycoCyanin ASK-1 : Apoptosis Signal-Regulating Kinase-1 asmase : Sphingomyélinase acide ATP : Adénosine TriPhosphate AV : Annexine-V Bcl-2 : B-cell lymphoma 2 Bid : Bcl-2 interacting domain BSA : Bovin Serum Albumin CAPP : Ceramide-Activated Protein Phosphatase CARD : Caspase Recruitment Domain CCTα : CTP : phosphocholine cytidylyltransférase α CD : Cluster of Differentiation CERT : Ceramide Transfer protein CrmA : Cytokine response modifier A DAG : DiacylGlycerol DD : Death Domain DED : Death Effector Domain Diablo : Direct IAP Binding protein with LOw pi DISC : Death Inducing Signaling Complex DNA-PK : DesoxyriboNucleic Acid-Protein Kinase DNAse I : DésoxyriboNucléase I DOC : Acide Desoxycholique DR : Death Receptor ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay EndoG : Endonucléase G ESM : Ecart Standard de la Moyenne FADD : Fas-Associated protein with Death Domain FITC : Fluorescein Isothiocyanate FLICE : FADD-like ICE FLIP : FLICE Inhibitory Protein GCS : Glucosyl Céramide Synthase gld : generalized lymphoproliferation disease HtrA2 : High temperature requirement protein A2 IAP : Inhibitor of Apoptosis Protein ICAD : Inhibitor of Caspase-Activated DNase ICE : Interleukin-1β-Converting Enzyme Ig : Immunoglobuline IL6 : Interleukine-6 IP : Iodure de Propidium JNK : cjun N-terminal Kinase KO : Knock Out lpr : lymphoproliferation

MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinase MTT : Bromure de 3(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium NFκB : Nuclear Factor-κB NK : Natural Killer PARP : Poly(ADP-Ribose) Polymérase PBL : Peripheral Blood Lymphocytes PBS : Phosphate Buffered Saline PC : Phosphatidylcholine PCD : Programmed Cell Death PDMP : 1-Phenyl-2-Decanoylamino-3-Morpholino-1-Propanol PDTC : Pyrrolidine DiThioCarbamate PE : Phycoerythrine PHA : Phytohémagglutinine PI3K : PhosphatidylInositol-3-Kinase PIDD : p53-induced protein with a Death Domain PKC : Protéine Kinase C PLAD : PreLigand binding Assembly Domain PMSF : Phenyl Methyl Sulfonyl Fluorure PP2A/1: Protéine Phosphatase 2A/1 PPMP : 1-Phenyl-2-Palmitoylamino-3-Morpholino-1-Propanol PS : Phosphatidylsérine RAIDD : Receptor-interacting protein (RIP)-Associated ICH-1/CED-3 homologous death protein with a Death Domain RE : Réticulum Endoplasmique RIP : Receptor Interacting Protein RNase : Ribonucléase ROS : Reactive Oxygen Species S1P : Sphingosine-1-Phosphate SDS : Sodium Dodecyl Sulfate SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis sirna : small interfering Ribonucleic Acid SK : Sphingosine Kinase SLE : Systemic Lupus Erythematosus Smac : Second mitochondrial activator of caspases SMase : Sphingomyélinase SMS : Sphingomyéline Synthase SPT : Sérine Palmitoyl Transférase SVF : Sérum de Veau Fœtal TCR : T-Cell Receptor TNF : Tumor Necrosis Factor TNFR-1 : Tumor Necrosis Factor-Receptor-I TPCK : Tosyl Phenylalanine Chloromethyl Ketone TRAIL : TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand z-vad-fmk : Benzyloxycarbonyl Valyl-Alanyl-Aspartyl-(O-methyl)-fluoromethylketone z-aevd-fmk : Benzyloxylcarbonyl-AEVD-fluoromethylketone

