PLATELIA Aspergillus Ag 1 plaque

PLATELIA Aspergillus Ag 1 plaque - 96 62794 Platelia Aspergillus Ag est un test immuno-enzymatique de type sandwich sur microplaque pour la détection de l antigène galactomannane d Aspergillus dans des échantillons de sérum et de liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA) 881115-2013/10

Table des matières 1- BUT... 3 2- INDICATIONS D UTILISATION... 3 3- INTERET CLINIQUE... 3 4- PRINCIPE DE LA PROCEDURE... 3 5- REACTIFS... 4 6- CONSIGNES D HYGIENE ET DE SECURITE... 5 7- PRECAUTIONS D UTILISATION... 6 8- PREPARATION ET CONSERVATION DES REACTIFS... 6 9- ECHANTILLONS... 7 10- PROCEDURE... 8 11- CONTROLE DE QUALITE (CRITERES DE VALIDITE)... 10 12- INTERPRETATION DES RESULTATS... 11 13- LIMITES D UTILISATION... 12 14- VALEURS ATTENDUES... 14 15- PERFORMANCES... 18 16- REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES... 26 2

1- BUT Platelia Aspergillus Ag est un test immuno-enzymatique de type sandwich sur microplaque pour la détection de l antigène galactomannane d Aspergillus dans les échantillons de sérum d adultes et d enfants et dans les liquides de lavage broncho-alvéolaire (LBA). Platelia Aspergillus Ag est un test qui, utilisé en association avec d autres techniques de diagnostic telles qu une culture microbiologique, un examen histologique de biopsie et un examen radiographique, peut être utilisé comme une aide pour le diagnostic de l aspergillose invasive. 2- INDICATIONS D UTILISATION Platelia Aspergillus Ag est un test immuno-enzymatique de type sandwich sur microplaque pour la détection de l antigène galactomannane d Aspergillus dans les échantillons de sérum d adultes et d enfants et dans les liquides de lavage broncho-alvéolaire (LBA). Platelia Aspergillus Ag est un test qui, utilisé en association avec d autres techniques de diagnostic telles qu une culture microbiologique, un examen histologique de biopsie et un examen radiographique, peut être utilisé comme une aide pour le diagnostic de l aspergillose invasive. 3- INTERET CLINIQUE Les infections aspergillaires débutent habituellement dans le poumon suite à l inhalation de spores d Aspergillus présents dans l environnement. Les formes invasives, de plus en plus fréquentes depuis ces 10 dernières années, représentent les infections les plus graves. Elles surviennent principalement chez les patients neutropéniques (après un traitement anti-cancéreux), chez les patients traités par immunosuppresseurs (transplantations d organe et en particulier greffe de moelle osseuse) et chez les patients sous corticostéroïdes 10. Aspergillus est rarement isolé à partir d hémocultures. Le diagnostic repose le plus souvent sur des critères non spécifiques comme les symptômes cliniques ou le diagnostic radiologique( CT scan, radiographie du thorax, etc.). Le test de détection de l antigène soluble galactomannane dans le sérum représente une méthode sérologique capable de faciliter le diagnostic d aspergillose invasive 9, 12, 23, 54, 62. De plus, pour les patients receveurs d une transplantation d organe solide, la détection de l antigène galactomannane dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA) s est avérée avantageuse pour le diagnostic d aspergillose invasive 8,17,18. 4- PRINCIPE DE LA PROCEDURE 45 Le test Platelia Aspergillus Ag est une technique immuno-enzymatique de type sandwich, en une étape, sur microplaque permettant la détection de l antigène galactomannane dans le sérum et le liquide de LBA humains. Les anticorps monoclonaux de rat EBA-2, dirigés contre le galactomannane d Aspergillus, caractérisés au cours d études antérieures 25, 46 sont utilisés,(1) pour sensibiliser les puits de la microplaque et se lier à l antigène, et (2) pour détecter l antigène fixé à la microplaque sensibilisée (conjugué: anticorps monoclonaux marqués à la peroxydase). Les échantillons de sérum ou de liquide de LBA sont traités à la chaleur en présence d EDTA afin de dissocier les complexes immuns et de précipiter les protéines susceptibles d interférer avec le test 24. Les échantillons traités et le conjugué sont ajoutés dans les puits sensibilisés avec les anticorps monoclonaux puis incubés. Un complexe anticorps monoclonal - galactomannane - anticorps monoclonal / peroxydase se forme en présence de l antigène galactomannane. Les barrettes sont lavées pour éliminer tout matériel non lié. La solution de TMB chromogène est ensuite ajoutée ; elle réagit avec les complexes liés au puits en formant une réaction de couleur bleue. La réaction enzymatique est arrêtée par ajout d acide, ce qui fait passer la couleur du bleu au jaune. L absorbance (densité optique) des échantillons et des contrôles est déterminée par un spectrophotomètre réglé à une longueur d ondes de 450 et 620/630 nm. 3

5- REACTIFS Platelia Aspergillus Ag : code produit n 62794 (96 tests) Conserver le kit entre 2 et 8 C. Porter tous les réactifs à température ambiante (18-25 C) au moins 30 minutes avant utilisation. Replacer tous les réactifs à une température de 2-8 C immédiatement après utilisation. Replacer les barrettes/microplaques non utilisées dans le sachet et le refermer avec soin. Tous les réactifs, à l exception de la solution de lavage concentrée(r2) et de la solution d arrêt (R10), doivent être utilisés dans les 8 semaines suivant leur ouverture. Après ouverture, la solution de lavage concentrée (R2) et la solution d arrêt (R10) sont stables jusqu à la date de péremption. Les réactifs sont fournis en quantités suffisantes pour réaliser 96 tests en un maximum de 9 séries. R1 R2 R3 R4 R5 Composant Contenu Quantité Microwell Strip Plate Concentrated Washing Solution (20X) Negative Control Serum Cut-off Control Serum Positive Control Serum Microplaque : - 96 puits (12 barrettes de 8 puits chacune) sensibilisés avec les anticorps monoclonaux anti-galactomannane - Onglets de barrettes marqués «85» Solution de lavage concentrée (20X) : - Tampon Tris NaCl (ph 7,4) - 2 % Tween 20 - Conservateur : ProClin 300 (0,04 %) Sérum de contrôle négatif : - Sérum humain négatif - Testé négatif pour les anticorps anti-vih-1, anti-vih-2, anti- VHC et pour l Ag HBs - Conservateur : ProClin 300 (0,3 %) Sérum de contrôle seuil : - Sérum humain contenant du galactomannane - Testé négatif pour les anticorps anti-vih-1, anti-vih-2, anti- VHC et pour l Ag HBs - Conservateur : ProClin 300 (0,3 %) Sérum de contrôle positif : - Sérum humain contenant du galactomannane - Testé négatif pour les anticorps anti-vih-1, anti-vih-2, anti- VHC et pour l Ag HBs - Conservateur : ProClin 300 (0,3 %) R6 Conjugate Conjugué (prêt à l emploi) : - Anticorps monoclonal anti-galactomannane marqué à la peroxydase - Conservateur : ProClin 300 (0,3 %) R7 Sample Treatment Solution R9 Chromogen: TMB Solution Solution de traitement des échantillons (prête à l emploi) : - Solution acide d EDTA Solution de TMB chromogène (prête à l emploi) : - 3,3,5,5 -tétraméthylbenzidine (<0,1 %) - H 2 O 2 (<1,0 %) 1 microplaque / 12 x 8 puits 1 x 70 ml 2 x 1,7 ml 2 x 1,7 ml 2 x 1,7 ml 1 x 8 ml 1 x 13 ml 1 x 28 ml R10 Stopping Solution Solution d arrêt (prête à l emploi) : - Solution d acide sulfurique 1 N (H 2 SO 4 ) 1 x 28 ml *Remarque : Le TMB (3,3,5,5 -tétraméthylbenzidine) est un chromogène de la peroxydase non carcinogène et non mutagène. 4

6- CONSIGNES D HYGIENE ET DE SECURITE 1. Pour diagnostic in vitro, uniquement. 2. Pour usage professionnel, uniquement. 3. L utilisation de ce test avec des échantillons autres que du sérum et des liquides de LBA humains n est pas recommandée. 4. Le contrôle positif, le contrôle seuil et le contrôle négatif sont préparés à partir de sérum humain qui a été testé négatif en antigène HBs ainsi qu en anticorps anti-vih-1, anti-vih-2 et anti-vhc avec des tests marqués CE. Cependant, tous les réactifs doivent être manipulés comme s ils étaient potentiellement infectieux. Tous les tests doivent être pratiqués conformément à la norme OSHA relative aux agents pathogènes transmis par voie hématogène, niveau 2 de biosécurité, ou conformément à d autres pratiques de biosécurité adaptées. 5. Porter des vêtements de protection, notamment une blouse de laboratoire, un dispositif de protection des yeux et du visage ainsi que des gants jetables (des gants synthétiques sans latex sont recommandés) et manipuler les réactifs du kit ainsi que les échantillons de patients conformément aux Bonnes Pratiques de Laboratoire requises. Se laver soigneusement les mains après avoir réalisé le test. 6. Ne pas pipeter à la bouche. 7. Ne pas fumer, boire ni manger dans les zones où des échantillons ou des réactifs du kit sont manipulés. 8. Éviter les éclaboussures d échantillons ou de solutions. 9. Les surfaces souillées par un liquide contaminant ne contenant pas d acide, doivent être soigneusement nettoyées avec un désinfectant efficace. Les désinfectants pouvant être utilisés incluent (mais ne sont pas limités à) une solution d eau de Javel à 10 % (solution d hypochlorite de sodium à 0,5 %), d éthanol à 70 % ou de Wescodyne Plus à 0,5 %. Le matériel utilisé pour le nettoyage devra être éliminé dans un container spécial pour déchets contaminés. ATTENTION : Ne pas placer de solutions contenant de l eau de Javel dans un autoclave. 10. Les surfaces souillées par un liquide contaminant contenant de l acide doivent être essuyées (avec absorption préalable du liquide) ou neutralisées avec du bicarbonate de sodium et la zone souillée doit être rincée et séchée ; dans le cas où le liquide contaminant contiendrait des matières présentant un danger biologique, nettoyer la zone avec l un des désinfectants chimiques. 11. Éliminer l ensemble des échantillons et du matériel utilisé pour réaliser le test comme s ils étaient potentiellement infectieux. L élimination des déchets chimiques et biologiques dangereux doit s effectuer conformément aux exigences en vigueur. 12. Pour connaître les recommandations liées aux risques et les précautions relatives à certains produits chimiques contenus dans ce kit, consulter le(s) pictogramme(s) figurant sur les étiquettes et les informations fournies à la fin des instructions d utilisation. La fiche technique de sécurité est disponible sur www.bio-rad.com. 5

