Licence d Informatique Année 2001-2002 Option: Introduction à la biologie moléculaire "chercher une aiguille dans une meule de foin"? LA P.C.R. Polymerase Chain Reaction Chercher à repérer un gène particulier dans un génome entier, qui en contient jusqu'à des centaines de milliers, c'est un peu comme chercher une aiguille dans une meule de foin... La technique de PCR permet de réaliser cet exploit en multipliant spécifiquement le segment d'adn d'intérêt (aussi appelé ADN cible). Description de la PCR Objectif : amplifier in vitro une séquence choisie de l'adn en tirant parti du mode normal de synthèse de l'adn in vivo.
- Chaque brin de l'adn sert de matrice pour la synthèse du brin complémentaire - Si on répète le processus itérativement (réaction en chaîne +à chaque cycle, le nombre de molécules double), après 20 cycles on obtient 106fois le nombre d'exemplaires du fragment désiré (cad une quantité de l'ordre du microg.pour une quantité initiale de l'ordre du picog.!!). - In vitro : la synthèse de mol.adn se fait toujours à partir d'une amorce ("primer"). Cette amorce est une courte chaîne nucléotidique (oligonucléotide) nécessaire à l'accrochage de la polymérase. Donc le choix d'un couple d'amorces va déterminer les extrémités de la séquence synthétisée. - procédé révolutionnaire : permet d'obtenir, pour la première fois, sans clônage une amplification considérable d'un fragment donné d'adn. Gain en sensibilité et en temps. Répétition de cycles comprenant : - la dénaturation :tous les brins d'adn sont dissociés par la chaleur. - l'hybridation des amorces sur un fragment d'adn. - l'extension : synthèse des brins à partir des amorces hybridées Tout se fait dans un seul tube ; seule la température varie grâce à l'emploi de polymérase thermostable(taq pol.). - Attention au choix des amorces oligonucléotidiques,de la température, durée des étapes. - PCR amplifie toujours de l'adn génomique ou ADN clôné au préalable. - Pour amplifier un fragment à partir d'arn, +1étape avec la réverse transcriptase. Utilisations, très nombreuses. - analytiques : analyse qualitative de la présence, taille ou séquence de fragment d'arn ou ADN. Analyse quantitative plus difficile. *aide au clônage en s'affranchissant des limites imposées par les enzymes de restriction *alternative à l'emploi de banques génomique ou d'adnc. - technologiques *création de mutants grâce à l'utilisation d'oligonucléotides dégénérés
Licence d Informatique Année 2001-2002 Option: Introduction à la biologie moléculaire Définition Séquençage de l ADN Le séquençage de l ADN, est la détermination de la succession des nucléotides le composant, c est aujourd'hui une technique de routine pour les laboratoires de biologie. Cette technique utilise les connaissances qui ont été acquises depuis une trentaine d'années sur les mécanismes de la réplication de l'adn. Le séquençage Le séquençage Les techniques de séquençage utilisent des enzymes particulères : les ADN polymérases. Ces enzymes sont capables de synthétiser un brin complémentaire d'adn, à partir d'un brin matrice Ces réactions se font par ajout de désoxyribonucléotides (dntp : désoxynucléotide TriPhosphate). On utilise pour le séquençage des nucléotides légèrement différents : les didésoxyribonucléotides (ddntp). Les ddntp diffèrent des dntp par l'absence d'un groupement OH en position 3. En effet, lorsqu'une ADN polymérase utilise un ddntp au lieu d'un dntp, elle n'est plus capable de rajouter le moindre nucléotide à sa suite : la synthèse du brin d'adn s'arrète... deux types de nucléotides triphosphates
