Régulation de l expression des génomes

Cours Module L5-BH-05 Régulation de l expression des génomes Mercredi de 13h30 à 15h30 & Jeudi de 8h00 à 10h00 (sem. 0 à 5/6) S. Bourgerie sylvain.bourgerie@univ-orleans.fr Université d Orléans UFR Sciences & Centre de Biophysique Moléculaire UPR4301 1

PLAN des COURS n 1 & n 2 1- Introduction 1.1 pourquoi y-a-t-il régulation? 1.2 niveaux de régulation 1.3 quelques définitions 1.4 notion d opéron 2- Régulation de la transcription 2.1 stratégies de contrôle de l initiation de la transcription 2.2 contrôles positif-négatif 2.3 rappels sur l initiation de la transcription chez les procaryotes 3- Opéron lactose 3.1 organisation générale 3.2 phénomène d induction - inducteur 3.3 lacz - lacy - laca 3.4 mutants de l opéron 3.5 régulations 3.5.1 négative (répresseur) 3.5.1.1 expérience Pajamo 3.5.1.2 rôle du répresseur 3.5.1.3 structure du répresseur 3.5.1.4 opérateur 3.5.2 positive : répression catabolique 3.5.2.1 diauxie 3.5.2.2 AMPc 3.5.2.3 scénarios 3.5.2.4 structure-fonction CRP 3.5.2.5 opérateurs 3.6 récapitulatif 2

Introduction Pourquoi y-a-t-il régulation de l expression des gènes? Pour répondre aux conditions changeantes de l environnement immédiat Sept mécanismes susceptibles de modifier la concentration à l équilibre d une protéine ; Sites possibles de régulation : 1- synthèse du transcrit primaire 2- maturation post-transcriptionnelle de l ARNm 3- dégradation de l ARNm 4- synthèse protéique 5- modifications post-traductionnelles 6- ciblage et transport des protéines 7- dégradation des protéines 3

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Quelques définitions Les séquences codant des produits agissant en trans Les séquences agissant en cis Un locus agit en cis sur un autre locus s il est sur la même molécule d ADN ; L opérateur est un élément d activation en cis car il fonctionne uniquement s il est fixé sur le gène dont il contrôle l expression. Un locus agit en trans s il peut contrôler un autre locus, même à partir d une molécule d ADN différente. Le gène du répresseur du lactose (laci) agit en trans car il peut réguler l expression de l opéron lactose même s il est enlevé du génome d E. coli et placé sur un plasmide. élément régulateur en cis : site pour une protéine de liaison à l ADN, situé le plus souvent, en amont du gène régulé. élément agissant en trans : protéine elle-même, qui diffuse dans la cellule depuis son site de synthèse jusqu à son site de liaison sur l ADN. 5

Quelques définitions (2) Gène structural gène qui code une protéine (ou un ARN) Gène régulateur gène structural qui code une protéine impliquée dans la régulation de l expression d autres gènes. 6

Quelques définitions (3) OPERON Gènes structuraux organisés en groupes contenant des gènes codant des protéines dont les fonctions sont apparentées (gènes co-transcrits pour former une molécule d ARN polycistronique) À côté de ces gènes, on retrouve : - des séquences adjacentes requises pour la transcription (promoteurs, opérateurs) - des séquences impliquées dans la régulation. Exemple : Les gènes des enzymes successives d une voie métabolique 7

Quelques rappels sur l initiation de la transcription chez les procaryotes «Idées fortes» l ARN polymérase copie en ARN un brin du duplex d ADN une unité de transcription est une séquence d ADN transcrite en un ARN unique, qui débute au niveau du promoteur et se termine au terminateur la transcription a lieu dans une «bulle», à l intérieur de laquelle l ARN est synthétisé par appariement des bases avec un brin d ADN de la région transitoirement déroulée au fur et à mesure de la progression de la bulle, le duplex d ADN se reforme après son passage. l ARN polymérase catalyse la formation d une liaison phosphodiester qui résulte d une attaque du groupement 3 -OH du dernier nucléotide de la chaîne sur le groupement 5-triphosphate du nucléotide entrant, ce qui s accompagne d une libération de pyrophosphate la transcription comprend 4 étapes qui impliquent différents types d interactions entre l ARN polymérase et l ADN : 1- reconnaissance de la matrice 2- initiation 3- élongation 4- terminaison le facteur σ contrôle la liaison à l ADN de l ARN polymérase. la reconnaissance du promoteur dépend de séquences consensus. il existe deux modes principaux de terminaison. 8

Promoteurs bactériens : organisation ARN polymérase β 155613 β 150618 σ 70263 α 36512 ω 10105 Schematic representation of the major form of E. coli RNA polymerase bound to DNA. 9

ARN polymérase : organisation - structure 10

INDUCTION régulation de la transcription LORSQUE LE CONTRÔLE DE LA TRANSCRIPTION EST NEGATIF : Répresseur : protéine qui empêche l expression d un gène. Opérateur : site cible de la protéine répresseur. Lorsque la protéine répresseur r se fixe à l opérateur, l ARN l polymérase ne peut plus initier la transcription ce qui empêche l expression l du gène. g En vert : gène régulateur En bleu : gène structural Cas du répresseur lac avec l IPTG p.e. répresseur inducteur répresseur inactif REPRIME INDUIT 11

régulation de la transcription CONTRÔLE NEGATIF DE LA TRANSCRIPTION REPRESSION répresseur actif Répresseur inactif corépresseur INDUIT REPRIME 12

LORSQUE LE CONTRÔLE DE LA TRANSCRIPTION EST POSITIF : régulation de la transcription Un facteur de transcription doit assister l ARN polymérase pour l initiation au niveau du promoteur. INDUCTION ARN polymérase activateur inactif inducteur activateur actif REPRIME INDUIT Cas de la CRP associée au l AMPc 13

régulation de la transcription CONTRÔLE POSITIF DE LA TRANSCRIPTION REPRESSION activateur actif corépresseur activateur inactif INDUIT REPRIME 14