7- PRECAUTIONS D UTILISATION 1. LES ÉCHANTILLONS DE SÉRUM OU DE LIQUIDE DE LBA CONGELÉS ET CONSERVÉS DANS DES CONDITIONS INCONNUES PEUVENT DONNER DES RÉSULTATS FAUSSEMENT POSITIFS EN RAISON D UNE CONTAMINATION PAR DES CHAMPIGNONS ET/OU DES BACTÉRIES. 2. Ne pas utiliser le kit ni l un des réactifs du kit au-delà de la date de péremption indiquée. 3. Ne pas mélanger de réactifs provenant d autres kits portant des numéros de lot différents, à l exception de la solution de lavage (R2, identification* : 20x de couleur verte), du chromogène (R9, identification* : TMB de couleur turquoise) et de la solution d arrêt (R10, identification* : 1 N de couleur rouge), à condition que ces réactifs soient strictement équivalents et qu ils portent le même numéro de lot pour une série donnée de tests. *sur l étiquette du flacon REMARQUE : une solution de lavage (R2, identifiée* par la mention 20x en vert) ne peut être mélangée à une solution de lavage (R2 identifiée* par la mention 10X en bleu) fournie dans les kits de réactif Bio-Rad. *sur l étiquette du flacon 4. Porter tous les réactifs à température ambiante pendant au moins 30 minutes avant utilisation. 5. Mélanger soigneusement tous les réactifs avant utilisation. 6. Mélanger soigneusement la solution de lavage concentrée (R2) avant de préparer la solution de lavage diluée, en veillant à éviter toute contamination microbienne. 7. Ne pas réaliser le test en présence de vapeurs réactives (acides, alcalines, aldéhydes) ou de poussières qui pourraient altérer l activité enzymatique du conjugué. 8. Lors du pipetage manuel des contrôles et des échantillons, utiliser un nouveau cône de distribution pour chaque contrôle ou chaque échantillon de manière à éviter toute contamination. 9. Pour assurer un lavage adéquat des puits, respecter le nombre de cycles de lavage recommandé et s assurer que tous les puits soient entièrement remplis puis entièrement vidés. Le lavage ne doit pas être réalisé manuellement avec un flacon déformable («pissette»). 10. Ne pas laisser la microplaque sécher entre la fin du cycle de lavages et l ajout des réactifs. 11. Ne pas utiliser le même récipient pour le conjugué et la solution TMB chromogène. 12. Empêcher que le conjugué ou la solution de chromogènetmb n entrent en contact avec des métaux ou des ions métalliques. 13. Éviter l exposition de la solution chromogène TMB à toute lumière vive pendant la conservation ou l incubation. Ne pas laisser les solutions contenant le chromogène entrer en contact avec un agent oxydant. 14. Éviter tout contact de la solution d arrêt avec un quelconque agent oxydant. Empêcher que la solution d arrêt n entre en contact avec des métaux ou des ions métalliques. 15. Utiliser du matériel (tubes, cônes de distribution, récipients, etc.)propre et sans poussières pour minimiser le risque de contamination par des spores d Aspergillus présents dans l environnement. Le galactomannane étant thermostable, la stérilisation du matériel utilisé ne garantit pas l absence d antigène contaminant. L utilisation de matériel apyrogène est optimale, mais il est possible d utiliser du matériel standard à condition d appliquer des précautions adéquates. 16. Limiter toute exposition à l air des solutions (sérum, liquide de LBA, solution de traitement de l échantillon, conjugué) ou des récipients ouverts (microplaques, tubes, pipettes). 17. Ne pas reverser dans son flacon d origine, le surplus de conjugué non distribué. 18. La solution de chromogène TMB doit être incolore. Si cette solution est bleue, le réactif est contaminé et il ne doit pas être utilisé. 8- PREPARATION ET CONSERVATION DES REACTIFS Microplaque (R1) Chaque cadre contenant 12 barrettes est emballé dans un sachet. Ouvrir le sachet avec des ciseaux juste en dessous de la soudure. Ouvrir le sachet et en sortir le cadre. Replacer le cadre contenant les barrettes inutilisées dans le sachet d origine. Refermer le sachet soigneusement et conserver entre 2 et 8 C. 6

Après ouverture du sachet sous vide, les barrettes conservées entre 2 et 8 C dans leur sachet d origine soigneusement refermé sont stables pendant 8 semaines. Vérifier que le dessicant est toujours présent. Solution de lavage (R2) Préparer la solution de lavage diluée selon les besoins, en diluant 20 fois la solution de lavage concentrée (R2) dans de l eau désionisée ou distillée (une part de solution de lavage concentrée (R2) pour 19 parts d eau désionisée ou distillée). La solution de lavage ainsi diluée peut être conservée 14 jours à une température de 2-30 C. Préparer une quantité de solution de lavage diluée suffisante pour réaliser une série complète (80 ml pour une barrette : 4 ml de R2 + 76 ml d eau distillée). Après ouverture, la solution de lavage concentrée, conservée à +2-30 C, est stable jusqu à la date de péremption indiquée sur l étiquette en l absence de contamination. Sérum de contrôle négatif (R3), sérum de contrôle seuil (R4) et sérum de contrôle positif (R5) Les contrôles doivent être traités à la chaleur en présence de la solution de traitement des échantillons (R7) comme des échantillons de patient afin de servir de témoin de traitement. Après ouverture, ces réactifs sont stables pendant 8 semaines s ils sont conservés à +2-8 C en l absence de contamination. Conjugué (R6), Solution de traitement de l échantillon (R7), Solution de chromogène TMB (R9) Ces réactifs sont prêts à l emploi. Après ouverture, ces réactifs sont stables pendant 8 semaines s ils sont conservés à +2-8 C en l absence de contamination. Solution d arrêt (R10) Ce réactif est prêt à l emploi. Après ouverture, ce réactif est stable jusqu à la date de validité indiquée sur l étiquette s il est conservé à +2-8 C, en l absence de contamination. 9- ECHANTILLONS Ce test est réalisé sur du sérum ou du liquide de LBA. I. SERUM Prélever les échantillons de sang conformément aux procédures standards de laboratoire. Les échantillons de sérum ne doivent pas être contaminés par des spores de champignon ni par des bactéries. Transporter et conserver les échantillons dans des tubes scellés et à l abri de l air. Les échantillons non ouverts peuvent être conservés à +2-8 C pendant 5 jours avant réalisation du test. Après la première ouverture, les échantillons peuvent être conservés à + 2-8 C pendant 48 heures avant réalisation du test. Pour une conservation plus longue, congeler le sérum à -70 C. Les échantillons de sérum peuvent supporter au maximum 4 cycles de congélation / décongélation. Les échantillons préalablement congelés devront être soigneusement homogénéisés après décongélation avant réalisation du test. Les résultats ne sont pas affectés pour les échantillons contenant 20 mg/l de bilirubine, les échantillons lipémiques contenant l équivalent de 2 g/l de trioléine (triglycéride) ou les échantillons hémolysés contenant 500 mg/dl d hémoglobine. Les interférences liées à une surcharge en albumine n ont pas été testées. Ne pas décomplémenter le sérum. II. LIQUIDE DE LBA Prélever les échantillons de liquide de LBA conformément aux procédures standards de laboratoire. Les échantillons de liquide de LBA doivent être prélevés en solution saline stérile. Soit ils sont utilisés tels quels, soit ce sont les surnageants d échantillons centrifugés (à 10 000 tours/minute pendant 10 minutes) qui sont utilisés pour le traitement à la chaleur en présence de solution acide d EDTA, comme indiqué au chapitre 10. Les échantillons de liquide de LBA ne doivent pas être contaminés par des spores de champignon ni par des bactéries. Transporter et conserver les échantillons dans des tubes scellés et à l abri de l air. Après la première ouverture, les échantillons peuvent être conservés à +2-8 C pendant 24 heures au maximum. Pour une conservation plus longue, conserver les échantillons de liquide de LBA congelés (à-20 C ou à une température inférieure) pendant 5 mois au maximum. 7

Les échantillons de liquide de LBA peuvent supporter un maximum de 4 cycles de congélation / décongélation. Les échantillons précédemment congelés doivent être soigneusement homogénéisés après décongélation avant réalisation du test. 10- PROCEDURE Matériel fourni Voir la section REACTIFS. Matériel nécessaire mais non fourni 1. Eau distillée ou désionisée pour la dilution de la solution de lavage concentrée. 2. Papier absorbant. 3. Gants à usage unique. 4. Lunettes de protection. 5. Hypochlorite de sodium (eau de Javel) et bicarbonate de sodium. 6. Pipettes ou multipipettes réglables ou fixes pour mesurer et distribuer des volumes de 50 µl, 100 µl, 300 µl et 1 000 µl. 7. Tubes de microcentrifugation en polypropylène de 1,5 ml avec bouchons étanches à l air, capables de supporter une chaleur de 120 C (bloc chauffant) ou de 100 C (bain-marie bouillant). Bouchons à vis et tubes : tubes coniques de 1,5 ml, OU Tubes avec capuchon attenant : tubes EZ Micro Test, 1,5 ml, Cavaliers de vérouillage, ces cavaliers ferment hermétiquement les tubes avec capuchon attenant en empêchant l ouverture des bouchons lors des changements de température et de pression et permettent en outre de soulever facilement les tubes pour les extraire du bloc chauffant ou du bain-marie bouillant. 8. Centrifugeuse de paillasse pour tubes en polypropylène de 1,5 ml permettant une centrifugation à 10000 g (réf. Brinkman #22-36-280-1 ou réf. VWR Scientific #20901-051 ou équivalent). 9. Utilisation d un bloc chauffant pour le traitement du sérum/liquide de LBA: Bloc chauffant. Les modèles suivants sont recommandés : Modèle à un bloc : Réf. Grant # QBD-1 L - en dehors des États-Unis : réf. Grant# QBD1 distribué par VWR sous la référence# 460-0074) Modèle à deux blocs : Réf. Grant# QBD-2 L - en dehors des États-Unis : réf. Grant # QBD2 distribué par VWR sous la référence #460-0076) Bloc pour blocs chauffants : les deux blocs chauffants (QBD-1 L, QBD1 et QBD-2L, QBD2) doivent être utilisés avec le bloc Grant réf. #QB-E1 distribué en dehors des États-Unis par VWR sous la référence # 460-8517 Utilisation d un bain-marie bouillant pour le traitement du sérum/liquide de LBA: Portoir de microcentrifugation rond flottant pour bécher d 1 l (aux États-Unis : réf. VWR Scientific # 60986-100 ou réf. Nalgene # 5974-1015 ou équivalent). Bain-marie bouillant à 100 C. 10. Agitateur de type «vortex». 11. Incubateur de microplaques pouvant être thermostaté à 37 ± 1 C 12. Laveur de microplaques semi-automatique ou automatique. 13. Lecteur de microplaques équipé de filtres de 450 nm et de 620/630 nm. Commentaires sur la procédure Le contrôle négatif, le contrôle positif et le contrôle seuil doivent être testés lors de chaque série pour valider les résultats du test. 8

Traitement du sérum/liquide de LBA Tous les sérums de contrôle : négatif (R3), seuil (R4) et positif (R5) doivent être traités en même temps que les échantillons de sérum/liquide de LBA : 1. Distribuer 300 µl de chaque sérum à tester/liquide de LBA et de chaque contrôle dans un tube en polypropylène individuel de 1,5 ml. 2. Ajouter 100 µl de solution de traitement de l échantillon (R7) dans chaque tube. 3. Homogénéiser le contenu des tubes en agitant vigoureusement ou en vortexant. Fermer hermétiquement les tubes afin de prévenir leur ouverture pendant le chauffage. 4. Option bloc chauffant : Chauffer les tubes pendant 6 minutes dans un bloc chauffant à 120 C. Les tubes ne doivent être placés dans le bloc que lorsque la température prescrite est atteinte (*). OU Option bain-marie : En cas d utilisation d un bain-marie bouillant : chauffer les tubes pendant 3 minutes à 100 C (*). Les tubes ne doivent être placés dans le bain-marie que lorsque la température prescrite est atteinte. 5. Retirer soigneusement les tubes chauds du bloc chauffant ou du bain-marie bouillant et les placer dans une centrifugeuse. Centrifuger les tubes à 10 000 g pendant 10 minutes. On utilise le surnageant de centrifugation pour la détection de l antigène galactomannane. 6. Tester les surnageants selon la procédure suivante. Après traitement de l échantillon, le surnageant peut être prélevé et conservé à +2 et 8 C pendant 48 heures au maximum avant réalisation du test. Si l analyse des résultats indique qu il faut retester l échantillon, un autre aliquot de cet échantillon doit être traité pour réalisation du test. (*) Le strict respect des consignes de température et de durée ainsi que l utilisation du matériel recommandé sont essentiels à la réussite du test. Ne pas se fier à la température affichée par l appareil mais vérifier que la température est conforme aux spécifications en utilisant une sonde thermique qui sera introduite dans un tube contenant de l huile minérale : une température de 120 C doit être atteinte à l intérieur du tube dans un bloc chauffant et une température de 100 C doit être atteinte dans un bain-marie bouillant. Procédure EIA Respecter strictement le protocole indiqué. Respecter les bonnes pratiques de laboratoire. 1. Porter les réactifs à température ambiante (+18-25 C) pendant au moins 30 minutes avant utilisation. 2. Préparer la solution de lavage diluée. 3. Etablir le plan d identification des échantillons de sérum/liquide de LBA à tester et des contrôles dans la microplaque. Utiliser un puits pour le sérum de contrôle négatif (R3), deux puits pour le sérum de contrôle seuil (R4) et un puits pour le sérum de contrôle positif (R5). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R5 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R3 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 4. Retirer le support de microplaque et les barrettes (R1) du sachet. Remettre les barrettes non utilisées dans le sachet avec le dessicant et refermer le sachet. 9

