Leucémie lymphoïde chronique biclonale ou biphénotypique? Une réponse par le traitement

Ann Biol Clin 2011 ; 69 (3) : 325-30 Leucémie lymphoïde chronique biclonale ou biphénotypique? Une réponse par le traitement doi:10.1684/abc.2011.0575 Biclonal or biphenotypic Chronic Lymphotic Leukemia? An answer brought by the treatment Céline Acker 1 Anne Staal 1 Cédric Aumont 1 Jacqueline Didion 1 Véronique Dorvaux 3 Yves Rio 1 Véronique Latger-Cannard 1,2 1 Laboratoire d hématologie, Hôpital de Metz, CHR Metz-Thionville <celine.acker@wanadoo.fr> 2 Service d hématologie biologique, Hôpital de Brabois, CHU Nancy 3 Service d hématologie, Hôpital de Metz, CHR Metz-Thionville Article reçu le 14 septembre 2010, accepté le 26 novembre 2010 Résumé. Une leucémie lymphoïde chronique (LLC) non monotypique est découverte chez un patient de 51 ans présentant une polyadénopathie : les lymphocytes B CD5+, CD23+, CD22-, CD79b faible, FMC7- expriment des chaînes légères (71 %) et (21 %), sans coexpression. Le caryotype montre parallèlement deux clones non apparentés, dont l un est en évolution. L analyse de la clonalité lymphoïde par PCR (polymerase chain reaction) des gènes des chaînes lourdes et des chaînes légères des immunoglobulines met en évidence deux réarrangements monoclonaux pour chaque type de chaîne. L absence de tri cellulaire lymphoïde en fonction de l expression des chaînes légères ne permet pas de différencier une LLC biclonale d une LLC monoclonale biallélique. L apparition de nouvelles adénopathies chez ce patient, un an et demi après la fin de sa chimiothérapie, amène à la réalisation d un nouvel immunophénotypage : la LLC est monotypique avec expression de chaînes légères à95%. Le caryotype réalisé alors, met en évidence un seul clone : il s agit du clone évolutif vu au diagnostic, qui présente des remaniements supplémentaires. La perte de la chaîne légère à l immunophénotypage et la disparition d un clone au caryotype nous permettent d affirmer la biclonalité de la LLC primitive, les deux clones ayant évolué différemment sous traitement. En conclusion, le patient présentait une LLC biclonale avec un clone sensible au traitement et l autre résistant. Mots clés : LLC, biclonal, biphénotypique, immunophénotypage, caryotype Abstract. A 51-years-old patient with polyadenopathies presents a non monotypic chronic lymphocytic leukemia (CLL): lymphocytes B CD5+, CD23+, CD22-,CD79b dim, FMC7- express (71%) and (21%) light chains withoutcoexpression. The caryotype shows two clones with one in evolution. Lymphoid clonality analysis by PCR (polymerase chain reaction) of the heavy and light chains genes of immunoglobulins shows two monoclonal rearrangements for each kind of chains. Lack of lymphoid cells sorting in function of the light chain doesn t allow us to conclude between a biclonal CLL and a biallelic monoclonal CLL. New adenopathies appearance in this patient, one year and a half after the end of his chemotherapy, leads to realisation of a new immunophenotyping: CLL is now monotypic with light chains expressed at 95%. In the new caryotype, only one clone is still present: it is the clone in evolution in the first caryotype and which presents additional abnormalities. This evolution allows us to assert the biclonality of the primitive CLL, the two clones evolving differently under treatment. In conclusion, the patient presented a biclonal CLL with one clone responding to treatment and the other one resistant. Key words: CLL, biclonal, biphenotypic, immunophenotyping, caryotype Pour citer cet article : Acker C, Staal A, Aumont C, Didion J, Dorvaux V, Rio Y, Latger-Cannard V. LLC biclonale ou biphénotypique? Une réponse par le traitement. Ann Biol Clin 2011 ; 69(3) : 325-30 doi:10.1684/abc.2011.0575 325

