REALISATION DE L ANTIBIOGRAMME Dr Roughyatou Ka
Introduction Rôle du laboratoire fondamental dans le choix d'une thérapeutique antibiotique Condition: isolement et identification de la bactérie incriminée dans l'infection Nombreux tests de sensibilité des bactéries vis-à-vis des molécules d'antibiotiques Objectifs: - détecter des résistances bactériennes - d'aider le praticien dans sa prescription
Introduction La sensibilité d'une bactérie est mesurée par la concentration minimale inhibitrice (CMI) de l'antibiotique considéré: la plus petite quantité d'antibiotique capable d'inhiber une croissance visible à l'œil nu
Introduction La CMI d'un germe donné peut être mesurée par différents procédés de laboratoire : - Méthodes de dilution en milieu liquide ou en milieu solide - Méthodes de diffusion en milieu gélosé: antibiogramme standard méthode E-test - Méthodes semi-automatisées ou automatisées
ANTIBIOGRAMME STANDARD
Introduction technique d étude de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques méthode de diffusion en milieu gélosé avec des disques imprégnés d antibiotique et la mesure des diamètres, (méthode Kirby Bauer) recommandé par l OMS permet de mesurer la capacité d un antibiotique à inhiber la croissance bactérienne in vitro méthode standard, reproductible
Intérêts Thérapeutique : Permet un choix judicieux des antibiotiques Epidémiologique : Surveillance de la résistance bactérienne dans le temps, ce qui permet une adaptation de l antibiothérapie probabiliste Diagnostique : identification bactérienne la mise en évidence de résistances naturelles
Principe Des disques de papier buvard, imprégnés des antibiotiques à tester, sont déposés à la surface d'un milieu gélosé, préalablement ensemencé avec une culture pure de la souche à étudier Dès l'application des disques, les antibiotiques diffusent de manière uniforme si bien que leurs concentrations sont inversement proportionnelles à la distance du disque
Principe Après incubation, les disques s'entourent de zones d'inhibition circulaires correspondant à une absence de culture À la limite des zones d'inhibition, il existe dans la gélose des concentrations d'antibiotiques égales aux CMI
Matériel Milieux de culture.gélose de Mueller Hinton : entérobactéries, Staphylocoques et Pseudomonas et autres bacilles à Gram négatif non fermentaires.gélose de Mueller Hinton hypersalée : recherche de la résistance à la méticilline de Staphylococcus aureus.gélose de Mueller Hinton additionné de 5% de sang de mouton : Streptocoques.Gélose chocolat + Isovitalex pour Haemophilus et Neisseria
Matériel Autres -Disques d antibiotiques -Densitomètre/étalons de turbidité (échelle McFarland) -Ecouvillons stériles -Pipettes Pasteurs -Boites de Pétri -Tubes à vis, tubes à hémolyse -Agitateur type vortex -Eau physiologique -Applicateur de disque ou pinces [souche fraiche de 18 à 24h et correctement identifiée]
Contrôle de qualité Contrôle régulier avec des souches de référence, fournies par l OMS Souches introduites dans le lot d antibiogramme du jour à effectuer par le laboratoire ; ce qui permet de valider la technique, de vérifier la qualité des milieux et réactifs utilisés et la performance du manipulateur Souches conservés à -20 C ou au mieux à -80 C
Technique Préparation de l inoculum -Prélever: une colonie si entérobactérie ou Pseudomonas deux colonies pour Staphylocoques et Streptocoques -Emulsionner les colonies dans un tube à hémolyse contenant 2ml d eau physiologique et agiter au vortex
Technique Ajustement de la turbidité de l inoculum Ajuster la densité de l inoculum à celle de l étalon 0.5 Mac Farland ou grâce à un densitomètre en y ajoutant, soit un fragment de colonie, soit de l eau physiologique
Technique Dilution de l inoculum -Entérobactéries et Pseudomonas dilution au 1/100 turbidité de 10 6 UFC -Staphylocoques et Streptocoques dilution au 1/10 turbidité de 10 7 UFC -Neisseria, Haemophilus et S. pneumoniae dilution au 1/10 turbidité de 10 7 UFC