5. Mélanger le contenu du flacon de conjugué (R6) par retournement du flacon avant utilisation. Ajouter 50 µl de conjugué (R6) dans chaque puits. Ajouter ensuite 50 µl du surnageant de sérum/lba traité dans chaque puits, comme indiqué ci-dessus. Ne pas ajouter les surnageants des échantillons de sérum/liquide de LBA dans les puits avant d ajouter le conjugué. 6. Couvrir la microplaque avec un film adhésif en appuyant bien sur toute la surface ou par un autre moyen pour empêcher l évaporation, en vérifiant que la totalité de la surface est recouverte afin d assurer l étanchéité vis-à-vis de l eau. 7. Incuber la microplaque dans un incubateur sec de microplaques pendant 90 ± 5 minutes at 37 C (± 1 C). 8. Retirer le film adhésif. Aspirer le contenu de chaque puits dans un container pour déchets (contenant de l hypochlorite de sodium). Laver la microplaque 5 fois avec un laveur de microplaques (en utilisant 800 µl de solution de lavage diluée). Après le dernier lavage, retourner la microplaque et la tapoter doucement sur du papier absorbant pour éliminer tout liquide restant. 9. Ajouter rapidement 200 µl de la solution chromogène de TMB (R9) dans chaque puits en évitant toute exposition à une lumière vive. 10. Incuber la microplaque à l obscurité à temperature ambiante (+18-25 C) pendant 30 ± 5 minutes. Ne pas utiliser de film adhésif au cours de cette incubation. 11. Ajouter 100 µl de solution d arrêt (R10) dans chaque puits en suivant le même ordre que pour l ajout de la solution chromogène de TMB. Bien mélanger. 12. Essuyer soigneusement le dessous de chaque plaque. 13. Lire la densité optique(do) de chaque puits à 450 nm (filtre de référence de 620/630 nm) dans les 30 minutes suivant l ajout de solution d arrêt. 11- CONTROLE DE QUALITE (CRITERES DE VALIDITE) Contrôle seuil : la DO de chaque sérum de contrôle seuil doit être 0,300 et 0,800. Contrôle positif : l index du sérum de contrôle positif doit être supérieur à 1,50. I = DO du contrôle positif (R5) > 1,50 DO moyenne du contrôle seuil Contrôle négatif : l index du sérum de contrôle négatif doit être inférieur à 0,40. I = DO du contrôle négatif (R3) < 0,40 DO moyenne du contrôle seuil Si l un des contrôles ne remplit pas les critères de validité décrits ci-dessus, le test est invalidé et les résultats obtenus pour l échantillon de patient ne doivent pas être pris en compte. L utilisateur peut décider de refaire le test après avoir passé en revue la procédure ou peut contacter le fabricant pour obtenir une assistance. Si le test est répété, un nouvel aliquot de ce même échantillon doit être utilisé. Exemple de calcul : Échantillon Absorbance (DO) Contrôle négatif (R3) 0,116 Contrôle seuil (R4) 0,513 0,533 Contrôle positif (R5) 1,834 Calculs Valeur moyenne de la DO du sérum de contrôle seuil (valeur seuil) Pour calculer la DO moyenne du contrôle seuil (R4), additionner les valeurs de DO des deux puits contenant le contrôle seuil et diviser le résultat par 2 : (0,513 + 0,533) 2 = 0,523 10

Index du contrôle négatif Pour calculer l index du contrôle négatif, diviser la DO du contrôle négatif par la valeur seuil : I = 0,116 = 0,22 0,523 Index du contrôle positif Pour calculer l index du contrôle positif, diviser la DO du contrôle positif par la valeur seuil : I = 1,834 = 3,51 0,523 Validation de l essai La DO de chaque contrôle seuil est 0,300 et 0,800, indiquant que le contrôle seuil est valide. L index du contrôle négatif est < 0,40, indiquant que le contrôle négatif est valide. L index du contrôle positif est > 1,50, indiquant que le contrôle positif est valide. Dans cet exemple, le test est validé car les résultats remplissent les critères de validité pour chaque contrôle. 12- INTERPRETATION DES RESULTATS La présence ou l absence de l antigène galactomannane dans l échantillon testé est déterminée par le calcul d un index pour chaque échantillon de patient. L index (I) est la DO de l échantillon divisée par la valeur seuil. Calcul de la valeur moyenne de la DO du contrôle seuil (valeur seuil) : Additionner les DO des deux puits contenant le sérum de contrôle seuil (R4) et diviser le résultat obtenu par 2. Calcul d un index (I) pour chaque échantillon testé : Calculer le ratio suivant pour chaque échantillon testé : I = DO de l échantillon Valeur seuil Interprétation des résultats des sérums/liquides de LBA ayant un index < 0,50 : Les sérums/liquides de LBA ayant un index < 0,50 sont considérés comme négatifs pour la présence de l antigène galactomannane. Remarque : l obtention d un résultat négatif peut indiquer que le résultat du patient est inférieur au seuil de détection du test. Les résultats négatifs n excluent pas un diagnostic d aspergillose invasive. Si une aspergillose invasive est suspectée mais que le résultat du test est négatif, il conviendra de répéter le test. Interprétation des résultats des sérums/liquides de LBA ayant un index 0,50 Les sérums/liquides de LBA ayant un index 0,50 sont considérés comme positifs pour la présence de l antigène galactomannane. Pour tous les patients positifs, il est recommandé de tester un nouvel aliquot du même échantillon (sérum/lba). Remarque : Une valeur de DO inférieure à 0,000 peut indiquer une erreur dans la procédure ou une erreur liée aux instruments, qu il conviendra d évaluer. Ce résultat est invalide et l échantillon doit être re-testé. Un dépistage régulier (deux fois par semaine) d échantillons de sérum de patients à haut risque est recommandé afin d accroître la sensibilité et la précocité de positivité du test. Remarque : Le test Platelia Aspergillus Ag est destiné à être utilisé comme une aide au diagnostic d aspergillose invasive. Les résultats positifs obtenus avec le test Platelia Aspergillus Ag doivent être interprétés en conjonction avec les résultats obtenus avec d autres procédures diagnostiques telles qu une culture microbiologique, un examen histologique de biopsie et une radiographie. 11

12 Exemple de calcul : Échantillon Absorbance (DO) Contrôle négatif (R3) 0,116 Contrôle seuil (R4) 0,513 0,533 Contrôle positif (R5) 1,834 Échantillon du patient # 1 0,134 Échantillon du patient # 2 0,436 Échantillon du patient # 3 1,196 Calculs Se reporter au chapitre contrôle de qualité (critères de validité) pour un exemple de calcul permettant de déterminer la validité des résultats obtenus avec les contrôles du test. Valeur moyenne de la DO du sérum de contrôle seuil (valeur seuil) Pour calculer la DO moyenne du contrôle seuil (R4), additionner les valeurs de DO des deux puits contenant le contrôle seuil et diviser le résultat par 2 : (0,513 + 0,533) 2 = 0,523 Échantillon du patient # 1 Pour calculer l index de l échantillon du patient n 1, diviser la DO de l échantillon du patient n 1 par la valeur seuil : I = 0,134 = 0,26 0,523 Dans cet exemple, l échantillon du patient n 1 est négatif car l index, égal à 0,26, est inférieur à 0,50. Échantillon du patient # 2 Pour calculer l index de l échantillon du patient # 2, diviser la DO de l échantillon du patient # 2 par la valeur seuil : I = 0,436 = 0,83 0,523 Dans cet exemple, l échantillon du patient # 2 est positif car l index, égal à 0,83, est 0,50. Échantillon du patient # 3 Pour calculer l index de l échantillon du patient # 3, diviser la DO de l échantillon du patient # 3 par la valeur seuil : I = 1,196 = 2,29 0,523 Dans cet exemple, l échantillon du patient # 3 est positif car l index, égal à 2,29, est 0,50. Se référer au paragraphe sur l interprétation des résultats positifs, au chapitre.12. 13- LIMITES D UTILISATION 1. L obtention d un résultat négatif sur des échantillons de sérum et/ou de LBA n exclut pas le diagnostic d aspergillose invasive. Un prélèvement de sérum doit être effectué deux fois par semaine chez les patients à risque d aspergillose invasive afin de réaliser le test. 2. La procédure et l interprétation des résultats décrites pour le test Platelia Aspergillus Ag doivent être respectées lors de la réalisation de la détection de l antigène galactomannane dans les échantillons. Il est recommandé à l utilisateur du kit de lire attentivement la notice avant de réaliser le test. La procédure du test doit être strictement respectée en particulier lors du pipetage des échantillons et des réactifs, du lavage des microplaques et pour la durée des étapes d incubation. 3. Si l échantillon ou les réactifs ne sont pas ajoutés conformément aux instructions de la procédure, le résultat du test peut être faussement négatif. La répétition du test sur un nouvel échantillon du même patient doit être envisagée en cas de suspicion clinique d aspergillose invasive ou lorsqu une erreur est survenue au cours de la procédure.

