Mécanisme moléculaire de latence des Herpesviridae, Le modèle Epstein Barr

Cours du 25/11/08 de 17h à 18h30 RT : Adrien Gilbert Professeur : J.C. Nicolas RL : Iris Bitumba Mécanisme moléculaire de latence des Herpesviridae, Le modèle Epstein Barr Plan du cours : I. Découverte et spécificité du Virus Epstein Barr 1. Découverte du virus 2. Association au carcinome nasopharyngé 3. Association à la mononucléose infectieuse 4. Un virus à haut pouvoir transformant 5. Cycle lytique du Virus Epstein Barr 6. Paradoxes du Virus Epstein Barr II. Etude de lignées cellulaires 1. Notion de lignées productrices et non productrices 2. Programme de prolifération lymphoblastoïde 3. Protéines virales produites par les lignées 4. Types de latence des différentes lignées III. Etude ex vivo des tumeurs 1. Latence des cellules du lymphome de Burkitt 2. Latence du lymphome de l immunodéprimé 3. Latence intermédiaire associée au carcinome nasopharyngé et à la maladie de Hodgkin IV. Etude des lymphocytes de sujets sains 1. Outils 2. Rappel sur la maturation des lymphocytes B 3. Etudes des lymphocytes circulants 4. Etudes de cellules des amygdales V. Synthèse des résultats, programmes de latence de l EBV et implication dans les processus oncogènes 1. Synthèse des différentes latences de L EBV 2. Cycle viral et enchaînement des différentes latences 3. Etiologie des processus oncogènes

I. Découverte et spécificité du Virus Epstein Barr 1. Découverte du virus Le virus Epstein Barr est un virus tout à fait particulier qui ne suit pas les règles de la virologie classique. Le virus Epstein Barr (EBV) a été étudié en premier par des chirurgiens. Un chirurgien du nom de Burkitt a été étonné de la répartition d un lymphome (appelé par la suite «lymphome de Burkitt») apparaissant surtout chez les jeunes enfants d Afrique centrale (on appelle cette localisation «la ceinture de Burkitt»). Il a effectué une étude épidémiologique qui l a conduit à se demander si cette maladie pouvait avoir des origines infectieuses. Les cas de lymphome de Burkitt correspondant aux zones endémiques du paludisme, il a au départ relié l apparition du Burkitt au paludisme, mais cela ne collait pas. Il a fait ensuite appel à des virologues pour étudier le lymphome chez les enfants. Ils ont trouvé toutes sortes de virus mais qui été aussi présents chez les enfants non atteints par le lymphome de Burkitt. Deux idées permettent alors la découverte de l EBV. Burkitt a tout d abord l idée d envoyer des prélèvements d enfants africains atteints à un virologue, M. Epstein, qui travaille à Bristol avec Mlle Barr. Les cellules de ce lymphome sont mises en culture. Epstein et Barr se rendent compte qu il s agit de lymphocytes qui poussent dans des milieux de culture peu sophistiqués (il ne possédait pas à l époque de milieux de culture pour faire pousser des lymphocytes et toutes les cultures tentées de lymphocytes de sujets normaux avaient été un échec). Ces lymphocytes peuvent se multiplier. Ils établissent des lignées cellulaires de lymphocytes de Burkitt. La deuxième idée «exceptionnelle» consiste à regarder en microscopie électronique les lymphocytes (ce qui ne se faisait pas à l époque). Ils observent alors que les lymphocytes sont envahis par un virus qui à la même morphologie que l herpès simplex. Pourtant quand on met ces cellules en culture en présence d herpès simplex, il n y a pas infection des cellules. Ils se disent donc qu ils ont à faire à un nouveau virus. Nous sommes à une époque où l on venait de décrire tous les virus oncogènes chez l animal. Enfin on découvre un virus oncogène chez l homme (de nos jours 15% de l étiologie des cancers est liée à un virus), en effet le lymphome de Burkitt se révèle être un cancer constitué de lymphocytes tumoraux. Ces lymphocytes une fois infectés acquièrent un pouvoir transformant : ils sont immortalisés. Burkitt s adresse ensuite à un couple de virologues, les Henle. Ils utilisent les antigènes du virus responsablent du lymphome de Burkitt et ils mettent au point un sérodiagnostic capable de révéler la présence d anticorps chez les sujets. On peut alors regarder si le sujet à été en contact avec le virus et prévoir l arrivée d un lymphome. Les Henle testent leur sérodiagnostic aux Etats Unis et 1OO% des individus ont les anticorps contre ce virus. 2. Association au carcinome nasopharyngé Le carcinome nasopharyngé est un cancer indifférencié des cellules du nasopharynx. On s aperçoit que les anticorps sont présents à des taux très élevés chez les sujets atteint d un carcinome nasopharyngé (sérologie positive). L EBV est un virus associé à un pouvoir lymphotrope (c est-à-dire provoquant des