SOMMAIRE

SOMMAIRE REVUE GENERALE... 5 I- La mort cellulaire... 6 I-1 L apoptose... 6 I-1-1 Caractéristiques morphologiques et biochimiques de l apoptose... 6 I-1-2 La machinerie apoptotique... 7 I-2 Les caspases... 8 I-2-1 Structure et classification... 8 I-2-2 Mode d activation... 8 I-2-3 Les caspases-8 et -10 et la voie extrinsèque... 10 I-2-4 Les caspases-2 et -9 et la voie intrinsèque... 11 I-2-5 Les caspases effectrices et leurs substrats... 13 I-3 Régulation des caspases : protéines régulatrices et inhibiteurs... 14 I-3-1 Les inhibiteurs d origine cellulaire... 14 I-3-1-1 FLIP... 14 I-3-1-2 Les IAP... 15 I-3-2 Les inhibiteurs d origine virale... 15 I-3-2-1 CrmA... 15 I-3-2-2 p35 et p49... 15 I-3-3 Les inhibiteurs chimiques... 16 I-4 Les protéines de la famille Bcl-2... 17 I-4-1 Structure et classification... 17 I-4-2 Mécanismes d action sur la mitochondrie... 18 I-5 Les facteurs solubles mitochondriaux... 19 I-6 Les autres protéases de l apoptose... 21 I-7 La mort caspase-indépendante... 21 I-7-1 La signalisation caspase-indépendante émanant des récepteurs de mort... 22 I-7-2 Rôle de la mitochondrie dans la mort caspase-indépendante... 23 I-7-3 Les protéases impliquées dans la mort caspase-indépendante... 23 I-7-4 Importance de la mort caspase-indépendante en cancérologie... 24 II- La mort des lymphocytes T... 25 II-1 Sélection thymique... 25 II-2 Délétion périphérique et AICD (Activation-Induced Cell Death)... 26 II-3 Pathologies associées à un défaut de la mort des lymphocytes T... 28 II-4 Le récepteur Fas... 32 II-4-1 Structure de Fas... 32 II-4-2 Expression et régulation de Fas... 33 II-4-3 Le ligand de Fas... 34 II-4-4 Signalisation apoptotique du récepteur Fas... 34 II-4-4-1 Initiation du signal et formation du DISC... 34 II-4-4-2 Rôle de la voie mitochondriale : cellules de type I et de type II... 37 II-4-4-3 Rôle des caspases initiatrices dans la signalisation de Fas... 38 II-4-5 Signalisations non apoptotiques activées par le récepteur Fas... 39 II-4-5-1 Fas et la mort caspase-indépendante... 39 II-4-5-2 Fas et JNK (Jun N-terminal Kinase)... 40 II-4-5-3 Fas et voie de survie : NF-κB... 42 III- Sphingolipides et mort cellulaire... 44 1

III-1 Structure et métabolisme des sphingolipides... 44 III-2 Rôle des sphingolipides dans l apoptose... 46 III-2-1 Les métabolites pro-apoptotiques... 47 III-2-1-1 Le céramide... 47 III-2-1-2 La sphingosine... 49 III-2-1-3 Les gangliosides... 50 III-2-2 Les métabolites anti-apoptotiques... 50 III-2-2-1 Le céramide-1-phosphate... 50 III-2-2-2 La sphingosine-1-phosphate (S1P)... 51 III-2-2-3 Le glucosylcéramide... 51 III-2-3 Sphingolipides et morts non apoptotiques... 52 III-3 Rôle des sphingolipides dans la signalisation apoptotique du récepteur Fas... 53 III-3-1 La voie sphingomyéline-céramide dans la signalisation de Fas... 53 III-3-2 La sphingomyéline synthase (SMS) dans la signalisation de Fas... 55 III-3-3 La synthèse de novo de céramide dans la signalisation de Fas... 56 III-3-4 La sphingosine et la sphingosine-1p dans la signalisation de Fas... 56 III-3-5 Les glycosphingolipides dans la signalisation de Fas... 57 III-4 Analogues sphingolipidiques et inhibiteurs du métabolisme du céramide en thérapie anticancéreuse... 58 III-4-1 Ciblage du métabolisme du céramide... 59 III-4-2 Ciblage de la voie Sphingosine-kinase/ S1P... 60 RESULTATS EXPERIMENTAUX... 63 I- Introduction et objectif général... 64 I-1 La caspase-8 n est pas essentielle pour l induction de l apoptose en réponse à FasL... 64 I-2 Existence potentielle d une signalisation indépendante des caspases... 65 I-3 Objectif général de la thèse... 66 II- Rôle de la caspase-10 dans la signalisation apoptotique de Fas... 67 II-1 Un rôle controversé de la caspase-10 dans la signalisation apoptotique... 67 II-2 Objectif et stratégie expérimentale de l article 1... 67 II-3 Conclusions de l article 1 :... 68 II-3-1 La caspase-10 est une caspase initiatrice dans la signalisation de Fas... 68 II-3-2 Inhibition partielle de la mort cellulaire par le z-vad... 70 II-4 Evènements mitochondriaux dans la signalisation caspase-indépendante de Fas... 72 III- Cytotoxicité induite par les caspases-8 et -10 indépendamment de leur activité catalytique... 75 III-1 Les cellules Jurkat déficientes en caspase-8 et -10 résistent à l apoptose et à la nécrose induite par FasL... 75 III-2 Objectif et stratégie expérimentale de l article 2... 76 III-3 Conclusions de l article 2... 77 III-4 L activité catalytique des caspases est nécessaire à leur effet toxique dans les cellules HeLa... 78 IV- Rôle du céramide dans la mort de cellules Jurkat... 80 IV-1 Production de céramide dans la signalisation de Fas... 80 IV-2 Rôle de la sphingomyéline synthase dans la signalisation de Fas... 80 IV-3 Objectif et stratégie expérimentale de l article 3... 82 IV-4 Conclusions de l article 3... 83 2