4. La contamination des puits contenant des échantillons de patients négatifs par des puits contenant des contrôles positif ou des échantillons de patient positif est possible si le contenu d un puits déborde dans un autre puits du fait d une manipulation maladroite de la microplaque ou en raison d une mauvaise technique de pipetage lors de l addition des réactifs. 5. Les performances du test Platelia Aspergillus Ag n ont pas été évaluées sur des échantillons prélevés chez des nouveau-nés. La bibliographie Européenne relève une incidence plus élevée de résultats faussement positifs pour la détection du galactomannane dans les échantillons prélevés chez des nouveau-nés 13, 15, 33, 44. 6. Le test Platelia Aspergillus Ag peut présenter une sensibilité réduite dans la détection du galactomannane chez les patients atteints de maladie granulomateuse chronique (CGD) et du syndrome de Job 56, 58. 7. L utilisation concomitante d un traitement antifongique actif sur les moisissures, chez certains patients atteints d aspergillose invasive, peut conduire à une sensibilité réduite du test Platelia Aspergillus Ag 30, 31. 8. L utilisation du test Platelia Aspergillus Ag sur le plasma ou sur d autres types d échantillons, comme l urine ou le LCR, n a pas été évaluée. 9. Les performances du test Platelia Aspergillus Ag n ont pas été établies pour une lecture manuelle et/ou une détermination visuelle des résultats. 10. D autres genres de champignons, tels que Penicillium, Alternaria Paecilomyces, Geotrichum et Histoplasma, ont montré une réactivité avec les anticorps monoclonaux EBA-2 de rat, utilisés dans le test de détection du galactomannane aspergillaire. L histoplasmose doit être prise en compte dans les zones endémiques, y compris dans certaines régions des États-Unis 36, 50, 59. 11. La réactivité croisée d échantillons de liquide de LBA contenant Mycoplasma pneumoniae ou des anesthésiques/lubrifiants utilisés pour insensibiliser la gorge lors du processus d aspiration n a pas été évaluée. 12. Réactions positives sans signe clinique : Etant donné la précocité de détection de l antigène galactomannane dans le sérum ou le liquide de BAL avant même l apparition de signes cliniques et/ou radiologiques, des réactions positives en l absence de signes cliniques sont régulièrement observées :elles correspondent à des résultats de tests «vrais positifs» chez des patients pour lesquels un diagnostic d Aspergillose Invasive Prouvée ou Probable est ultérieurement établi 30. Cependant, dans certains cas particuliers, certains facteurs doivent être pris en compte lors de l interprétation du test : a. Des réactions positives sans développement de signes cliniques ont été rapportés, en particulier chez les jeunes enfants 44. Bien que certains de ces cas puissent être associés à une véritable circulation d antigènes aspergillaires, la plupart des cas peuvent être considérés comme des faux positifs 7. b. Le galactofuranose a été mis en évidence dans divers aliments, en particulier les céréales, leurs dérivés et les crèmes desserts 1, 27. Contrairement aux laits d origine humaine, les formulations à base de lait de vache contiennent fréquemment des concentrations élevées en galactomannane 13. Il convient donc, chez les jeunes enfants, et plus généralement chez tous les patients dont la barrière intestinale peut être altérée, d intégrer le facteur alimentaire dans l interprétation de l évolution de l antigénémie 6, 13. Toute antigénémie positive non accompagnée de signes cliniques doit être interprétée avec encore plus de précautions dans cette population de patients. c. Il a été rapporté des résultats de tests positifs pour la présence de galactomannane chez des patients recevant de la pipéracilline/tazobactam. Certains lots de pipéracilline/ tazobactam ont été testés positifs pour la présence de l antigène galactomannane. Ainsi les résultats de tests positifs chez les patients recevant de la pipéracilline / tazobactam doivent être interprétés avec prudence et confirmés par d autres techniques de diagnostic. La présence de galactomannane a également été rapportée dans certains lots de préparations parentérales d amoxicilline associée à l acide clavulanique. Ainsi, les traitements par des ß-lactamines semi-synthétiques doivent donc être pris en compte lors de l interprétation du test 1, 3, 32. 13

Néanmoins, Platelia Aspergillus Ag pouvant détecter l antigène galactomannane bien avant l apparition des signes cliniques ou radiologiques, une aspergillose invasive ne peut être exclue. Ainsi, les patients avec une antigénémie positive, traités avec de la pipéracilline/tazobactam doivent être suivis avec attention. d. Des réactions positives en l absence de signes cliniques, peuvent être potentiellement observées chez des patients recevant par voie parentérale ou par voie orale(en présence d une altération de la barrière intestinale) des produits contenant du galactomannane. La présence de galactomannane dans ces produits est souvent expliquée par l utilisation d un procédé de fermentation à partir de microorganismes fongiques. Un résultat positif ne sera toutefois observé chez le patient que si la concentration sérique du galactomannane exogène atteint ou dépasse le seuil de détection du test. Ainsi, en présence d un résultat positif suspect en l absence d autres signes évocateurs, nous recommandons d enquêter sur les produits que reçoit le patient et en particulier sur leur procédé de fabrication et sur l origine des matières premières utilisées 14, 41, 49. 13. Des cas de résultats positifs pour la détection du galactomannane dans des sérums et des liquides de lavage broncho-alvéolaires associés à du PLASMA-LYTE ont été rapportés dans plusieurs études 14, 41. C est pourquoi toute administration de PLASMA-LYTE doit être prise en compte pour l interprétation des résultats de ce test. 14. Les résultats du test Platelia Aspergillus Ag effectué sur des échantillons de liquide de lavage bronchoalvéolaire (LBA) provenant de patients non immunodéprimés doivent être interprétés avec précaution 37. 15. Les résultats avec des valeurs d index proches du seuil de positivité du test (0,5) doivent être interprétés avec précaution et confortés par d autres preuves d aspergillose invasive, d ordre cliniques, radiologiques ou biologiques, étant donné qu aucune zone grise n est incluse dans l interprétation des résultats de ce test. 16. De plus, les résultats du test Platelia Aspergillus Ag réalisé sur des échantillons de liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA), donnant un index compris entre 0,5 et 1,0, ont une valeur prédictive inférieure aux résultats donnant des valeurs d index > 1,0; De ce fait, les résultats affichant des valeurs d index compris entre 0,5 à 1,0 doivent être contrôlés et étayés par d autres arguments d ordre radiologiques ou biologiques, en faveur d une aspergillose invasive 8, 17. 14- VALEURS ATTENDUES I. SÉRUM La prévalence de l aspergillose invasive varie selon la population de patients ; des taux de 5 à 20 % ont été rapportés 10, 16. Les résultats suivants ont été obtenus au cours d études cliniques réalisées aux Etats-Unis chez des patients de pédiatrie (âge 21 ans) et en Amérique du Nord chez des patients adultes. A-Patients pédiatriques Afin de déterminer les performances du test Platelia Aspergillus Ag, une étude clinique menée dans trois centres basés aux Etats-Unis, a été réalisée sur un total de 1954 échantillons de sérum, provenant de 129 enfants immuno-déprimés (âge 21 ans), présentant un risque élevé d aspergillose invasive (AI) et de patients diagnostiqués avec une aspergillose invasive prouvée ou probable. La distribution des valeurs d index pour ces populations est représentée dans les graphiques ci-dessous : 14

Enfants diagnostiqués sans aspergillose invasive (population témoin) Figure 1 Un total de 1 625* échantillons de sérum obtenus sur 108 enfants immuno-déprimés, dans trois centres basés aux Etats-Unis, ont été testés pour déterminer les performances du test Platelia Aspergillus Ag. La distribution des valeurs d index pour ces échantillons est représentée dans le graphique suivant : Nombre de sérums Distribution des valeurs d index des sérums de la population pédiatrique témoin (N=1 625) Index *Remarque : 80 échantillons provenant de 4 patients de la population témoin et donnant des résultats positifs pour l antigène galactomannane suite à un traitement par pipéracilline/ tazobactam (Zosyn ) ont été exclus. Enfants avec diagnostic d aspergillose invasive Figure 2 Ce diagramme de dispersion représente les résultats du test de détection du galactomannane pour les 249 échantillons de sérum provenant des 17 patients de cette étude ayant un diagnostic d aspergillose prouvée ou probable, conformément aux définitions EORTC/NIAID. Tous les échantillons de sérum de chaque patient ne sont pas nécessairement positifs. La prévalence attendue d aspergillose invasive varie Index Aspergillose prouvée/probable chez l enfant Distribution de l index Patients pédiatriques (N=17) Nombre de patients selon la population de patients ; des taux de 5-20 % ont été rapportés 10, 24. La prévalence dans cette étude était de 13,6 %. B. Adultes Afin de déterminer les performances du test Platelia Aspergillus Ag, une étude clinique menée dans trois centres basés en Amérique du Nord, a été réalisée sur un total de 1 724 échantillons de sérums, provenant de 172 patients ayant reçu une greffe de moelle osseuse et atteints de leucémie, avec ou sans diagnostic d aspergillose invasive. La distribution des valeurs d index dans ces populations est représentée dans les graphiques ci-dessous. 15

Adultes sans diagnostic d aspergillose invasive (population témoin) Figure 3 Un total de 1262 échantillons de sérums provenant de 143 patients, hospitalisés dans trois centres basés en Amérique du Nord, ayant reçu une greffe de moelle osseuse et atteints de leucémie, ont été testés avec le test Platelia Aspergillus Ag. La distribution des valeurs d index est présentée dans le graphique suivant. Nombre de sérums Distribution des valeurs d index des sérums de la population adulte témoin (N=1262) Index Adultes avec diagnostic d aspergillose invasive Figure 4 Aspergillose prouvée/probable chez l adulte Distribution de l index/patients adultes (N=29) Ce diagramme de dispersion représente les résultats du test de détection du galactomannane pour les 462 échantillons de sérum des 29 patients de cette étude présentant un diagnostic d aspergillose prouvée ou probable, conformément aux définitions EORTC/NIAID. Tous les échantillons de sérum de chaque patient ne sont pas nécessairement positifs. La prévalence attendue Nombre de patients d aspergillose invasive varie selon la population de patients ; des taux de 5 à 20 % ont été rapportés 10, 24. La prévalence dans cette étude était de 16,9 %. Index Les graphiques suivants représentent respectivement des exemples d un patient sans signes cliniques ni symptômes d aspergillose invasive (négatif pour Aspergillus) et d un patient atteint d aspergillose invasive prouvée ou probable (positif pour Aspergillus). Figure 5 Patient négatif 16

Figure 6 Patient positif II. LIQUIDE DE LBA Afin de déterminer les performances du test Platelia Aspergillus Ag sur les échantillons de liquide de lavage broncho-alvéolaire.(lba), deux études ont été réalisées aux Etats-Unis,sur un total de 449 échantillons de liquide de LBA provenant de 178 patients ayant reçu une transplantation d organe solide ou une transplantation de poumon et ayant été diagnostiqués avec ou sans aspergillose invasive. 403 de ces échantillons étaient des échantillons de LBA provenant de 167 transplantés receveurs d organe solide ou de poumon et ne présentant pas d aspergillose invasive. De plus, une analyse rétrospective a été effectuée sur des échantillons de LBA prélevés chez 99 patients d hématologie considérés à haut risque lors d une étude réalisée en dehors des Etats-Unis et incluant 58 patients présentant une aspergillose invasive prouvée ou probable. Les valeurs attendues dans les échantillons de LBA des transplantés receveurs d organes solides ou de poumons et n ayant pas développé d aspergillose invasive sont données dans le tableau suivant. Les résultats sont présentés par échantillons de receveurs de transplantation présentant ou non une colonisation par moisissure. Tableau 1 Valeurs attendues par échantillon Receveurs de transplantation d organe solide ou de poumon, réunis, sans aspergillose invasive N= 403 liquides de LBA Diagnostic N Positif (%) Négatif (%) Témoins sans colonisation 341 11/341 (3,2%) 330/341 (96,8%) Témoins avec colonisation 62 12/62 (19,4%) 50/62 (80,6%) Total des témoins 403 23/403 (5,7%) 380/403 (94,3%) 17