Technique Ensemencement des boites Les boites sont d abord séchées à l étuve à 37 C -Tremper un écouvillon stérile sec dans l inoculum -Eliminer l excès en pressant l écouvillon contre les parois du tube -Ensemencer en stries sur toute la surface de la boite à trois reprises -Passer l écouvillon sur le bord de la gélose Nb : on peut également ensemencer les boites par la technique par inondation
Technique Choix des disques d antibiotiques Fonction de la famille, du genre voir de l espèce bactérienne
Technique Disposition des disques d antibiotiques avec un distributeur ou à l aide de pinces stériles -Appuyer doucement sur chaque disque pour assurer un contact uniforme avec le milieu -Respecter une distance de 30mm entre deux disques et une distance de 15mm entre le disque et le bord de la boite -Disposer au maximum 7 disques sur une boite ronde de 90mm et 16 disques sur une boite carrée de 120mm (disposition selon la classification en famille, ce qui facilite la lecture et l interprétation) -Incuber
Technique Lecture des boites sous un bon éclairage, avec un pied à coulisse ou une règle graduée Mesurer et noter le diamètre d inhibition autour de chaque antibiotique en mm Les résultats seront interprétés en fonction des diamètres critiques figurant dans des tableaux fournis par les fabricants des disques (abaques de lecture)
Technique Lecture des boites - Si le diamètre mesuré est inférieur au diamètre correspondant à la concentration critique supérieure, la souche est résistante - Si le diamètre mesuré est supérieur au diamètre correspondant à la concentration critique inférieure, la souche est sensible - Si le diamètre mesuré est compris entre les diamètres correspondant aux deux concentrations critiques, la souche est de sensibilité intermédiaire
Technique Lecture des boites La méthode de diffusion ne permet pas de chiffrer directement la valeur de la CMI. Toutefois, il existe une relation simple entre les diamètres des zones d'inhibition et les valeurs des CMI grâce à des droites de concordance ou droites de régression
Technique Corrélation CMI/diamètre d inhibition -Nombreuses souches de la même espèce -Mesure de leur CMI (dilution) et du diamètre d inhibition (diffusion) 100 80 60 Zone S Zone I Zone R Répartition en 2 groupes de souches 40 20 D2 = 22 mm D1 = 20 mm 0 C1 C2 Détermination des valeurs critiques C1 et C2: concentrations critiques haute et basse D1 et D2: diamètres critiques haut et bas,001,01,1 1 10 100 1000 CMI (mg/l)
Interprétation clinique Trois catégories cliniques ont été retenues pour l'interprétation des tests de sensibilité in vitro : Sensible (S), Résistant (R) et Intermédiaire (I) - Les souches catégorisées S sont celles pour lesquelles la probabilité de succès thérapeutique est forte dans le cas d'un traitement par voie systémique avec la posologie recommandée dans le résumé des caractéristiques du produit
Interprétation clinique - Les souches catégorisées R sont celles pour lesquelles il existe une forte probabilité d'échec thérapeutique quels que soient le type de traitement et la dose d'antibiotique utilisée
Interprétation clinique - Les souches catégorisées I sont celles pour lesquelles le succès thérapeutique est imprévisible. Ces souches forment un ensemble hétérogène pour lequel les résultats obtenus in vitro ne sont pas prédictifs d'un succès thérapeutique
Lecture interprétative de l antibiogramme fondée sur la connaissance des phénotypes de résistance nécessite une identification correcte de la souche et une méthode d'antibiogramme parfaitement standardisée
Lecture interprétative de l antibiogramme Intérêts - De vérifier la cohérence germe/antibiogramme - De transformer un résultat catégorisé "sensible" en un résultat "intermédiaire" ou "résistant" en raison d'un risque d'échec thérapeutique
Lecture interprétative de l antibiogramme Intérêts - De détecter les phénotypes de résistance impossibles ou hautement improbables : il faudra alors vérifier l'identification bactérienne, contrôler la pureté de l'inoculum et contrôler la technique de l'antibiogramme - De généraliser des résultats à des antibiotiques non testés