Thème 1A Expression, stabilité et variation du programme génétique Chapitre III La reproduction conforme de la cellule et la réplication de l ADN Activité 1 Mise en situation et recherche à mener Au cours de la vie d une cellule, il existe des périodes de synthèse pendant lesquelles l ADN est répliqué et d autres étapes au cours desquelles le matériel génétique est partagé. Le cytomètre en flux est un appareil qui permet de compter précisément le nombre de cellules présentes dans un échantillon tout en mesurant, pour chaque cellule, un ou plusieurs paramètres caractérisé(s) par un marqueur fluorescent. http://www.univ-paris-diderot.fr/sc/site.php?bc=formations&np=mentiondip?nd=1042 Vous êtes spécialiste en cytométrie des flux et vous devez établir les différentes étapes du cycle cellulaire. Ressources Le cytomètre en flux est un appareil qui permet de dénombrer différentes populations cellulaires mélangées dans un liquide. Les cellules sont marquées par une ou plusieurs substances fluorescentes qui se fixent spécifiquement, par l intermédiaire d anticorps, sur différentes catégories cellulaires. Dans le cytomètre, les cellules passent en «file indienne» devant un faisceau lumineux qui «excite» le marqueur fluorescent. Les cellules peuvent alors être comptées par un détecteur. Plusieurs paramètres peuvent être enregistrés : taille de la cellule, granulosité, fluorescence émise. Cette analyse peut être suivie d'un tri. L'analyse statistique des données cytométriques réalisées à des intervalles de temps réguliers permet de suivre l'évolution des populations cellulaires (cycle cellulaire, populations lymphocytaires pour le SIDA...) Le logiciel Cytométrie permet de présenter les données relevées par le cytomètre. Ces dernières peuvent être représentées sous la forme d un graphe bidimensionnel où l on peut choisir les paramètres affichés en ordonnée (Y) et en abscisse (X). Chaque point (Events) du graphique correspond à la détection d une cellule par le cytomètre. Fiche principe de fonctionnement d un cytomètre en flux. Conditions de culture : Incubation des cellules de hamster chinois pendant 30 minutes en présence de bromodésoxyuridine (BrdUrd). Incubation des cellules en présence d iodure de propidium (PI) et d anticorps anti-brdurd après chaque prélèvement. Ce que représentent les axes : X=FL2-A Quantité de PI fixé. Le PI est un marqueur se fixant à l ADN. La quantité de PI fixé est proportionnelle à la quantité d ADN cellulaire. Y=FL1-H Quantité de BrdUrd. Le BrdUrd est utilisé comme précurseur (c est un analogue de la thymine) par les cellules lors de la synthèse de l ADN. Il permet donc de déterminer les cellules en réplication. - Ouvrir le logiciel CYTOMÉTRIE. - Charger le fichier abrdu001. Rem. Ces différents fichiers correspondent à des acquisitions réalisées à des temps croissants de prélèvement après incubation en présence de BrdUrd. Le fichier abrdu006, par exemple, correspond à des cellules prélevées 6 heures après l'incubation. - Régler les paramètres de la manière suivante : Paramètre 1 (Axe des abscisses): FL2-A Quantité d iodure de propidium (PI) fixé. Le PI est un marqueur se fixant à l ADN. La quantité de PI fixé est donc proportionnelle à la quantité d ADN cellulaire. Paramètre 2 (Axe des ordonnées) : FL1-H Quantité de bromodésoxyuridine (BrdUrd). Le BrdUrd est utilisé comme précurseur (c est un analogue de la thymine) par les cellules lors de la synthèse de l ADN. Il permet donc de déterminer les cellules en réplication. - Sur le fichier abrdu001 (ci-dessous), légender les populations n ayant pas incorporé le BrdUrd. - Dénombrer les cellules dans chacune de ces populations après les avoir délimitées. Pour cela, onglet «Catégories» «Délimiter sur le graphique», puis dessiner un polygone autour de ces cellules. L onglet «Statistiques» vous fournit le nombre de cellules de chaque polygone défini. - Comparer la quantité d'adn dans chacune de ces populations et légender ci-dessus celles qui viennent de subir la mitose et celles qui vont la subir. - Expliquer pourquoi des cellules ayant incorporé la même quantité de BrdUrd peuvent posséder des quantités différentes d ADN. - Placer sur le cycle cellulaire les différentes populations cellulaires caractérisées dans les questions précédentes. - Charger le fichier abrdu003 : - Expliquer l'apparition, au bout de 3 heures, de cellules ayant incorporé du BrdUrd et possédant une quantité Q d'adn. Repérer cette même population sur les dot plot à t= 1 heure et t= 2 heures. - Sur les autres fichiers : - Construire une courbe de l'évolution de la quantité d ADN cellulaire au cours du temps en suivant la population cellulaire repérée dans la question précédente. Localiser sur le graphique l interphase et les différentes étapes de la mitose.
2 Repérer les populations n ayant pas incorporé le BrdUrd. 3 Dénombrer les cellules dans chacune de ces populations après les avoir délimitées. 4 Comparer la quantité d'adn dans chacune de ces populations et préciser celles qui viennent de subir la mitose et celles qui vont la subir. 5 Quantifier les cellules ayant incorporé le BrdUrd. 6 Commenter la quantité d'adn des cellules ayant incorporé le BrdUrd. Elles ont une quantité d'adn comprise entre Q et 2Q. 7 Expliquer pourquoi des cellules qui ont incorporé la même quantité de BrdUrd peuvent posséder des quantités différentes d'adn. Celles qui ont une quantité Q d'adn sont en début de synthèse. Celles qui ont une quantité 2Q d'adn sont en fin de synthèse d'adn. 8 Placer sur le cycle cellulaire les différentes populations cellulaires caractérisées dans les questions précédentes.
1 - Expliquer l'apparition, au bout de 3 heures, de cellules ayant incorporé du BrdUrd et possédant une quantité Q d'adn. Repérer cette même population sur les dot plot à t= 1 heure et t= 2 heures. 2 Construire une courbe de l'évolution de la quantité d ADN cellulaire au cours du temps en suivant la population cellulaire repérée dans la question 1. Estimation de la quantité d'adn cellulaire à différents moments du cycle Tableau construit à partir d'une population "repère" suivie par cytométrie Temps (heures) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Quantité d'adn cellulaire (unités arbitraires) 8 8 4 4 4 5 6 7 8 On observe : - la signature d'une mitose entre t=2 heures et t=3heures ; - la signature d'une phase de réplication de l'adn entre t= 5 heures et t= 9 heures. 3 Localiser sur le graphique l interphase et les différentes étapes de la mitose.