Les valeurs attendues dans les échantillons de LBA des receveurs de transplantation d organe solide ou de poumon, réunis, sans aspergillose invasive, sont présentées dans le tableau suivant, par type de transplantation. Tableau 2 Valeurs attendues par échantillon Receveurs de transplantation d organe solide ou de poumon, réunis, sans aspergillose invasive, par type de transplantation N= 403 liquides de LBA Type de transplantation N Positif (%) Négatif (%) Coeur 28 3/28 (10,7%) 25/28 (89,3%) Rein 25 3/25 (12,0%) 22/25 (88,0%) Foie 23 1/23 (4,3%) 22/23 (95,7%) Poumon 327 16/327 (4,9%) 311/327 (95,1%) Total des témoins 403 23/403 (5,7%) 380/403 (94,3%) Les valeurs attendues ont aussi été évaluées sur un total de 41 échantillons de LBA prélevés chez 41 patients d hématologie sans aspergillose invasive. Ces valeurs sont présentées dans le tableau suivant : Tableau 3 Valeurs attendues par échantillon Patients d hématologie sans aspergillose invasive N=41 Diagnostic liquides de LBA N Positif (%) Negatif (%) Témoins 41 8/41 (19,5%) 33/41 (80,5%) 15. PERFORMANCES A- REPRODUCTIBILITÉ a) Études de reproductibilité dans les échantillons de sérum Les variabilités inter-essais et intra-essai du test Platelia Aspergillus Ag ont été déterminées au cours d une étude utilisant un panel de 6 échantillons de sérum de patients groupés (un échantillon négatif, un échantillon faiblement positif, deux échantillons positifs, et deux échantillons fortement positifs) obtenus dans trois centres d essai clinique en Amérique du Nord. Chacun des 6 membres du panel a été testé en triple réplique (x3) sur trois jours différents, sur un lot, dans deux sites (nombre total de répliques par centre = 9). Chacun des 6 membres du panel a été testé en double réplique (x2) sur 3 jours différents, sur un lot, dans un troisième site (nombre total de répliques dans le troisième centre = 6). Un opérateur a réalisé l ensemble des tests de précision dans chaque site. Les données ont été analysées conformément aux directives du Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) (anciennement National Committee for Clinical Laboratory Standards :NCCLS). La densité optique (DO) moyenne et la valeur d index moyenne, l écart type(sd), le coefficient de variation en pourcentage (CV%), la précision intra-essai et la précision entre les sites (inter-essais) pour chacun des membres du panel et dans chaque site sont présentés dans les tableaux suivants. 18

Tableau 4 Site 1 Membre du panel Nég. Faible pos. Pos. #1 Pos. #2 Fort pos. #1 Fort pos. #2 Contrôle nég. Sérum seuil Contrôle pos. DO Index DO Index DO Index DO Index DO Index DO Index DO Index DO Index DO Index N 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 3 3 6 6 3 3 Moyenne 0,052 0,09 0,445 0,74 0,702 1,17 0,931 1,563 1,227 2,06 2,887 4,83 0,046 0,08 0,606 1,00 2,216 3,67 SD intraessai 1 0,002 0,00 0,022 0,03 0,059 0,09 0,044 0,08 0,051 0,09 0,089 0,17 N/A N/A 0,02 0,03 N/A N/A %CV N/A N/A 4,8% 4,4% 8,4% 7,6% 4,7% 5,1% 4,2% 4,4% 3,1% 3,6% N/A N/A 3,7% 3,4% N/A N/A SD interessai 2 0,036 0,04 0,051 0,08 0,07 0,14 0,044 0,25 0,058 0,29 0,169 0,58 N/A N/A 0,102 0,03 0,317 0,12 %CV N/A N/A 11,5% 10,4% 10,0% 11,6% 4,7% 15,7% 4,7% 14,3% 5,9% 11,9% N/A N/A 16,9% 2,8% 14,3% 3,3% Site 2 Membre du panel Nég. Faible pos. Pos. #1 Pos. #2 Fort pos. #1 Fort pos. #2 Contrôle nég. Sérum seuil Contrôle pos. DO Index DO Index DO Index DO Index DO Index DO Index DO Index DO Index DO Index N 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 3 3 6 6 3 3 Moyenne 0,040 0,10 0,280 0,70 0,364 0,89 0,602 1,49 0,801 2,01 1,361 3,43 0,074 0,18 0,415 1,00 1,197 2,97 SD intraessai 1 0,006 0,01 0,041 0,09 0,023 0,07 0,045 0,11 0,046 0,10 0,047 0,11 N/A N/A 0,00 0,01 N/A N/A %CV N/A N/A 14,5% 13,0% 6,4% 7,6% 7,5% 7,1% 5,7% 4,8% 3,5% 3,2% N/A N/A 1,1% 1,1% N/A N/A SD interessai 2 0,006 0,03 0,058 0,19 0,083 0,18 0,057 0,28 0,042 0,53 0,079 1,00 N/A N/A 0,094 0,01 0,068 0,54 %CV N/A N/A 20,8% 27,0% 22,7% 19,8% 9,5% 18,7% 5,3% 26,5% 5,8% 29,2% N/A N/A 22,7% 0,9% 5,7% 18,2% Site 3 Membre du panel Nég. Faible pos. Pos. #1 Pos. #2 Fort pos. #1 Fort pos. #2 Contrôle nég. Sérum seuil Contrôle pos. DO Index DO Index DO Index DO Index DO Index DO Index DO Index DO Index DO Index N 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 3 3 6 6 3 3 Moyenne 0,049 0,10 0,388 0,81 0,652 1,36 0,830 1,73 1,158 2,41 2,378 4,96 0,059 0,12 0,480 1,00 1,652 3,45 SD intraessai 1 0,003 0,01 0,009 0,02 0,082 0,17 0,068 0,14 0,094 0,20 0,126 0,25 N/A N/A 0,028 0,06 N/A N/A %CV N/A N/A 2,4% 2,4% 12,5% 12,2% 8,2% 8,2% 8,1% 8,2% 5,3% 5,1% N/A N/A 5,8% 5,8% N/A N/A SD interessai 2 0,012 0,03 0,078 0,13 0,068 0,15 0,104 0,25 0,082 0,15 0,111 0,34 N/A N/A 0,028 0,04 0,056 0,23 %CV N/A N/A 20,0% 15,8% 10,5% 11,1% 12,5% 14,3% 7,1% 6,2% 4,7% 6,8% N/A N/A 5,8% 4,1% 3,4% 6,6% N/A = non applicable 1 NCCLS EP5-A, Vol. 19, No. 2; Page 24, Equation (C2) ²NCCLS EP5-A, Vol. 19, No. 2; Page 25, Equation (C3) et Equation (C4) 19

b) Reproductibilité dans le liquide de LBA La variabilité inter-essais et intra-essai pour le test Platelia Aspergillus Ag a été déterminée au cours d une étude utilisant un panel de 4 échantillons groupés de LBA de patients, chargés en galactomannane purifié (un échantillon négatif, un échantillon fortement négatif, un échantillon faiblement positif et un échantillon avec une positivité moyenne) dans trois centres (deux sites aux États-Unis et un site en interne). Chacun des 4 membres du panel, ainsi que les contrôles, ont été testés en double réplique (x2) dans 2 séries par jour, sur 5 jours différents, sur un lot (nombre total de résultats dans chaque site = 120). Deux (2) opérateurs ont réalisé l ensemble des tests de précision sur chaque site. Les données ont été analysées conformément aux directives du Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) (anciennement National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)). La densité optique (DO) moyenne et la valeur d index moyenne, l écart type, le coefficient de variation en pourcentage (CV%), la précision intra-essai et la précision entre les sites (inter-essais) pour chaque membre du panel sont présentés dans le tableau suivant : Tableau 5 - Résultats tous sites réunis Résumé Négatif Fortement négatif Faiblement positif Positivité moyenne Contrôle positif Contrôle négatif N= 60 N=60 N=60 N=60 N=60 N=60 DO Index DO Index DO Index DO Index DO Index DO Index Moyenne 0,121 0,29 0,214 0,50 0,375 0,88 0,575 1,35 1,580 3,72 0,047 0,11 Écart SD intra-essai type N/A N/A 0,037 0,103 0,035 0,078% 0,029 0,067 0,111 0,265 N/A N/A %CV N/A N/A 17,4% 20,5% 9,3% 8,9% 5,0% 5,0% 7,0% 7,1% N/A N/A Écart SD inter-essais type N/A N/A 0,042 0,095 0,061 0,122 0,070 0,138 0,190 0,438 N/A N/A %CV N/A N/A 19,6% 18,9% 16,2% 13,9% 12,2% 10,2% 12,0% 11,8% N/A N/A *Une (1) valeur statistique aberrante a été retirée de l analyse. B- RÉACTIONS CROISÉES Une étude a été menée avec un lot de Platelia Aspergillus Ag afin d évaluer l effet de pathologies sans lien avec l aspergillose invasive qui pourraient potentiellement interférer avec le test. Les échantillons de sérum suivants ont été testés afin de déterminer leur réactivité croisée avec le test Platelia Aspergillus Ag. Au total, 151 sérums ont été testés. Tableau 6 Pathologie Nbre d échantillons testés Nbre de positifs Facteur rhumatoïde 10 0 Positif pour les AAN 10 0 Hypergammaglobulinémie à IgG 10 0 Hypergammaglobulinémie à IgM 10 0 Cancer* 11 0 Cirrhose non virale (biliaire primitive ; alcoolique ; médicamenteuse) 10 0 Transfusions multiples 10 0 Femmes multipares 10 0 VHA 10 0 VHC 10 0 Rubéole 10 0 CMV 10 0 Syphilis (RPR+) 10 0 Toxoplasmose 10 0 Mycoplasme 10 0 20 * Un cas de chaque cancer suivant : vessie, sein (2), côlon, endomètre, poumon, prostate, rein et adénome squameux (3).

C- ETUDES CLINIQUES Etudes cliniques en Amérique du Nord I. ÉCHANTILLONS DE SÉRUM Des études cliniques ont été réalisées pour évaluer la sensibilité, la spécificité et la valeur prédictive du test Platelia Aspergillus Ag chez des enfants ( 21 ans) dans trois sites situés aux États-Unis et chez des adultes dans trois sites situés en Amérique du Nord. Ces études ont été menées sur un total de 1 954 échantillons de sérum, prélevés chez 129 enfants et sur un total de1 724 échantillons de sérum prélevés chez 172 adultes issus des populations suivantes* : Patients sans signe d aspergillose invasive (patients témoins) Patients avec aspergillose invasive probable Patients avec aspergillose invasive prouvée * Le groupe de coopération sur les infections fongiques invasives (IFIGC, Invasive Fungal Infection Cooperative Group) de l organisation Européenne pour la recherche et le traitement du cancer (EORTC, European Organization for Research and Treatment of Cancer) et le groupe d étude des mycoses (MSG, Mycosis Study Group) de l institut national de l allergie et des maladies infectieuses (NIAID, National Institute of Allergy and Infectious Diseases) ont défini en 2002 des critères de diagnostic de l aspergillose invasive (AI) chez les patients atteints d hémopathies malignes ou ayant bénéficié d une greffe de cellules souches hématopoïétiques 2. SENSIBILITÉ A. Enfants Les résultats de cette étude ont été analysés en termes de sensibilité par patient. L étude de sensibilité a été réalisée en utilisant le test Platelia Aspergillus Ag dans trois sites, sur un total de 17 enfants immunodéprimés, diagnostiqués avec une aspergillose invasive prouvée ou probable. Tableau 7 Diagnostic Nombre de patients Sensibilité Intervalle de confiance 95 % Aspergillose prouvée 9 44,4% (4/9) 18,9-73,3% Aspergillose probable 8 62,5% (5/8) 30,6-86,3% Aspergilloses prouvée et probable, réunies *Remarque : 8 des 17 patients ont eu des résultats négatifs pour l antigène galactomannane d Aspergillus. Les 8 patients présentant des résultats négatifs pour l antigène galactomannane d Aspergillus suivaient un traitement incluant plusieurs agents antifongiques. L utilisation concomitante d un traitement antifongique actif sur les moisissures, chez certains patients atteints d aspergillose invasive, peut réduire la sensibilité du test 31. B. Adultes L étude de sensibilité a été réalisée en utilisant le test Platelia Aspergillus Ag dans trois sites, sur un total de 29 patients adultes ayant bénéficié d une greffe de moelle osseuse ou atteints de leucémie et diagnostiqués avec une aspergillose invasive prouvée ou probable. Tableau 8 Diagnostic Nombre de patients Sensibilité Intervalle de confiance 95 % Aspergillose prouvée 11 81,8% (9/11) 52,3-94,9% Aspergillose probable 18 77,8% (14/18) 54,8-91,0% Aspergilloses prouvée et probable, réunies 17* 52,9% (9/17) 31,0-73,8% 29 79,3% (23/29) 61,6-90,2% 21