lymphomes), à une prolifération des lymphocytes ainsi qu à un cancer épithélial. 3. Association à la mononucléose infectieuse Actuellement si on regarde en Europe ou en Afrique, 95 à 99% de la population est infectée par ce virus. Ce virus persiste dans l organisme, on l a pratiquement tous. On cherche alors à l époque quelle est la primo-infection de ce virus. La réponse est obtenue grâce à une technicienne du laboratoire des Henle, qui était séronégative pour l EBV en partant en vacances et qui en est revenue positive (pour la petite histoire). On découvre en l interrogeant qu elle a contracté une mononucléose infectieuse lors de son séjour. Il s agit de la première association entre l EBV et la mononucléose infectieuse. On savait déjà que cette dernière était caractérisée par une prolifération de lymphocytes. On effectue des études et l on conclue que la mononucléose infectieuse est la phase de primo-infection de l infection par l EBV. La mononucléose infectieuse correspond à des grands monocytes qui sont certainement dus à une réponse immunitaire extrêmement puissante. On a une stimulation antigénique permanente qui conduit à un combat entre le virus, qui fait proliférer les lymphocytes B (LB), et une forte défense immunitaire elle aussi mobilisée en permanence pour éliminer le virus. La réponse immune cellulaire spécifique est médiée par les lymphocytes T cytotoxiques (CTL). Le virus est présent en permanence dans la salive. C est pourquoi le virus va passer d un individu à un autre très rapidement. On a moins de risque de développer une mononucléose infectieuse quand on se fait contaminer jeune (5-6 ans) par l EBV, comme c est le cas pour 50 à 80% des enfants, car c est lors de la contamination chez les jeunes adultes qu il y a le plus de risque de contracter une mononucléose infectieuse. 4. Un virus à haut pouvoir transformant On a une lignée qui vient de cellules normales (il s agit d une lignée lymphoblastoïde). On la met en présence de l EBV (surnageant). Les cellules acquièrent un nouveau pouvoir : le pouvoir transformant ou immortalisant (immortalisant dans ce cas car nous ne somme pas dans un processus cancéreux). On vit en bonne entente avec ce virus qui a un pouvoir transformant chez l immunocompétent (logique puisqu il consiste à une prolifération de lymphocytes absents chez le sujet immunodéprimé). Il n y a jamais de signe de réactivation et rarement de transformation. 5. Cycle lytique du Virus Epstein Barr L EBV est un virus à ADN. Son cycle lytique commence par sa fixation sur un LB «naïf» (c est-à-dire latent, qui ne se reproduit pas) qui a pour conséquence d activer ce dernier. Il y a ensuite mise en route du programme de prolifération lymphoblastoîde. 5% des LB vont entrer dans un cycle lytique qui conduit à la mort cellulaire. Il y a d abord fusion entre l enveloppe du virus et la membrane plasmique du LB. Ce cycle lytique est très classique : on assiste à la transcription des gènes très précoces activateurs de la transcription, puis des gènes précoces qui répliquent l ADN et enfin les gènes tardifs qui vont donner les protéines de structure.