L observation Monsieur S, âgé de 51 ans, consulte dans le service d hépatogastrologie pour une gêne gastrique. L examen clinique révèle des adénopathies cervicales et une volumineuse adénopathie sous-mastoïdienne gauche. Le scanner thoraco-abdomino-pelvien montre la présence de multiples adénopathies (médiastinales, abdominales, cervicales et sous-diaphragmatiques), un foie hétérogène et l absence de splénomégalie. L analyse histologique de l apposition des ganglions cervicaux et de la biopsie à l aiguille du ganglion sous-mastoïdien est en faveur d un lymphome malin non hodgkinien B, à petites cellules, lymphocytique. L exploration médullaire montre une moelle riche envahie par 49 % de lymphocytes matures. Le patient est adressé en consultation spécialisée d hématologie au CHR de Metz pour prise en charge de ce syndrome lymphoprolifératif. L hémogramme montre une hyperleucocytose à 21 G/L avec 69 % de lymphocytes, sans anémie ni thrombopénie. L observation du frottis sanguin coloré au May-Grünwald-Giemsa (MGG) met en évidence la présence de lymphocytes matures, de petite taille et homogènes, associés à de nombreuses ombres de Gümprecht (figure 1). L immunophénotypage des lymphocytes sanguins révèle une population lymphocytaire B augmentée à 82 %, CD5+, CD23+, CD22-, CD79b faible, FMC7- mais non monotypique (expression de chaînes légères à71%et à 21 %) (figure 2A). Une seconde analyse, effectuée à partir d un nouvel échantillon sanguin un mois plus tard, retrouve cette double expression des chaînes légères pour cette population lymphoïde exprimant par ailleurs des marqueurs lymphoïdes atypiques en faveur d un syndrome lymphoprolifératif. La coexpression CD5+/23+ avec expression faible ou négative des autres marqueurs du score de Matutes (CD22, FMC7, CD79b), associé à l aspect cytologique, sont en faveur d une leucémie lymphoïde chronique (LLC). Ces résultats nous orientent vers deux hypothèses : une LLC biclonale (chaque clone exprimant un type de chaîne légère) ou une LLC monoclonale biallélique c est-à-dire biphénotypique (un seul clone exprimant deux types de chaînes légères). L absence de coexpression des chaînes légères et est plutôt en faveur d une LLC biclonale mais nous poursuivons cette démarche par l analyse génétique. Le caryotype sur sang réalisé, après mise en culture 72 heures dans du RPMI en présence d AMPLI B DSP30 et d interleukine 2, met en évidence une population 46, XY majoritaire (19 mitoses) et deux clones remaniés non apparentés de même taille (5 et 6 mitoses). Un des clones est porteur d une translocation déséquilibrée impliquant les chromosomes 2, 14 et 19. Le deuxième clone présente une délétion 11q et un chromosome 13 dérivé en anomalies principales et évolue avec des sous-clones comportant des Figure 1. Frottis sanguin coloré au MGG réalisé en octobre 2007 montrant des lymphocytes matures, de petite taille et homogènes associés à des ombres de Gümprecht. anomalies supplémentaires. Ce caryotype est d emblée considéré de pronostic défavorable de par la présence de translocations et de la délétion 11q (tableau 1). L analyse de la clonalité lymphoïde par PCR des gènes des chaînes lourdes et des chaînes légères des immunoglobulines met en évidence deux réarrangements monoclonaux pour chaque type de chaîne. L impossibilité de réaliser un tri cellulaire lymphoïde en fonction de l expression des chaînes légères ne permet pas de différencier une LLC biclonale (présence d un réarrangement des gènes pour chaque clone) d une LLC monoclonale biallélique (présence d un réarrangement de chaque allèle par perte du phénomène d exclusion allélique). Cependant, la présence des deux clones non apparentés au caryotype, ainsi que l absence de coexpression des chaînes légères à l immunophénotypage sont des arguments en faveur d une LLC biclonale. Par ailleurs, l étude du statut mutationnel des immunoglobulines a été réalisée et retrouve un profil non muté, à caractère péjoratif. Le patient est inclus dans le protocole CLL 2007 FMP pour traitement de sa LLC stade B, associant 6 cures de 326 Ann Biol Clin, vol. 69, n 3, mai-juin 2011

LLC biclonale ou biphénotypique? A CD19 PerCP-Cy5.5 B CD5 APC CD19 PerCP-Cy5.5 CD5 APC Figure 2. A) Immmunophénotypage des lymphocytes sanguins réalisé en octobre 2007 montrant une expression de chaînes légères (71 %) et (21 %) par les lymphocytes CD19+, sans coexpression. B) Immmunophénotypage des lymphocytes sanguins réalisé en mars 2010 montrant une expression de chaînes légères (95 %) par les lymphocytes CD5+. Ann Biol Clin, vol. 69, n 3, mai-juin 2011 327