SPÉCIFICITÉ A. Enfants Spécificité par patient pédiatrique L étude de spécificité a été réalisée en utilisant le test Platelia Aspergillus Ag dans trois sites, sur un total de 108* enfants immunodéprimés sans signes d aspergillose invasive (patients témoins). Tableau 9 Site Nombre de patients Spécificité Intervalle de confiance 95 % 1 44 86,4 % (38/44) 73,3-93,6% 2 59 86,4 % (51/59) 75,5-93,0% 3 5 100% (5/5) 56,6-100% Tous sites réunis 108 87,0% (94/108) 79,4-92,1% *Remarque : 4 patients ayant des résultats positifs pour l antigène galactomannane coïncidant avec un traitement par pipéracilline/tazobactam ont été exclus. Spécificité par échantillon pédiatrique L étude de spécificité a été réalisée en utilisant le test Platelia Aspergillus Ag dans trois sites, sur un total de 1 625* échantillons prélevés sur 108 enfants immunodéprimés, sans signes d aspergillose invasive (patients témoins). Tableau 10 Site Nombre de patients Spécificité Intervalle de confiance 95 % 1 794 98,9% (785/794) 97,9-99,4% 2 731 97,8% (715/731) 96,5-98,6% 3 100 100% (100/100) 96,3-100% Tous sites réunis 1625 98,5% (1600/1625) 97,7-99,0% *Remarque : 80 échantillons prélevés sur 4 patients ayant des résultats positifs pour l antigène galactomannane coïncidant avec un traitement par pipéracilline/tazobactam ont été exclus. B. Adultes Spécificité par patient adulte L étude de spécificité a été réalisée en utilisant le test Platelia Aspergillus Ag dans trois sites, sur un total de 143 patients adultes ayant bénéficié d une greffe de moelle osseuse ou atteints de leucémie, sans signe d aspergillose invasive (patients témoins). Tableau 11 Site Nombre de patients Spécificité Intervalle de confiance 95 % 1 28 78,6% (22/28) 60,5-89,8% 2 77 93,4% (71/77) 84,0-96,4% 3 38 89,5% (34/38) 75,9-95,8% Tous sites réunis 143 88,8% (127/143) 82,6-93,0% 22

Spécificité par échantillon d adultes L étude de spécificité a été réalisée en utilisant le test Platelia Aspergillus Ag dans trois sites, sur un total de 1262 échantillons prélevés chez 143 patients adultes ayant bénéficié d une greffe de moelle osseuse ou atteints de leucémie, sans signe d aspergillose invasive (patients témoins). Tableau 12 Site Nombre de patients Spécificité Intervalle de confiance 95 % 1 349 98,0% (342/349) 95,9-99,0% 2 560 98,6% (552/560) 97,2-99,3% 3 353 98,9% (349/353) 97,1-99,6% Tous sites réunis 1262 98,5% (1243/1262) 97,7-99,0% VALEUR PRÉDICTIVE Les valeurs prédictives positives et négatives (VPP, VPN) ont été analysées pour la population de patients étudiée au cours de cette étude. Étant donné la moyenne réelle du taux de prévalence observée au cours de cette étude, de 13,6% dans la population pédiatrique et de 16,9 % dans la population d adultes, les valeurs prédictives positives et négatives ont été calculées comme suit : A. Enfants Prévalence dans cette étude : 13,6 % VPP : 39.1% Intervalle de confiance 95 % : 22.2-59.2% VPN : 92.2% Intervalle de confiance 95 % : 85.3-96.0% B. Adultes Prévalence dans cette étude : 16,9% VPP : 59.0% Intervalle de confiance 95 % : 43.4-72.9% VPN : 95.5% Intervalle de confiance 95 % : 90.5-97.9% La prévalence attendue pour l aspergillose invasive varie selon la population de patients ; des taux de 5 à 20% ont été rapportés 10, 24. Pour les populations de patients dont la prévalence est proche des valeurs basses publiées, les valeurs prédictives positive et négative a été re-calculées en se fondant sur un taux de prévalence à 5 %. A. Enfants Prévalence calculée à 5 % VPP : 17.6% Intervalle de confiance 95 % : 6.5-39.8% VPN : 97.2% Intervalle de confiance 95 % : 92.1-99.1% B. Adultes Prévalence calculée à 5 % VPP : 27.2% Intervalle de confiance 95 % : 13.7-46.7% VPN : 98.8% Intervalle de confiance 95 % : 95.4-99.7% II. ÉCHANTILLONS DE LIQUIDE DE LBA - PERFORMANCES La sensibilité et la spécificité du test Platelia Aspergillus Ag sur les échantillons de liquide de LBA ont été évaluées au cours de deux études effectuées aux États-Unis et réalisées sur 116 échantillons prélevés chez 62 patients receveurs d une transplantation d organe solide et sur 333 échantillons prélevés chez 116 patients receveurs d une transplantation de poumon et d une étude réalisée en dehors des Etats-Unis sur 99 échantillons prélevés chez 99 patients d hématologie considérés à haut risque et présentant ou non une aspergillose invasive. A. Sensibilité La sensibilité a été évaluée chez des receveurs de transplantation d organe solide ou de transplantation de poumon, diagnostiqués avec une aspergillose invasive conformément aux critères EORTC/MSG. 23

I. Receveurs de transplantation d organe solide présentant une aspergillose invasive Lors d une étude portant sur un total de 116 échantillons prélevés chez 62 receveurs de transplantation d organe solide, la sensibilité a été évaluée chez 5 receveurs diagnostiqués avec une aspergillose invasive, comme indiqué dans le tableau ci-dessous. Tableau 13 Sensibilité du test Platelia Aspergillus Ag, par patient Aspergillose invasive prouvée ou probable chez des receveurs de transplantation d organe solide Diagnostic N Index 0.5 Sensibilité Intervalle de confiance 95 % Aspergillose prouvée 2 2 2/2 (100%) 34,2-100% Aspergillose probable 3 3 3/3 (100%) 43,8-100% Aspergillose prouvée et probable, réunies 5 5 5/5 (100%) 56,5-100% Tableau 14 Sensibilité du test Platelia Aspergillus Ag, par type de transplantation Aspergillose invasive prouvée ou probable chez des receveurs de transplantation d organe solide Type de transplantation N Index 0.5 Sensibilité Intervalle de confiance 95 % Coeur 1 1 1/1 (100%) 20,6-100% Rein 3 3 3/3 (100%) 43,8-100% Foie 1 1 1/1 (100%) 20,6-100% Total 5 5 5/5 (100%) 56,5-100% II. Receveurs de transplantation de poumon présentant une aspergillose invasive Lors d une autre étude, sur un total de 333 échantillons prélevés chez 116 receveurs de transplantation de poumon, la sensibilité a été évaluée chez 6 receveurs diagnostiqués avec une aspergillose invasive, comme indiqué dans le tableau ci-dessous. Tableau 15 Sensibilité du test Platelia Aspergillus Ag, par patient Aspergillose invasive prouvée ou probable chez des receveurs de transplantation de poumon Diagnostic N Index 0.5 Sensibilité Intervalle de confiance 95 % Aspergillose prouvée 2 1 1/2 (50,0%) 9,4-90,6% Aspergillose probable 4 3 3/4 (75,0%) 30,0-95,4% Aspergillose prouvée et probable, réunies 6 4 4/6 (66,7%) 30,0-90,3% III. Patients d hématologie avec aspergillose invasive La sensibilité a aussi été évaluée lors d une troisième étude réalisée sur 58 échantillons de LBA prélevés chez 58 patients d hématologie diagnostiqués avec une aspergillose invasive comme indiqué dans le tableau suivant. A partir de cette étude utilisant Platelia Aspergillus EIA, une analyse rétrospective a été effectuée sur des échantillons de LBA prélevés chez des patients d hématologie à haut risque. Les données obtenues lors de cette étude publiée ont été utilisées pour établir les performances de Platelia Aspergillus EIA sur les liquides de LBA 29. 24

Tableau 16 Aspergillose invasive prouvée ou probable chez des patients d hématologie Diagnostic N Index 0.5 Sensibilité Intervalle de confiance 95 % Aspergillose prouvée 31 31 31/31 (100%) 89,0-100% Aspergillose probable 27 26 26/27 (96,3%) 81,7-99,3% Aspergillose prouvée et probable, réunies 58 57 57/58 (98,3%) 90,8-99,7% B. Spécificité La spécificité a été évaluée sur un total de 98 échantillons de liquide de LBA, provenant de 57 receveurs de transplantation d organe solide et sur 305 échantillons de liquide de LBA provenant de 110 receveurs de transplantation de poumon, ne présentant pas d aspergillose invasive. Les résultats sont présentés dans les tableaux ci-dessous: Tableau 17 Spécificité par échantillon Receveurs de transplantation d organe solide ou de poumon, réunis, sans aspergillose invasive N= 403 liquides de LBA Diagnostic N Index < 0.5 Négatif (%) Intervalle de confiance 95 % Témoins sans colonisation 341 330 330/341(96,8%) 94,3-98,2% Témoins avec colonisation 62 50 50/62 (80,6%) 69,1-88,6% Total des témoins 403 380 380/403(94,3%) 91,6-96,2% La spécificité obtenue avec les échantillons de liquide de LBA provenant de receveurs de transplantation d organe solide ou de transplantation de poumon, réunis, sans aspergillose invasive (témoins), est présentée par type de transplantation dans le tableau 18 ci-dessous: Tableau 18 Spécificité par échantillon Receveurs de transplantation d organe solide ou de poumon, réunis, sans aspergillose invasive, par type de transplantation. N= 403 liquides de LBA Type de transplantation N Index < 0.5 Négatif (%) Intervalle de confiance 95 % Coeur 28 25 25/28 (89,3%) 72,8-96,3% Rein 25 22 22/25 (88,0%) 70,0-95,8% Foie 23 22 22/23 (95,7%) 79,0-99,2% Poumon 327 311 311/327 (95,1%) 92,2-97,0% Total des témoins 403 380 380/403 (94,3%) 91,6-96,2% 25