6. Paradoxes du Virus Epstein Barr On a un virus qui est tout à fait paradoxal. Les deux paradoxes de ce virus sont : - Il possède un des plus haut pouvoir transformant de la virologie (si on le met au contact de lymphocyte, un lymphocyte sur deux est transformé ou immortalisé les autres virus oncogènes classiques transforment une cellule sur 1000) pourtant il n est quasiment jamais associé à un processus prolifératif chez le sujet immunocompétent. - In vivo l EBV induit une réponse immunitaire extrêmement forte mais cette réaction cytotoxique ne permet jamais d éliminer le virus, qui persiste durant toute la vie de l individu. II. Etude de lignées cellulaires 1. Notions de lignées productrices et non productrices Ce qui est étonnant avec l EBV, c est que lorsque l on fabrique des lignées cellulaires, il y en a qui produisent du virus (cycle lytique) et d autres qui n en produisent pas. On obtient alors un système expérimental de latence qui nous permet d étudier ce processus qui correspond à la persistance du virus ainsi que les facteurs qui permettent de comprendre le phénomène de transformation. On peut transformer des lignées productrices en non productrices par le biais de produits chimiques, ce qui prouve bien que le virus a persisté. 2. Programme de prolifération lymphoblastoïde Le virus se fixe sur des LB latents, activant ainsi le cycle cellulaire. Il va y avoir prolifération des LB. Ce programme de prolifération s appelle «le programme de prolifération lymphoblastoïde». On a alors de temps en temps, spontanément ou avec des inducteurs, quelques cellules qui vont répliquer le virus. On obtient des lignées lymphoblastoïdes. Ce qui étonnant dans les lignées productrices, c est qu il va toujours y avoir de 0 à 5% de cellules qui produisent du virus. Ce pourcentage est stable. Quand elles produisent du virus, elles meurent et elles sont alors remplacées par 0 à 5% de cellules. On ne comprend pas très bien comment cette équilibre à lieu. On a ainsi des modèles expérimentaux qui tuent les lymphomes chez la souris en induisant la réplication du virus. 3. Protéines virales produites par les lignées On analyse dans les lignées infectées les protéines virales produites. On observe : - les EBNA (antigène nucléaire Epstein Barr) qui sont au nombre de 6 - les LMP (Latente Membrane Protéine) qui peuvent être de type 1, 2a ou 2b

- les Eber qui sont de petits ARN non traduits qu on retrouve en quantité très importante dans chaque cellule. Les virologues ont fait les premiers diagnostics in situ avec des sondes froides avec lesquelles ils pouvaient repérer les Eber. Il s agit d un test très intéressant car la présence d Eber indique que l on a forcément affaire à un lymphome associé à l EBV. 4. Types de latence des différentes lignées Si on prend la lignée de Burkitt (la lignée fabriquée à partir de la tumeur) et que l on utilise toute une batterie d anticorps et de sondes pour savoir ce que produit ces cellules, on trouve les Eber et une seule protéine qui est l EBNA1. On appelle ce cas latence 1. Par contre si on prend des lignées lymphoblastoïdes obtenues à partir de lymphocytes normaux provenant de sang de cordon ombilical et qu on a transformé in vitro, elles expriment toutes les protéines et les Eber. Elles vont en plus être productrices de virus. On a alors une latence 3. Epstein et Barr ont eu de la chance car ces lignées quand elles sont jeunes n expriment pas de virus. Ils ont regardé l expression du virus quand elles avaient switché de non productrices à productrices. III. Etude ex vivo des tumeurs Maintenant on fait de l ex vivo, c est-à-dire que l on sort la tumeur du vivant et on la regarde sur des coupes. On observe alors la latence des cellules infectées. 1. Latence des cellules du lymphome de Burkitt On trouve que le lymphome de Burkitt a une latence 1. Ceci pouvait sembler évident mais on en a confirmation. 2. Latence du lymphome de l immunodéprimé On trouve aussi que le lymphome de l immunodéprimé a une latence 3. Ceci est cohérent avec le fait qu il s agit de lymphocytes normaux qui ont subi un programme de prolifération lymphoblastoïde. Si on prend du sang de n importe qui et qu on met les lymphocytes en culture, on a émergence d une lignée lymphoblastoïde qui a aussi une latence 3. 3. Latence intermédiaire associée au carcinome nasopharyngé et à la maladie de Hodgkin Certains cliniciens ont constaté que la maladie de Hodgkin survenait dans certaines situations après une mononucléose infectieuse comme si au cours d une mononucléose infectieuse, le système immunitaire ne s était pas mis suffisamment en route pour bloquer le virus. En fait on s est aperçu que le carcinome nasopharyngé et la maladie de Hodgkin sont liés à une troisième forme de latence. C est-à-dire qu ils expriment de