IV-4-1 Inhibition de l activité de la SMS dans la signalisation de Fas... 83 a- Inhibition dépendante de l activité catalytique des caspases... 83 b- Inhibition indépendante de l activité catalytique des caspases... 87 IV-4-2 L inhibition de la SMS sensibilise les lymphocytes T à la mort induite par FasL... 89 IV-5 De nouveaux analogues de céramide induisent une toxicité dépendante et indépendante de l activité catalytique des caspases... 91 IV-5-1 Objectif et stratégie expérimentale de l article 4... 91 IV-5-2 Conclusions de l article 4... 92 DISCUSSION... 96 I- Les caspases-8 et -10 sont indispensables à la signalisation apoptotique et nécrotique induite par FasL... 97 II- L inhibition de l activité de la SMS pourrait participer à la génération de céramide dans la signalisation de Fas... 100 MATERIELS ET METHODES... 103 I- Cultures et lignées cellulaires... 104 I-1 Cellules Jurkat... 104 I-2 Lymphocytes humains du sang périphérique (PBL, Peripheral Blood Lymphocytes)... 104 I-3 Cellules HeLa... 105 I-4 Transfections cellulaires... 105 II- Source de FasL... 106 III- Expression de CD95 à la surface cellulaire... 106 IV- Tests de viabilité cellulaire... 107 IV-1 Test d exclusion au bleu Trypan... 107 IV-2 Test MTT... 107 V- Tests d apoptose... 107 V-1 Analyse morphologique... 107 V-2 Externalisation des phosphatidylsérines et perméabilité membranaire... 108 V-3 Analyse de la fragmentation de l ADN... 108 V-4 Dosage de l activité des caspases : essai enzymatique DEVDase ou IETDase... 108 V-5 Essais in vitro : protéines recombinantes... 109 VI- Western Blot... 109 VI-1 Extraits protéiques totaux... 109 VI-2 Extraits protéiques cytosoliques... 110 VI-3 Migration électrophorétique des extraits protéiques... 110 VII- Analyse de la localisation subcellulaire des protéines mitochondriales... 110 VIII- Analyse des sphingolipides... 111 VIII-1 Extraction lipidique... 111 VIII-2 Dosage du céramide (méthode de la DAG kinase)... 111 VIII-3 Analyse du profil sphingolipidique... 112 VIII-4 Mesure de la synthèse de sphingomyéline... 112 VIII-5 Dosage des activités enzymatiques de la SMS et de la GCS... 113 3

IX- Analyse de l expression des ARNm... 113 X- Anticorps et autres réactifs... 114 REFERENCES... 115 4