La spécificité a aussi été évaluée sur un total de 41 échantillons de LBA prélevés chez 41 patients d hématologie sans aspergillose invasive. Les résultats sont présentés dans le tableau suivant. Tableau 19 Spécificité par échantillon Patients d hématologie sans aspergillose invasive N=41 Diagnostic N Index < 0.5 Negatif (%) Intervalle de confiance 95% Témoins 41 33 33/41 (80,5%) 66,0 89,8% 16- REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. Ansorg, R., R. Van Den Boom, and P.M. Rath. 1997. Detection of Aspergillus galactomannan antigen in foods and antibiotics. Mycoses 40 : p. 353-7. 2. Ascioglu, S., J. H. Rex, B. De Pauw, J. E. Bennett, J. Bille, F. Crokaert, D. W. Denning, J. P. Donnelly, J. E. Edwards, Z. Erjavec, D. Fiere, O. Lortholary, J. Maertens, J. F. Meis, T. F. Patterson, J. Ritter, D. Selleslag, P. M. Shah, D. A. Stevens and T. J. Walsh. 2002. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clin.Infect.Dis. 34: p. 7-14. 3. Aubry, A., R. Porcher. J. Bottero, S. Touratier, T. Leblanc, B. Brethon, P. Rousselot, E. Raffoux, J. Menotti, F. Derouin, P. Ribaud and A. Sulahian 2006. Occurrence and Kinetics of False-Positive Aspergillus GalactomannanTest Results following Treatment with ß-Lactam Antibiotics in Patients with Hematological Disorders. J. Clin. Microbiol. 44: p. 389-394. 4. Barnes P. D. and K. A. Marr. 2007 Risks, diagnosis and outcomes of invasive fungal infections in haemotopoeitic stem cell transplant recipients. Brit. Journ. Haemotol. 139: p. 519-531. 5. Becker M. J., E. J. Lugtenburg. J. J. Cornelissen, C. V.D. Schee, H. C. Hoogsteden and S. D. Marie. 2003 Galactomannan detection in computerized tomography-based broncho-alveolar lavage fluid and serum in haemotological patients at risk for invasive pulmonary aspergillosis. Br. J. Haemotol. 121(3): p. 448-457. 6. Blijevens, N. M., J. P. Donelly, J. F. Meis, P. E. Verweij, and B. E. De Pauw. 2002 Aspergillus galactomannan antigen levels in allogeneic haemotopoietic stem cell transplant receipients given total parenteral nutrition. Transpl. Infect. Dis. 4: p. 64-65. 7. Chambon-Pautas, C.,J. M. Costa, M.T. Chaumette, C. Cordonnier, and S. Bretagne. 2001 Galactomannan and polymerase chain reaction for the diagnosis of primary digestive aspergillosis in a patient with acute myeloid leukaemia. J. Infect. 43: p. 213-214. 8. Clancy C., R. A. Jaber, H. L. Leather, J. R. Wingard, B. Staley, J. L. Wheat, C. Cline, K. H. Rand, D. Schain, M. Baz and M. H. Nyugen. 2007 Bronchoalveolar Lavage Galactomannan in Diagnosis of Invasive Pulmonary Aspergillosis among Solid-Organ Transplant Recipients. J. Clin. Microbiol. 45(6): p. 1759-1765. 9. De Repentigny, L., L. Kaufman, G. T. Cole, D. Kruse, J. P. Latge, and R. C. Matthews. 1994. Immunodiagnosis of Invasive Fungal Infections. J Med Vet Mycol 32: p. 239-252. 10. Denning, D. W. 1998. Invasive Aspergillosis. Clin Infect.Dis. 26: p. 781-803. 11. Desai R, L.A. Ross and J. A. Hoffman Poster AAA 2008. The Role of Bronchoalveolar Lavage Galactomannan Assay in the Diagnosis of Invasive Aspergillosis in Pediatric Populations. 12. Erjavec, Z. and P. E. Verweij. 2002. Recent progress in the diagnosis of fungal infections in the immunocompromised host. Drug Resist. Updat. 5: p.3-10. 13. Gangneux, J., D. Lavarde, S. Bretagne, C. Guiguen and V. Gandemer. 2002. Transient Aspergillus antigenaemia: think of milk. Lancet. 359(9313):1251. 14. Hage,C. A., J. M. Reynolds, M. Durkin, L. J. Wheat, K. S. Knox. 2007. Plasmalyte as a Cause of false-positive results for Aspergillus galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid. J. Clin. Microbiol. 45: p. 676-677. 26

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30 (BG) Този продукт съдържа човешки или животински компоненти. Бъдете внимателни при работа с него. (CZ) Tento výrobek obsahuje lidské nebo zvířecí komponenty. Zacházejte s ním opatrně. (DE) Dieses Produkt enthält Bestandteile menschlichen oder tierischen Ursprungs. Vorsichtig handhaben. (DK) Dette produkt indeholder humane og animalske komponenter. Skal behandles med forsigtighed. (EE) Käesolev toode sisaldab inim-või loomseid komponente. Käsitseda ettevaatlikult. (EN) This product contains human or animal components. Handle with care. (ES) Este producto contiene componentes humanos o animales. Manejar con cuidado. (FI) Tässä tuotteessa on ihmisestä tai eläimistä peräisin olevia osia. Käsittele varovasti. (FR) Ce produit contient des composants d origine humaine ou animale. Manipuler avec précaution. (GR) Αυτό το προϊόν περιέχει ανθρώπινα ή ζωικά στοιχεία. Χειριστείτε το με προσοχή. (HR) Ovaj proizvod sadrži ljudske ili životinjske sastojke. Pažljivo rukovati. (HU) A készítmény emberi vagy állati eredetű összetevőket tartalmaz. Óvatosan kezelendő. (IT) Questo prodotto contiene componenti umane o animali. Maneggiare con cura. (LT) Šiame produkte yra žmogiškosios arba gyvūninės kilmės sudėtinių dalių. Elgtis atsargiai. (MT) Dan il-prodott fih komponenti umani jew tal-annimali. Uża b attenzjoni. (NL) Dit product bevat menselijke of dierlijke bestanddelen. Breekbaar. (NO) Dette produktet inneholder humane eller animalske komponenter. Håndteres med forsiktighet. (PL) Niniejszy produkt zawiera składniki pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego. Należy obchodzić się z nim ostrożnie. (PT) Este medicamento contém componentes de origem humana ou animal. Manuseie com cuidado. (RO) Acest produs conţine materiale de origine umană sau animală. Manevraţi-l cu grijă. (SE) Denna produkt innehåller beståndsdelar från människa eller djur. Hantera produkten varsamt. (SI) Izdelek vsebuje človeške ali živalske sestavine. Rokujte previdno. (SK) Tento výrobok obsahuje ľudské alebo zvieracie zložky. Narábajte s ním opatrne.

H314-H317 P280-P305+P351+P338- P301+P330+P331-P303+P361+P353- P333+P313-P501 (BG) опасно Причинява тежки изгаряния на кожата и сериозно увреждане на очите. Може да причини алергична кожна реакция. Използвайте предпазни ръкавици/предпазно облекло/ предпазни очила/предпазна маска за лице. ПРИ КОНТАКТ С ОЧИТЕ: Промивайте внимателно с вода в продължение на няколко минути. Свалете контактните лещи, ако има такива и доколкото това е възможно. Продължавайте да промивате. ПРИ ПОГЛЪЩАНЕ: изплакнете устата. НЕ предизвиквайте повръщане. ПРИ КОНТАКТ С КОЖАТА (или косата): Незабавно свалете цялото замърсено облекло. Облейте кожата с вода/вземете душ При поява на кожно дразнене или обрив на кожата: Потърсете медицински съвет/помощ. Изхвърлете съдържанието/ контейнера в съответствие с местните/регионалните/ националните/международните разпоредби. (CZ) Nebezpečí Způsobuje těžké poleptání kůže a poškození očí. Může vyvolat alergickou kožní reakci. Používejte ochranné rukavice/ochranný oděv/ochranné brýle/ obličejový štít. PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. PŘI POŽITÍ: Vypláchněte ústa. NEVYVOLÁVEJTE zvracení. PŘI STYKU S KŮŽÍ (nebo s vlasy): Veškeré kontaminované části oděvu okamžitě svlékněte. Opláchněte kůži vodou/osprchujte. Při podráždění kůže nebo vyrážce: Vyhledejte lékařskou pomoc/ošetření. Obsah/nádobu likvidujte v souladu s místními/ regionálními/národními/mezinárodními předpisy. (DE) Gefahr Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. Kann allergische Hautreaktionen verursachen. Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/ Gesichtsschutz tragen. BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser spülen. Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter spülen. BEI VERSCHLUCKEN: Mund ausspülen. KEIN Erbrechen herbeiführen. BEI KONTAKT MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle beschmutzten, getränkten Kleidungsstücke sofort ausziehen. Haut mit Wasser abwaschen/duschen. Bei Hautreizung oder -ausschlag: Ärztlichen Rat einholen/ärztliche Hilfe hinzuziehen. Entsorgung des Inhalts / des Behälters gemäß den örtlichen / regionalen / nationalen/ internationalen Vorschriften. (DK) Fare Forårsager svære forbrændinger af huden og øjenskader. Kan forårsage allergisk hudreaktion. Bær beskyttelseshandsker/beskyttelsestøj/øjenbeskyttelse/ ansigtsbeskyttelse VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. I TILFÆLDE AF INDTAGELSE: Skyl munden. Fremkald IKKE opkastning. VED KONTAKT MED HUDEN (eller håret): Tilsmudset tøj tages straks af/fjernes. Skyl/brus huden med vand. Ved hudirritation eller udslet: Søg lægehjælp. Bortskaffelse af indholdet/beholderen i henhold til de lokale/ regionale/nationale/internationale forskrifter. (EE) Ettevaatust Põhjustab rasket nahasöövitust ja silmakahjustusi. Võib põhjustada allergilist nahareaktsiooni. Kanda kaitsekindaid/kaitserõivastust/kaitseprille/kaitsemaski. SILMA SATTUMISE KORRAL: loputada mitme minuti jooksul ettevaatlikult veega. Eemaldada kontaktläätsed, kui neid kasutatakse ja kui neid on kerge eemaldada. Loputada veel kord. ALLANEELAMISE KORRAL: loputada suud. MITTE kutsuda esile oksendamist. NAHALE (või juustele) SATTUMISE KORRAL: võtta viivitamata kõik saastunud rõivad seljast. Loputada nahka veega/loputada duši all. Nahaärrituse või _obe korral: pöörduda arsti poole. Sisu/konteineri käitlus vastavuses kohalike/regionaalsete/rahvuslike/rahvusvaheliste nõuetega. (EN) Danger Causes severe skin burns and eye damage. May cause an allergic skin reaction. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/ face protection. IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minutes. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing. IF SWALLOWED: rinse mouth. Do NOT induce vomiting. IF ON SKIN (or hair): Remove/Take off immediately all contaminated clothing. Rinse skin with water/ shower. If skin irritation or rash occurs: Get medical advice/ attention. Dispose of contents/container in accordance with local/regional/national/international regulations. (ES) Peligro Provoca quemaduras graves en la piel y lesiones oculares graves. Puede provocar una reacción alérgica en la piel. Llevar guantes que aíslen del frío/gafas/máscara. EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. EN CASO DE INGESTIÓN: Enjuagarse la boca. NO provocar el vómito. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL (o el pelo): Quitarse inmediatamente las prendas contaminadas. Aclararse la piel con agua o ducharse. En caso de irritación o erupción cutánea: Consultar a un médico. Eliminar el contenido o el recipiente conforme a la reglamentación local/regional/ nacional/internacional. (FI) Vaara Voimakkaasti ihoa syövyttävää ja silmiä vaurioittavaa. Voi aiheuttaa allergisen ihoreaktion. Käytä suojakäsineitä/suojavaatetusta/silmiensuojainta/ kasvonsuojainta. JOS KEMIKAALIA JOUTUU SILMIIN: Huuhdo huolellisesti vedellä usean minuutin ajan. Poista piilolinssit, _edical voi tehdä helposti. Jatka huuhtomista. JOS KEMIKAALIA ON NIELTY: Huuhdo suu. EI saa oksennuttaa. JOS KEMIKAALIA JOUTUU IHOLLE (tai hiuksiin): Riisu saastunut vaatetus välittömästi. Huuhdo/suihkuta iho vedellä. Jos ilmenee ihoärsytystä tai ihottumaa: Hakeudu lääkäriin. Säilytä säiliö(t) noudattaen paikallisia/alueellisia/kansallisia/ kansainvälisiä määräyksiä. (FR) Danger Provoque des brûlures de la peau et des lésions oculaires graves. Peut provoquer une allergie cutanée. Porter des gants de protection/des vêtements de protection/ un équipement de protection des yeux/du visage. EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX: rincer avec précaution à l eau pendant plusieurs minutes. Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent être facilement enlevées. Continuer à rincer. EN CAS D INGESTION: rincer la bouche. NE PAS faire vomir. EN CAS DE CONTACT AVEC LA PEAU (ou les cheveux): enlever immédiatement les vêtements contaminés. Rincer la peau à l eau/se doucher. En cas d irritation ou d éruption cutanée: consulter un médecin. Éliminer le contenu/récipient conformément à la réglementation locale/régionale/nationale/internationale. (GR) Κίνδυνος Προκαλεί σοβαρά δερματικά εγκαύματα και οφθαλμικές βλάβες. Μπορεί να προκαλέσει αλλεργική δερματική αντίδραση. Να φοράτε προστατευτικά γάντια/προστατευτικά ενδύματα/ μέσα ατομικής προστασίας για ταμάτια/πρόσωπο. ΣΕ 31