Le séquençage Le séquençage une ADN polymérase synthétise le brin complémentaire de l'adn à séquencer. Dans le milieu de réaction se trouvent des dntp en grand nombre, et une faible proportion d'un ddntp (à Adénine, ou Guanine, ou Thymine, ou Cytosine). A un moment totalement aléatoire, un ddntp sera ajouté à la chaîne en cours de synthèse par l'adn polymérase. Cette synthèse s'arrêtera donc à cet endroit. Par exemple, si le milieu réactionnel contient une faible proportion de didésoxyribonucléotide à Guanine (ddgtp), on obtiendra à la fin des réactions un ensemble de brins d'adn de tailles variés, selon l'endroit où un ddgtp se sera inséré et que la réaction aura ainsi été stoppée (ce qui correpond, du fait de la complémentarité des bases, à la présence d'une Cytosine dans le brin d'adn séquencé). On répète la même opération avec un milieu contenant du ddatp, un milieu contenant du ddctp, et un milieu contenant du ddttp. l'utilisation d'un ddntp permet d'obtenir un ensemble de fragments d'adn de différentes tailles, correspondant aux emplacement d'un nucléotide donné Lecture de la séquence Lecture de la séquence La plus vieille méthode, encore utilisée dans les séquençages "à la main" (voir au contraire l'automatisation ci-dessous) consiste en une migration de deux à quatre heures sur gel d'acrylamide. Il faut ensuite pouvoir "voir" les fragments d'adn. Pour cela, certains des nucléotides utilisés sont marqués, soit par ajout d'une molécule fluorescente (sur l'amorce utilisée), soit par utilisation de nucléotides marqués radioactivement. On "lit" donc la séquence soit en regardant la fluorescence, soit en exposant un film photographique au gel (après révélation, des bandes sombres apparaissent là où se trouvait de l'adn. Suivant la taille des gels la séquence lue est limitée de 200 à 750 nucléotides environ. Il faut que les bandes soient suffisamment espacées pour que leur ordre soit déterminable. An Introduction to Genetic Analysis
Point de départ Point de départ Une ADN polymérase n'est pas capable de débuter une synthèse d'un brin d'adn à partir de rien. Il lui faut partir d'un court fragment d'adn, appelé une amorce. Cette amorce est un oligonucléotide de 15 à 25 nucléotides, complémentaire d'une séquence d'adn connue, située juste en amont de l'adn à séquencer : 3 5 5 3 L ADN polymerase synthetise dans le sens 5 vers 3. Pouvez vous me donner l orientation des brins d ADN? L'automatisation du séquençage Exemple d enregistrement obtenu à partir d un séquenceur automatique La très grande majorité des séquences réalisées et publiées aujourd'hui sont réalisées sur des séquenceurs automatiques. Ceux-ci sont capables de réaliser les réactions de séquence, puis de les lire : Pour cela, on marque les fragments d'adn grâce à des marqueurs fluorescents. Une fois la réaction de séquence terminée, la taille des fragments obtenus est déterminée par une chromatographie. Le séquenceur détecte la fluorescence sortant des colonnes de chromatographie, repérant ainsi les fragments d'adn et leur taille précise. Les systèmes les plus modernes permettent même de lire les quatres nucléotides à partir d'une seule colonne de chromatographie. Le résultat est présenté par la machine sous forme de courbes présentant la fluorescence détectée, et l'interprétation qui en est faite en terme de nucléotides. An Introduction to Genetic Analysis
Les séquenceurs automatiques présentent de nombreux avantages : l'automatisation et l'utilisation d'une chromatographie au lieu d'une électrophorèse permet un gain de temps appréciable. Le coût de revient est bien moindre (une fois amorti l'investissement dû à l'achat de la machine). De plus, alors qu'on ne peut guêre espérer lire plus de 300 nucléotides de manière correcte lors d'un séquençage "à la main", les séquenceurs permettent de lire plusieurs centaines de nucléotides avec une très bonne qualité, jusqu'à 1000 pour les appareils les plus performants! La seule limitation à l'utilisation de séquenceurs automatiques reste leur coût d'achat élevé, qui impose, concrêtement, la mise en place de services communs de séquençage dans les instituts de recherche (projet génopôle). Références Griffiths, Anthony J.F., Miller, Jeffrey H., Suzuki, David, Lewontin, Richard C., Gelbart, William M., An introduction to genetic analysis, 7/e, 2000, W.H. Freeman. Chapitre 12 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.view..showsection&rid=i ga Lodish, Berk, Zipursky Matsudaira, Baltimore, Darnell, Molecular Cell Biology Chapitre 7 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.view..showtoc&rid=mc b.toc