REVUE GENERALE 5

I- La mort cellulaire Trois grands types de mort cellulaire ont été définis, l apoptose, la mort autophagique et la nécrose. L apoptose (PCD de type I) et la mort autophagique (PCD de type II) sont des morts cellulaires programmées (PCD, Programmed Cell Death) induites par un signal codé génétiquement. Différemment, la mort de type III, la nécrose, est provoquée accidentellement. Récemment, des formes intermédiaires de PCD caspase-indépendante ont été décrites ; il s agit de l apoptose-like et de la nécrose-like qui possèdent certaines caractéristiques de l apoptose, de la nécrose et de l autophagie. Il existe aussi deux autres types de mort cellulaire non classifiées : la catastrophe mitotique qui intervient lors d une mitose anormale (défaut au cours de la métaphase ou de la cytodiérèse) et entraîne l apparition respective de micro-noyaux et de cellules multinucléées et l anoïkis qui correspond à l apoptose induite par le détachement des cellules de leur support (Kroemer et al., 2005). I-1 L apoptose L apoptose (terme évoquant la chute des feuilles à l automne), la plus connue des morts cellulaires programmées, a été définie en 1972. Elle correspond aux phénomènes qui conduisent à la mort physiologique des cellules. Elle a toujours été opposée à la nécrose, au cours de laquelle la rupture physique de la membrane plasmique et la destruction «brutale» de la cellule provoquées par des conditions anormales conduisent au déclenchement de réponses inflammatoires. L apoptose joue un rôle majeur au cours du développement embryonnaire, de la croissance, ainsi que chez l'adulte, où elle est essentielle pour le maintien de l homéostasie cellulaire. Ainsi, une dérégulation des mécanismes contrôlant l apoptose peut participer au développement de pathologies telles que les cancers et les maladies autoimmunes (dans le cas d un défaut de mort) ou les maladies neurodégénératives et les déficits immunitaires (dans le cas d un excès de mort) (Fadeel et al., 1999; Thompson, 1995). I-1-1 Caractéristiques morphologiques et biochimiques de l apoptose L apoptose est définie par des modifications morphologiques caractéristiques observables au niveau du noyau et de la membrane plasmique. Une condensation et une fragmentation de la chromatine nucléaire ainsi qu une réduction du volume cellulaire sont 6

d abord observées. Puis, le noyau se fragmente et la membrane plasmique présente des évaginations (blebbing) à partir desquelles se forment plus tardivement les corps apoptotiques. Des modifications biochimiques typiques interviennent également au cours de l apoptose : la fragmentation internucléosomale de l ADN, un disfonctionnement mitochondrial et l externalisation des phosphatidylsérines (PS) à la surface cellulaire. Ce dernier phénomène semble participer à la reconnaissance et à la phagocytose des cellules apoptotiques par les macrophages. Ainsi, puisque l intégrité de la membrane plasmique est maintenue jusqu à l élimination des corps apoptotiques, la réaction inflammation est limitée (Kerr et al., 1972). Il est à noter qu in vitro, des altérations de la perméabilité membranaire sont détectables aux stades tardifs ; il s agit de nécrose secondaire ou post-apoptotique. Enfin, l activation de protéases de la famille des Caspases (Cystéinyl aspartate specific proteinase) constitue une véritable signature de l apoptose. En effet, les caspases clivant des protéines structurales de la cellule et inactivant des protéines essentielles à la survie, elles sont responsables de la plupart des caractéristiques morphologiques et biochimiques de l apoptose (Cohen, 1997). I-1-2 La machinerie apoptotique Il existe deux voies majeures d induction de l apoptose : - La voie extrinsèque est initiée au niveau de la membrane plasmique par l activation de récepteurs de mort, membres de la superfamille du TNF-R (Tumor Necrosis Factor Receptor) tels que le TNF récepteur-1 (TNFR-1), Fas (CD95 ou APO-1) et TRAIL (TNFrelated apoptosis inducing ligand) récepteur, appelé aussi DR4 et DR5 pour «Death Receptor» (Smith et al., 1994). Elle permet l activation de la cascade des caspases indépendemment de la mitochondrie. - La voie intrinsèque implique la mitochondrie et est activée par divers agents de stress tels que la privation en sérum, les radiations ionisantes, les dommages à l ADN, les agents chimiothérapeutiques, les infections virales ou bactériennes. Elle permet notamment l activation de protéines membres de la famille de Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) qui participent à la perméabilisation de la membrane externe mitochondriale (MOMP : Mitochondrial outermembrane permeabilization) et au relargage de facteurs mitochondriaux solubles impliqués dans la signalisation apoptotique (Kroemer and Martin, 2005). Ces deux voies de signalisation conduisent à deux phénomènes centraux dans l apoptose qui sont l activation de la cascade des caspases et la perméabilisation de la 7