Tableau 1. Tableau montrant les résultats des caryotypes réalisés en octobre 2007 (deux populations anormales) et en mars 2010 (une population anormale). Octobre 2007 Laboratoire de génétique Metz 46, XY, t(2;14;19) [5] 46, XY, del(11q), der(13) [4] 46, XY, del(11q), der(13), t(9;19) [1] 46, XY, del(11q), der(13), der(7) [1] 46, XY [19] Mars 2010 Laboratoire de génétique Metz absence 46, XY, del(11q),der(13),t(9;19),del(6q) [6] 47, XY, del(11q),der(13),t(9;19),del(6q),+14 [21] 46, XY, del(11q),der(6), der(7),der(12) [2] 46, XY [1] disparition du clone clone toujours en évolution mitoses normales chimiothérapie incluant fludarabine, cyclophosphamide et alemtuzumab. L évolution clinique est favorable et le bilan de fin de traitement réalisé en septembre 2008 permet de conclure à une LLC en rémission. Un an et demi après, le patient présente une asthénie et la réapparition d adénopathies en évolution depuis trois mois. Des adénopathies cervicales et inguinales centimétriques et des adénopathies axillaires de quelques millimètres sont cliniquement retrouvées. L hémogramme montre une hyperleucocytose à 20 G/L avec 65 % de lymphocytes d aspect matures. Le myélogramme montre une moelle riche envahie par 43 % de lymphocytes matures (figure 3). L immunophénotypage sanguin met en évidence une population lymphocytaire B augmentée (75 %) CD5+, CD23+, FMC7-, CD22-, CD79b+ fort, monotypique (figure 2B). Ces résultats sont en faveur d une réévolution de la LLC avec réémergence d un seul clone de phénotype lymphoïde B monoclonal. Le caryotype montre la disparition du clone porteur de la translocation t (2 ;14 ;19) et persistance du clone évolutif avec le chromosome 11 délété (tableau 1). Le suivi du patient nous permet donc de conclure à une LLC primitive biclonale avec une réponse initiale favorable, suivie de la rechute du clone le plus instable sur le plan caryotypique. Le point de vue du biologiste et phénotypiques peuvent être acquises en plus pendant l évolution de la maladie. C est pourquoi la présence de deux populations différentes de lymphocytes tumoraux chez le même patient est généralement interprétée comme le reflet de différents stades de maturation ou de la formation d un sous-clone à partir du clone primitif. Mais, bien que la plupart des désordres lymphoprolifératifs soient Les syndromes lymphoprolifératifs B correspondent à une prolifération et à une accumulation de lymphocytes B aberrants à un stade donné de différenciation. L hypothèse physiopathologique retenue est qu ils résultent de l expansion monoclonale d un seul lymphocyte B transformé. Les lymphocytes, durant leur maturation, subissent des modifications de leurs gènes des chaînes lourdes et légères des immunoglobulines (réarrangements et exclusion allélique) permettant l expression d un seul type d immunoglobuline. Les lymphocytes B tumoraux constituent donc un clone dans lequel toutes les cellules possèdent la même mutation originale et expriment les mêmes chaînes lourdes et légères, même si d autres caractéristiques génétiques Figure 3. Myélogramme coloré au MGG réalisé en mars 2010 montrant une moelle riche envahie par 43 % de lymphocytes matures. 328 Ann Biol Clin, vol. 69, n 3, mai-juin 2011

LLC biclonale ou biphénotypique? monoclonaux, une biclonalité des lymphocytes tumoraux a été quelquefois décrite dans la littérature, correspondant souvent à la coexistence de deux LNH (lymphomes non hodgkiniens). A notre connaissance, des cas de LLC, comme celui de Monsieur S, exprimant à la fois des chaînes légères et ont été peu rapportés dans la littérature. Ces LLC atypiques peuvent résulter soit d un seul clone qui, par perte du phénomène d exclusion allélique, exprime les deux types de chaînes légères [1, 2], soit de deux clones, dont chacun exprime un type de chaîne légère comme il a été décrit par Hsi [3] et par Chang [4]. Gonzales-Campos et al. ont, quant à eux, décrit un cas de LLC biclonale avec la même chaîne légère mais à des niveaux d expression différents [5]. L incidence des LLC biclonales est probablement sousestimée. Sanchez [6] a étudié l incidence des syndromes lymphoprolifératifs ayant plus d un clone dans une série de 477 patients consécutifs présentant un syndrome lymphoprolifératif. Pour 53 cas, la présence de deux clones ou plus a été suspectée par l immunophénotypage (25 % de ces 53 cas exprimaient deux types de chaînes légères). L exploration par biologie moléculaire a permis de confirmer la présence de deux clones ou plus pour 44 cas. Cette étude montre ainsi que l incidence des syndromes lymphoprolifératifs ayant deux clones ou plus est relativement importante (4,8 %) [6]. Ces résultats sont étonnants car les cas décrits dans la littérature sont plutôt rares. La biclonalité des trois cas décrits dans la littérature [3, 4] est similaire à notre