32 ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε προσεκτικά με νερό για αρκετά λεπτά. Εάν υπάρχουν φακοί επαφής, αφαιρέστε τους, εφόσον είναι εύκολο. Συνεχίστε να ξεπλένετε. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΚΑΤΑΠΟΣΗΣ: Ξεπλύνετε το στόμα. ΜΗΝ προκαλέσετε εμετό. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΟ ΔΕΡΜΑ (ή με τα μαλλιά): Αφαιρέστε αμέσως όλα τα μολυσμένα ενδύματα. Ξεπλύνετε το δέρμα με νερό/στο ντους. Εάν παρατηρηθεί ερεθισμός του δέρματος ή εμφανιστεί εξάνθημα: Συμβουλευθείτε/Επισκεφθείτεγιατρό. Απορρίψτε τα περιεχόμενα/δοχείο σύμφωνα με τους τοπικούς/εθνικούς/ διεθνείς κανονισμούς. (HR) Opasnost Uzrokuje teške opekline kože i ozljede oka. Može izazvati alergijsku reakciju na koži. Nositi zaštitne rukavice/zaštitnu odijelo/zaštitu za oči/zaštitu za lice. U SLUČAJU DODIRA S OČIMA: oprezno ispirati vodom nekoliko minuta. Ukloniti kontaktne leće ukoliko ih nosite i ako se one lako uklanjaju. Nastaviti ispiranje. AKO SE PROGUTA: isprati usta. NE izazivati povraćanje. U SLUČAJU DODIRA S KOŽOM (ili kosom): odmah ukloniti/skinuti svu zaganenu odjeću. Isprati kožu vodom/tuširanjem. U slučaju nadražaja ili osipa na koži: zatražiti savjet/pomoć liječnika. Odložite sadržaje /spremnike u skladu s lokalnim/regionalnim/ nacionalni/međunarodnim odredbama. (HU) Veszély Smarkiai nudegina odą ir pažeidžia akis. Allergiás bőrreakciót válthat ki. Védőkesztyű/védőruha/szemvédő/arcvédő használata kötelező. SZEMBE KERÜLÉS esetén: Több percig tartó óvatos öblítés vízzel. Adott esetben a kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása. LENYELÉS ESETÉN: a szájat ki kell öblíteni. TILOS hánytatni. HA BŐRRE (vagy hajra) KERÜL: Az összes szennyezett ruhadarabot azonnal el kell távolítani/le kell vetni. A bőrt le kell öblíteni vízzel/zuhanyozás. Bőrirritáció vagy kiütések megjelenése esetén: orvosi ellátást kell kérni. Az edény tartalmát / a tartályt a helyi/regionális/nemzeti/nemzetközi szabályozásoknak megfelelően kell hulladékként elhelyezni. (IT) Pericolo Provoca gravi ustioni cutanee e gravi lesioni oculari. Può provocare una reazione allergica cutanea. Indossare guanti/indumenti protettivi/proteggere gli occhi/il viso. IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. IN CASO DI INGESTIONE: sciacquare la bocca. NON provocare il vomito. IN CASO DI CONTATTO CON LA PELLE (o con i capelli): togliersi di dosso immediatamente tutti gli indumenti contaminati. Sciacquare la pelle/fare una doccia. In caso di irritazione o eruzione della pelle: consultare un medico. Smaltire il prodotto/recipiente in conformità con le disposizioni locali / regionali / nazionali / internazionali. (LT) Pavojinga Smarkiai nudegina odą ir pažeidžia akis. Gali sukelti alerginę odos reakciją. Mūvėti apsaugines pirštines/dėvėti apsauginius drabužius/ naudoti akių (veido) apsaugos priemones. PATEKUS Į AKIS: Kelias minutes atsargiai plauti vandeniu. Išimti kontaktinius lęšius, jeigu jie yra ir jeigu lengvai galima tai padaryti. Toliau plauti akis. PRARIJUS: išskalauti burną. NESKATINTI vėmimo. PATEKUS ANT ODOS (arba plaukų): Nedelsiant nuvilkti/pašalinti visus užterštus drabužius. Odą nuplauti vandeniu/čiurkšle. Jeigu sudirginama oda arba ją išberia: kreiptis į gydytoją. Turinį/talpą išpilti (išmesti) - šalinti pagal vietines / regionines / nacionalines / tarptautines taisykles. (NL) Gevaar Veroorzaakt ernstige brandwonden en oogletsel. Kan een allergische huidreactie veroorzaken. Beschermende handschoenen/beschermende kleding/ oogbescherming/gelaatsbescherming dragen. BIJ CONTACT MET DE OGEN: voorzichtig afspoelen met water gedurende een aantal minuten; contactlenzen verwijderen, indien mogelijk; blijven spoelen. NA INSLIKKEN: de mond spoelen GEEN braken opwekken. BIJ CONTACT MET DE HUID (of het haar): verontreinigde kleding onmiddellijk uittrekken huid met water afspoelen/afdouchen. Bij huidirritatie of uitslag: een arts raadplegen. De inhoud en de verpakking verwerken volgens de plaatselijke/regionale/nationale/internationale voorschriften. (NO) Fare Forårsaker alvorlige hudforbrenninger og øyeskader. Kan forårsake allergiske hudreaksjoner. Bruk vernehansker/verneklær/vernebriller/ansiktsskjerm. VED KONTAKT MED ØYNENE: Skyll forsiktig med vann i opptil flere minutter. Fjern evt. kontaktlinser såfremt dette er lett mulig. Fortsett skyllingen. VED SVELGING: Skyll munnen. IKKE fremkall brekninger. VED HUDKONTAKT (eller kontakt med hår): Alle tilsølte klær må fjernes straks. Vask/dusj huden med vann. Ved hudirritasjon eller -utslett: Kontakt / tilkall lege. Innholdet / emballasjen skal avhendes i henhold til de lokale / regionale / nasjonale / internasjonale forskrifter. (PL) Niebezpieczeństwo Powoduje poważne oparzenia skóry oraz uszkodzenia oczu. Może powodować reakcję alergiczną skóry. Stosować rękawice ochronne/odzież ochronną/ochronę oczu/ochronę twarzy. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. W PRZYPADKU POŁKNIĘCIA: wypłukać usta. NIE wywoływać wymiotów. W PRZYPADKU KONTATKU ZE SKÓRĄ (lub z włosami): Natychmiast usunąć/zdjąć całą zanieczyszczoną odzież. Spłukać skórę pod strumieniem wody/prysznicem. W przypadku wystąpienia podrażnienia skóry lub wysypki: Zasięgnąć porady/zgłosić się pod opiekę lekarza. Zawartość / pojemnik usuwać zgodnie z przepisami miejscowymi / regionalnymi / narodowymi / międzynarodowymi. (PT) Perigo Provoca queimaduras na pele e lesões oculares graves. Pode provocar uma reacção alérgica cutânea. Usar luvas de protecção/vestuário de protecção/protecção ocular/protecção facial. SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: enxaguar cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto, retire-as, se tal lhe for possível. Continuar a enxaguar. EM CASO DE INGESTÃO: enxaguar a boca. NÃO provocar o vómito. SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE (ou o cabelo): despir/ retirar imediatamente toda a roupa contaminada. Enxaguar a pele com água/tomar um duche. Em caso de irritação ou erupção cutânea: consulte um médico. Eliminar o conteúdo/ recipiente de acordo com a legislação local/regional/nacional/ internacional. (RO) Pericol Provoacă arsuri grave ale pielii şi lezarea ochilor. Poate provoca o reacţie alergică a pielii. Purtaţi mănuşi de protecţie/îmbrăcăminte de protecţie/ echipament de protecţie a ochilor/ chipament de protecţie a feţei. ÎN CAZ DE CONTACT CU OCHII: clătiţi cu atenţie cu apă timp de mai multe minute. Scoateţi lentilele de contact, dacă este cazul şi dacă acest lucru se poate face cu uşurinţă. Continuaţi să clătiţi. ÎN CAZ DE ÎNGHIŢIRE: clătiţi gura. NU provocaţi voma. ÎN CAZ DE CONTACT CU PIELEA (sau părul): scoateţi imediat toată îmbrăcămintea contaminată. Clătiţi pielea cu apă/faceţi duş. În caz de iritare a pielii sau de erupţie cutanată: consultaţi medicul. Aruncaţi conţinutul/ containerul în acord cu regulamentele locale/regionale/ naţionale/internaţionale. (SE) Fara Orsakar allvarliga frätskador på hud och ögon. Kan orsaka allergisk hudreaktion. Använd skyddshandskar/skyddskläder/ögonskydd/ ansiktsskydd. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om

det går lätt. Fortsätt att skölja. VID FÖRTÄRING: Skölj munnen. Framkalla INTE kräkning. VID HUDKONTAKT (även håret): Ta omedelbart av alla nedstänkta kläder. Skölj huden med vatten/duscha. Vid hudirritation eller utslag: Sök läkarhjälp. Innehållet / behållaren avfallshanteras enligt lokala / regionala / nationella / internationella föreskrifter. (Sl) Nevarno Povzroča hude opekline kože in poškodbe oči. Lahko povzroči alergijski odziv kože. Nositi zaščitne rokavice/zaščitno obleko/zaščito za oči/ zaščito za obraz. PRI STIKU Z OČMI: previdno izpirajte z vodo nekaj minut. Odstranite kontaktne leče, če jih imate in če to lahko storite brez težav. Nadaljujte z izpiranjem. PRI ZAUŽITJU: izprati usta. NE izzvati bruhanja. PRI STIKU S KOŽO (ali lasmi): takoj odstraniti/sleči vsa kontaminirana oblačila. Izprati kožo z vodo/prho. Če nastopi draženje kože ali se pojavi izpuščaj: poiščite zdravniško pomoč/oskrbo. Vsebino/vsebnik odstranite v skladu z lokalnimi/regionalnimi/narodnimi/mednarodnimi predpisi. (SK) Nebezpečenstvo Provoacă arsuri grave ale pielii şi lezarea ochilor. Môže vyvolať alergickú kožnú reakciu. Noste ochranné rukavice/ochranný odev/ochranné okuliare/ochranu tváre. PO ZASIAHNUTÍ OČÍ: Niekoľko minút ich opatrne vyplachujte vodou. Ak používate kontaktné šošovky a ak je to možné, odstráňte ich. Pokračujte vo vyplachovaní. PO POŽITÍ: vypláchnite ústa. Nevyvolávajte zvracanie. PRI KONTAKTE S POKOŽKOU (alebo vlasmi): Odstráňte/vyzlečte všetky kontaminované časti odevu. Pokožku ihneď opláchnite vodou/sprchou. Ak sa prejaví podráždenie pokožky alebo sa vytvoria vyrážky: vyhľadajte lekársku pomoc/starostlivosť. Zneškodnenie obsahu/obalu v súlade s miestnymi/oblastnými/národnými/ medzinárodnými nariadeniami. Distributed in the U.S. by: bio-rad Laboratories 6565 185 th Avenue NE Redmond, WA 98052 bio-rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 2013/10 Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 881115 www.bio-rad.com For Customer Orders and Technical Service Call: 1-800-2-BIO-RAD (1-800-224-6723)