manière intermédiaire EBNA1, LMP1, LMP2 A et B et les Eber. Il s agit de la latence 2. Une latence où il n y a pas d expression du tout est appelée latence 0. IV. Etude des lymphocytes de sujets sains 1. Outils Il faut des techniques très sensibles pour détecter la présence et l expression du virus qui est en latence et sans cesse réprimé par la réponse immunitaire : - L iodure de propidium, permet de quantifier la quantité d ADN cellulaire et donc de séparer les cellules en G0/G1 de celles en S/G2/M - Le Ki 67, détecte les cellules arrêtées en G0 et permet de séparer les cellules en G0 de celles en G1/S/G2/M - CD23, CD19, CD80, des marqueurs d activation des lymphoblastes, permettent de séparer les cellules en fonction de leur présence ou de leur absence. - Le MHC (Complexe Majeur d Histocompatibilité) classe I, permet de séparer les cellules avec un taux élevé de MHC 1 (>25%) de celles ayant un taux plus faible - Une PCR optimisée, pour détecter la présence de l épisome EBV dans les cellules infectées - Une RT-PCR pour analyser l expression des gènes viraux dans ces cellules 2. Rappel sur la maturation des lymphocytes B Quand un antigène entre en contact avec un LB (qui est CD19-20+, IgD+), il s en suit un contact entre ces LB et des CD4 qui conduit à l activation de es LB (marqueur d activation CD23/CD80). Ils vont alors fabriquer des anticorps (différenciation en plasmocytes avec marqueur CD138). Il va aussi y avoir la mise en place de LB mémoires qui sont CD27+, IgD-. Les LB mémoires gardent l information de rencontre avec l antigène et permettent d être protégé en cas de réinfection. 3. Etude des lymphocytes circulants Le marqueur CD19 est un marqueur des LB. Grâce à lui on peut séparer les LB des autres lymphocytes circulants, obtenus par un prélèvement de sérum. On va ensuite isoler au sein des LB les CD23-, c est-à-dire les LB qui ne sont pas activés. On utilise l iodure de propidium et on révèle le virus seulement dans les cellules G0/G1, donc celles qui sont en arrêt. Si on utilise le Ki 67 au lieu de l iodure de propidium, on retrouve le virus dans les cellules au repos, en G0. Si on fait une RT-PCR, on ne trouve quasiment pas d expression du virus. Ce dernier est particulièrement astucieux : il se met dans un état de latence dans une cellule qui ne se divise et n exprimer rein. C est un état d échappement. Nous sommes dans le cas d une latence 0. Quelques individus avaient trouvé dans ces cellules une expression EBNA1 qui est importante car EBNA1 est la protéine qui permet le couplage entre la réplication de l épisome viral et du génome cellulaire. On a dans ce cas une latence 1. Conclusion de cette première expérience, le virus persiste dans des cellules quiescentes CD19+, CD23-, CD80- (on oublie l expression de LMP2A qui se fait plus ou