membrane mitochondriale (Figure 4) (Chipuk and Green, 2005). Au travers de la description des caspases et des protéines de la famille de Bcl-2, nous verrons comment ces deux voies sont interconnectées au cours de l apoptose. I-2 Les caspases I-2-1 Structure et classification Les caspases sont des cystéines protéases possédant un résidu cystéine dans leur séquence nécessaire à l activité catalytique. Elles clivent spécifiquement leurs substrats après un résidu d acide aspartique. Parmi les 13 caspases identifiées chez l homme, certaines sont impliquées dans les phénomènes d inflammation ou de différenciation (caspases-1,-4,-5,-12 et 14) tandis que les caspases-2,-3,-6,-7,-8,-9,-10 participent à l apoptose (Kroemer and Martin, 2005). Elles possèdent un prodomaine en N-terminal de longueur variable et un domaine catalytique en C terminal composé d une petite sous-unité (10-12 kda) et d une grande sous-unité (17-20 kda) portant le site catalytique (cf figure 1) (Fuentes-Prior and Salvesen, 2004). Les caspases de l apoptose peuvent être divisées en deux catégories, les caspases initiatrices (caspases-2, 8, 9 et 10) possédant un long pro-domaine N-terminal et qui sont activées précocement dans la cascade apoptotique et les caspases effectrices (3, 6 et 7) qui ont un domaine N-terminal court et qui sont activées dans la phase exécutrice de l apoptose (Thornberry and Lazebnik, 1998). I-2-2 Mode d activation Elles sont synthétisées en tant que pro-enzymes inactives : sous forme de monomères pour les caspases initiatrices et de dimères pour les caspases effectrices (Boatright et al., 2003). La protéolyse au niveau de sites de clivage internes permet de libérer le site catalytique des caspases. La forme active des caspases est constituée de l association de la petite et de la grande sous-unité formant un hétérodimère (Figure 1) (Boatright and Salvesen, 2003). Ainsi, pour les caspases effectrices le clivage protéolytique semble indispensable pour l activation. A l inverse, pour les caspases initiatrices la dimérisation des proformes monomériques inactives est suffisante à l activation tandis que le clivage semble seulement stabiliser les dimères actifs formés (Boatright et al., 2003; Chang et al., 2003; Donepudi et al., 2003). 8

Le mode d activation préférentiel des caspases initiatrices implique leur recrutement au niveau de plateforme de signalisation. Ce recrutement est possible grâce à des domaines particuliers présents au niveau du prodomaine des caspases initiatrices tels que le domaine CARD (Caspase Recruitment Domain) pour les caspases-9 et -2 ou le domaine DED (Death Effector Domain) pour les caspases-8 et -10 (Figure 2) (Bao and Shi, 2007). Le recrutement des caspases initiatrices au sein de ces complexes favorise leur oligomérisation et leur activation vraisemblablement par modifications conformationelles. Les caspases initiatrices une fois activées peuvent cliver et activer les caspases effectrices. De plus, il existe une boucle d amplification positive de la cascade des caspases qui permet l activation de caspases en amont de la signalisation par des caspases activées en aval. Par exemple la caspase-8 peut être clivée par les caspases effectrices -3 et 6 in vitro (Sohn et al., 2005). Figure 1 : Structure générale des pro-caspases et des caspases activées. Les clivages intrachaînes permettent la séparation du prodomaine puis de la grande sous unité p20 et de la petite sous-unité p10 de la pro-caspase. La forme active des caspases est constituée de l association de la grande et de la petite sous-unité. QACxG : séquence du site catalytique contenant le résidu cystéine. 9

Figure 2 : Les différents domaines structurant les caspases (Bao and Shi, 2007) Les domaines CARD et DED sont présents au niveau du prodomaine des caspases initiatrices. Les grandes flèches représentent les sites de clivage entre les grandes (p20) et petites sous-unités (p10) tandis que les petites flèches indiquent les autres clivages. Le résidu cystéine du site catalytique est représenté par un trait rouge. Les boucles L1 à L4 forment le site actif des caspases. I-2-3 Les caspases-8 et -10 et la voie extrinsèque Les caspases-8 et 10 sont activées par la voie extrinsèque qui est initiée par les récepteurs de la famille du TNFR. Ces récepteurs transmembranaires de type I sont caractérisés par un domaine extracellulaire conservé riche en cystéines et un domaine intracellulaire appelé domaine de mort (DD, Death Domain) de 80 acides aminés qui permet l interaction avec des protéines adaptatrices. Présents à la surface cellulaire sous forme de trimères pré-associés, la fixation de leurs ligands respectifs, le TNFα, FasL (CD95-L) et TRAIL (Apo2L), entraîne l agrégation des récepteurs et leur activation permettant le recrutement de protéines adaptatrices au niveau du DD. Ainsi, dans la signalisation de Fas, la protéine FADD (Fas-Associated Death Domain protein) est recrutée au niveau du récepteur par son domaine DD (Chinnaiyan et al., 1995) et permet à son tour le recrutement des caspases-8 et -10 par le domaine DED présents à la fois sur FADD et sur les caspases initiatrices (Muzio et al., 1996). Un complexe multimoléculaire appelé DISC (Death Inducing Signaling Complex) est alors formé (Figure 3b) (Kischkel et al., 1995). Par proximité ces 10