observation (LLC exprimant deux types de chaînes légères à l immunophénotypage) et a été confirmée par biologie moléculaire associant PCR et Southern blot [7]. Pour le premier cas, Hsi a réalisé un Southern blot des lymphocytes triés par cytométrie en flux en fonction de leur chaîne légère ou. Après digestion par des enzymes de restriction, l ADN, clivé en fragments de taille différente, a été séparé sur gel d agarose. Les sondes d hybridation utilisées pour marquer les réarrangements des gènes des chaînes lourdes ont montré des réarrangements différents entre les lymphocytes exprimant les chaînes légères et ceux exprimant les chaînes légères, permettant de conclure à la présence de deux clones. Pour le deuxième cas, Hsi et al. ont effectué un Southern blot sur le mélange lymphocytaire : celui-ci a révélé la présence de 4 réarrangements différents pour les gènes des chaînes lourdes et donc la présence d au moins deux clones. Cette hypothèse a été confirmée par l analyse par PCR des réarrangements des gènes des chaînes lourdes sur lymphocytes triés qui montrait la présence de réarrangements différents entre les deux populations et donc la présence de deux clones [3]. Enfin, Chang et al. ont également réalisé une analyse par PCR des réarrangements des gènes codant pour les chaînes lourdes des immunoglobulines qui a montré la présence de réarrangements différents entre les deux populations. La présence de deux clones différents a été d autre part confirmée par le séquençage des réarrangements des gènes des chaînes lourdes qui a montré des différences dans les séquences [4]. Pour notre cas, la réalisation d un tri par cytométrie en flux aurait offert la possibilité de séparer les cellules en fonction de chaque type de chaîne légère, confirmant la présence des deux clones. Cet équipement technique n était malheureusement pas à notre disposition. Cependant, les différents arguments de cette observation (immunophénotypage et caryotype), associés à l évolution, nous ont orientés vers l hypothèse d une biclonalité. En effet, le suivi du patient post-thérapeutique (chimiothérapie), montrant la persistance phénotypique et moléculaire d un clone associée à la disparition de l autre clone, est en faveur d une LLC biclonale. Une LLC monoclonale aurait en effet montré une évolution similaire du clone sous traitement et donc une évolution similaire de l expression des chaînes légères. La réalisation d un nouveau caryotype a confirmé cette hypothèse puisqu il ne montrait plus que la présence d un seul des deux clones mis en évidence au premier caryotype en octobre 2007. Le clone présentant la translocation t(2;14;19) a disparu et le clone en évolution au premier caryotype présentait des anomalies supplémentaires (délétion 6q, trisomie 14, chromosomes 6 et 12 dérivés). En conclusion, différents arguments (cytométrie, caryotype) nous ont permis de nous orienter vers une LLC biclonale. La confirmation moléculaire n a pas permis d étayer notre hypothèse, contrairement aux cas publiés dans la littérature, mais le suivi à long terme du patient et l observation de l évolution de la LLC après traitement, par l immunophénotypage et par le caryotype, permettent de conclure à la biclonalité de la LLC primitive (tableau 2). Le point de vue du clinicien Les LLC biclonales ont une présentation clinique similaire aux LLC monoclonales. La clinique ne présente pas de spécificité. Cependant, Sanchez et al. ont montré que les cas de LLC avec plus d un clone présentaient plus souvent une splénomégalie [6]. Dans notre cas clinique, le patient ne présentait pourtant pas de splénomégalie mais une hépatomégalie, ce qui est peu fréquent dans les LLC (5-10 % des cas) [8]. Pour le traitement des LLC, différentes molécules ont été développées et sont utilisées : ces dernières années ont vu l apparition des anticorps monoclonaux [9]. Cependant, aucun schéma thérapeutique n est recommandé à ce jour pour les présentations biclonales. Le patient a été inclus dans le protocole CLL 2007 FMP après randomisation, plus précisément dans le bras consistant en une association de fludarabine, cyclophosphamide et alemtuzumab (anticorps monoclonal anti-cd52), l autre bras du protocole consistant en une association Ann Biol Clin, vol. 69, n 3, mai-juin 2011 329