moins). Le niveau d expression de CMH1 n a pas d importance, ce marqueur n a pas d intérêt. On continue l expérience en prenant toujours des LB CD19+ mais cette fois on isole les LB mémoires IgD-. On y trouve le virus. Ces LB ne se divisent pas ou seulement au cours d une réactivation (rare). Il n y a pas d expression du virus, nous sommes en latence 0. En fait l EBV induit la différenciation des LB activés en LB mémoires. L astuce de la latence de ce virus est que le virus se situe dans des cellules qui ne se divisent pas et qu il n exprime rien. On se pose alors la question suivante : d un côté on exprime le virus dans la salive de manière chronique et de l autre au niveau du site de latence préférentiel du virus il ne s exprime pas. Dans le sang périphérique de l immunocompétent (sauf quelques fois en cas de mononucléose infectieuse où on trouve de la latence 3) on ne trouve pas de cycle lytique du virus, on ne trouve que la latence 0. 4. Etude de cellules des amygdales On effectue la même expérience avec des cellules des amygdales. On regarde dans les cellules IgD+ qui sont des cellules activées et on va retrouver une latence 3. Au niveau local, il y a un virus qui s exprime et qui va être exprimé dans la salive. Reste le problème de la latence 2. Si on continue à regarder les cellules des amygdales, on isole les cellules IgD- et on trouve cette fois un programme de latence 2. Tout ce qu on trouve chez le sujet pathologique, on le retrouve chez le sujet normal, que ce soit la latence 1, la latence 2 ou la latence 3. V. Synthèse des résultats, programmes de latence de l EBV et implication dans les processus oncogènes 1. Synthèse des différentes latences de l EBV A partir du répertoire des gènes de l EBV (environ 200), on a un programme de réplication qui est appliqué dans les cellules productrices et on a un programme de persistance qui est exprimé dans les cellules non productrices. Le programme de persistance virale est composé de : - Le programme de latence 0 qui est un programme de latence qui a lieu au niveau des lymphocytes circulants. - Le programme de latence 1 avec EBNA seul qui a lieu au niveau des lymphocytes circulants - Le programme de latence 3 est un programme de prolifération cellulaire qui a lieu au niveau des amygdales. - Le programme de latence 2 qui est un programme de différenciation cellulaire qui est trouvé au niveau des amygdales.

2. Cycle viral et enchaînement des différentes latences Il s agit du schéma à retenir pour le prof. Il nous permet de comprendre le système. Premier contact avec l EBV : le virus infecte les LB naïfs soit directement, soit en passant à travers les cellules épithéliales. Il y a alors prolifération cellulaire avec une latence 3. La réponse immune (CTL) va ensuite pousser le virus dans ses retranchements. Le virus va dans les LB mémoires pendant que la prolifération cellulaire sera détruite. Il faudra alors attendre l initiation du programme de latence 2 pour pousser les LB à se différencier en LB mémoires. Les LB mémoires vont alors circuler librement en latence 0 ou en latence 1. Souvent, le virus se remet à proliférer mais la réponse immune est assez puissante pour le limiter à une excrétion locale dans la salive.

3. Etiologie des processus oncogènes Comme vu précédemment l infection du lymphoblaste par l EBV entraîne soit un programme de prolifération cellulaire (latence 3) qui est réprimé par la réponse immune, soit un programme de différenciation cellulaire par la latence 2 qui amène à une latence 1 (EBNA1 only) et une latence 0 (programme de latence). La maladie de Hodgkin est une prolifération cellulaire qui intervient au niveau de la différenciation cellulaire où les cellules sont en latence 2. Le lymphome Burkitt apparaît chez les enfants au niveau de cellules en latence 1, avec le programme EBNA-1 only. Le lymphome de l immunodéprimé apparaît car la réponse immunitaire ne peut pas réprimer la prolifération cellulaire entraînée par la latence 3.