caspases se dimérisent et cette dimérisation semble suffisante pour rendre les caspases actives et permettre leur maturation par protéolyse. Les clivages intrachaînes au niveau des sites consensus permettent la séparation des sous-unités catalytiques puis la libération du prodomaine. Deux hypothèses de maturation de la caspase-8 ont été émises, le clivage interdimères et l autoprotéolyse (clivage intramoléculaire) (Chang et al., 2003; Chen et al., 2002). Une fois activée, les caspases-8 et -10 peuvent cliver et activer les caspases-3 et -7, des caspases effectrices de l apoptose. Elles peuvent également induire la protéolyse d autres protéines de la signalisation apoptotique. Par exemple le clivage de Bid (Bcl-2 interacting domain), une protéine membre de la famille de Bcl-2, par la caspase-8 permet la génération d une protéine Bid tronquée (tbid) qui transloque à la mitochondrie et participe à la perméabilisation des membranes mitochondriales (Li et al., 1998). Ainsi, la voie extrinsèque d induction d apoptose rejoint la voie intrinsèque et conduit à l induction d événements mitochondriaux. I-2-4 Les caspases-2 et -9 et la voie intrinsèque Les membres de la famille de Bcl-2 participent à la voie intrinsèque en agissant sur la perméabilisation de la membrane externe mitochondriale (MOMP : Mitochondrial outermembrane permeabilization) qui conduit au relargage du cytochrome c de la mitochondrie. Le cytochrome c libéré dans le cytosol s associe avec Apaf-1 (Apoptotic Protease- activating factor), la protéine qui permet le recrutement ATP-dépendant de la pro-caspase-9 par l intermédiaire des domaines CARD présents à la fois sur la caspase-9 et sur Apaf-1. Le complexe ainsi formé est appelé apoptosome et permet l activation de la caspase-9 (Figure 3c) (Zou et al., 1999). Par ailleurs, comme son prodomaine n est pas clivé suite à son activation, la caspase-9 reste liée à l apoptosome au niveau duquel elle active directement la caspase-3. La caspase-2 est également activée par la voie intrinsèque mais plus spécifiquement en réponse à des dommages à l ADN déclenchés soit directement par les radiations ionisantes ou indirectement par l étoposide qui, en inhibant la topoisomèrase II, favorise les cassures de l ADN (Zhivotovsky and Orrenius, 2005). Dans ces conditions, le suppresseur de tumeur p53 est activé et induit l expression de PIDD (p53-induced protein with a DD). Par interaction avec le DD, PIDD recrute RAIDD (RIP (Receptor interacting protein)-associated ICH-1/CED-3 homologous death protein with death domain) qui à son tour recrute la procaspase-2 par l intermédiaire du domaine CARD présent à la fois sur RAIDD et sur la pro- 11

caspase-2. Le complexe multimoléculaire formé, nommé PIDDosome, sert de plateforme d activation pour la caspase-2 (Figure 3a) (Tinel and Tschopp, 2004). Des études in vitro indiquent qu une fois activée la caspase-2 peut activer la caspase-8 et participer à la perméabilisation des membranes mitochondriales par l intermédiaire du clivage de Bid (Lassus et al., 2002; Lin et al., 2004a). Figure 3 : Les complexes d activation des caspases initiatrices (Bao and Shi, 2007) a, La caspase-2 est activée par le PIDDosome constitué de PIDD, RAIDD et de la procaspase-2 ; b, Le DISC formé au niveau du récepteur Fas permet l activation des caspases-8 et -10 par l intermédiaire de FADD ; c, La caspase-9 est activée par l apoptosome composé de sept molécules d Apaf-1 qui se lient au cytochrome c en présence d ATP. Figure 4 : Les voies de signalisation intrinsèque et extrinsèque de l apoptose conduisant à l activation des caspases effectrices (Chipuk and Green, 2005) 12