Tableau 2. Tableau récapitulatif des résultats observés dans le cas d une LLC biclonale et d une LLC biallélique (ou biphénotypique) : les résultats soulignés sont ceux obtenus chez le patient et qui permettent d orienter le diagnostic vers une LLC biclonale. Immunophénotypage Caryotype Biclonale Pas de coexpression des chaînes légères κ/λ 2 clones Biphénotypique Coexpression des chaînes légères κ/λ 1 clone PCR des gènes des - chaînes lourdes d Ig - chaînes légères d Ig Evolution après traitement Ig = immunoglobuline 2 réarrangements ou plus 2 réarrangements ou plus Évolution variable des 2 clones (donc de κ/λ) de fludarabine, cyclophosphamide et rituximab (anticorps monoclonal anti-cd20). Ce protocole a été arrêté précocement en raison de la toxicité infectieuse majeure de l alemtuzumab. Un an et demi après la fin des six cures de chimiothérapie, le patient a présenté une rechute de sa LLC mais avec cette fois-ci une monotypie des chaînes légères, reflétant la persistance d un seul des deux clones. Le clone exprimant les chaînes légères a été sensible au traitement, ce clone correspond à celui qui exprimait le moins d anomalies caryotypiques. L âge du patient lui permet d être intégré dans un protocole d allogreffe mais l absence de fratrie doit amener à rechercher un donneur non apparenté. En attendant, deux cures d un traitement associant rituximab-bendamustine (agent alkylant) a été instauré mais s est conclu par un échec. Actuellement, le patient est inclus dans un nouveau protocole de traitement incluant dexaméthasone, cytarabine et cisplatine (DHAP) et présente une réponse clinique après une cure. Il sera intéressant de voir, à l immunophénotypage et au caryotype, l évolution du clone persistant sous cette nouvelle chimiothérapie et s il va disparaître à son tour. Les LLC biclonales sont peu décrites, leur pronostic est encore mal connu. Sanchez a mis en évidence un taux de survie similaire aux patients ayant une LLC monoclonale et à ceux ayant au moins deux clones. Cependant, parmi les LLC avec deux clones ou plus, un plus grand nombre de cas a nécessité un traitement plus précoce, du fait d une évolution plus rapide, conférant à cette présentation un plus mauvais pronostic [6]. Conclusion Une LLC, qu elle soit monoclonale ou biclonale, est prise en charge de la même manière. Si un traitement est instauré, il est le même quelque soit le type de LLC. Enfin, les facteurs pronostiques décrits à ce jour sont les mêmes : facteurs 1 ou 2 réarrangements 2 réarrangements Évolution similaire du clone (donc de κ/λ) cytogénétiques (délétions, translocations...) et moléculaires (profil mutationnel des gènes des chaînes lourdes des immunoglobulines). Remerciements. Nous remercions le docteur F. Davi et le laboratoire d hématologie moléculaire de la Pitié- Salpêtrière qui ont réalisé l étude de la clonalité lymphoïde. Conflits d intérêts : aucun. Références 1. Rassenti LZ, Kipps TJ. Lack of allelic exclusion in B cell chronic lymphocytic leukemia. J Exp Med 1997;8:1435-45. 2. Xu D. Dual surface immunoglobulin light-chain expression in B-cell lymphoproliferative disorders. Arch Pathol Lab Med 2006 ; 130 : 853-6. 3. Hsi ED, Hoeltge G, Tubbs RR. Biclonal chronic lymphocytic leukemia. Am J ClinPathol 2000 ; 113 : 798-804. 4. Chang H, Cerny J. Molecular characterization of chronic lymphocytic leukemia with two distinct cell populations. Am J Clin Pathol 2006 ; 126 : 23-8. 5. Gonzales-Campos J, Rios-Herranz E, De Blas-Orlando JM, Martin- Noya A, Parody-Ruiz-Berdejo R, Rodriguez-Fernandez JM. Chronic lymphocytic leukemia with two cellular populations : a biphenotypic or biclonal disease. Ann Hematol 1997 ; 74 : 243-6. 6. Sanchez ML, Almeida J, Gonzalez D, Gonzalez M, Garcia-Marcos MA, Balanzategui A, et al. Incidence and clinicobiologic characteristics of leukemic B-cell chronic lymphoproliferative disorders with more than one B-cell clone. Blood 2003 ; 102 : 2994-3002. 7. Cikota BM, Tukic LJ, Tarabar OT, Stamatovic DT, Elez MN, Magic ZM. PCR-based clonality assessment in patients with lymphocytic leukaemias : a single-institution experience. J Genet 2009;88: 309-14. 8. Troussard X. Diagnostic, pronostic et traitement chez les patients avec une leucémie lymphoïde chronique. Immunoanal Biol Spec 2007 ; 22 : 313-8. 9. Aurran-Schleinitz T, Arnoulet C, Ivanov V, Coso D, Rey J, Schiano JM, et al. Prise en charge actuelle de la leucémie lymphoïde chronique. Rev Med Int 2008 ; 29 : 424-35. 330 Ann Biol Clin, vol. 69, n 3, mai-juin 2011