L opéron lac : organisation Opéron lactose 1040 pb 3510 pb 780 pb 825 pb 3 gènes structuraux: z, y & a - codant pour les enzymes impliquées dans le métabolisme du lactose - sont exprimés continuellement à faible taux - sont induits environ 1000 fois quand le lactose est présent - sont modulés par le taux de glucose du milieu laci : un gène adjacent n appartenant pas à l opéron, codant pour le répresseur lac 15

Opéron lactose Lactose Glucose Lactose Glucose Glucose-6P glycolyse Galactose Galactose-1P Glucose-1P Croissance d E. coli sur un mélange de glucose et lactose 16

Les enzymes du métabolisme du lactose sont inductibles Opéron lactose Cinétique d induction de l activité β-galactosidase chez E. coli (d après Cohn, M. J. Bacteriol. (1957) 21, 156) ARNm 2 8 Temps (min) 17

Les inducteurs de l opéron lac Opéron lactose Lactose, (substrate de l opéron), converti en son isomère (par transglycosylation), l allolactose. Allolactose, inducteur naturel (ou inducteur physiologique, isomère du lactose). inducteur gratuit : induit l opéron mais pas métabolisé. Par exemple : isopropylthiogalactoside (IPTG) OH OH OH OH OH O O O HO OH O HO OH OH HO OH O O lactose HO HO OH OH OH O allolactose OH CH 3 HO OH S C H CH 3 IPTG ou isopropylthiogalactoside 18

lacz Opéron lactose code l enzyme β-galactosidase dont la forme active est un tétramère d environ 500kDa Réaction catalysée : coupe les β-galactosides et libère les sucres qui les constituent Exemple : le lactose est hydrolysé en glucose et galactose Equation de la réaction catalysée par la β-galactosidase 19

E2 E1 Opéron lactose Ext. CYCLE de TRANSPORT Membrane Int. lactose H+ E2 E1 H + + lactose E2-H + -lactose E1-H + -lactose 20

Opéron lactose 21

Opéron lactose 22

Opéron lactose RECAPITULATIF mutations O c Les mutations de l opérateur sont constitutives, car le promoteur est incapable de fixer la protéine répresseur; Ceci permet à l ARN polymérase d avoir libre accès au promoteur. Les mutations O c agissent en cis, car elles ne touchent que les gènes structuraux qui leur sont contigus. mutations du type laci - Les mutations qui inactivent le gène laci entraînent l expression constitutive de l opéron, car la protéine du répresseur mutant ne peut plus se fixer sur l opérateur. Les mutations constitutives du gène laci sont récessives. Les mutations non inductibles laci S sont dominantes. 23

Quel est la nature du produit codé par le gène I? Expérience PAJAMO (Pardee AB et al. (1959) J. Mol. Biol. 1, 173) Opéron lactose Conjugaison Hfr I + Z + x F - I - Z - On ne s intéresse qu aux cellules receveuses; les cellules donneuses sont tuées. Démonstration de l existence du répresseur lac : Expérience de conjugaison 24

Fonctionnement de l opéron lac d E. coli en l absence de lactose Opéron lactose La protéine répresseur se fixe à l opérateur et empêche la transcription. L ARN polymérase peut se fixer au promoteur quand le répresseur est présent sur l opérateur mais il ne peut y avoir initiation de la transcription. 25

Fonctionnement de l opéron lac d E. coli en présence de lactose Opéron lactose 26

répresseur lac Répresseur lac (suite) Opéron lactose Le répresseur lac : - un tétramère de sous-unités identiques de 360 résidus disposées selon 3 axes de symétrie d ordre 2, mutuellement complémentaires (chaque sous-unité lie une molécule d IPTG avec une constante de dissociation K = 10-6 M) 1- en l absence d inducteur, liaison non spécifique du répresseur sous forme tétramérique à l ADN double brin (K = 10-4 M) 2- en présence d inducteur, liaison spécifique du répresseur opérateur lac (affinité supérieure K = 10-13 M). Deux domaines fonctionnels pour chaque sous-unité : - un domaine N-terminal de 58 résidus : liaison à l ADN (mais pas à l IPTG) - le restant : liaison à l IPTG. Le répresseur lac trouve l opérateur en se liant de façon non spécifique à l ADN et en diffusant sur sa longueur selon une recherche à une dimension. Le répresseur se fixe à un ADN double-brin contenant la séquence de l'opérateur lac de type sauvage. Le répresseur ne se fixe pas à un ADN de mutant O c. L'addition d IPTG in vitro libère le répresseur de l'adn opérateur. 27

répresseur lac Opéron lactose Pièce maîtresse Fixation à l opérateur cœur Fixation de l inducteur Domaine C-terminal Oligomérisation (Lewis et al. (1996) Science 271, 1247) Structure de la sous-unité du répresseur lac. Il existe plusieurs domaines indépendants dans la molécule. 28

répresseur lac Opéron lactose IMPLICATIONS STRUCTURALES de l INDUCTION Changement de la structure du noyau par l inducteur : les pièces maîtresses d un répresseur ne sont plus dans une orientation qui permet la fixation à l ADN. En bleu : domaine de fixation à l ADN En rouge : hélices α impliquées dans la tétramérisation En vert : sites de fixation de l inducteur En jaune: petites hélices de liaison Structure d un dimère du répresseur lac 29

opérateur Opéron lactose Opérateur lac - l opérateur lac occupe ~ 35 bp - il est situé en aval du promoteur et couvre celui-ci - il présente 2 séquences symétriques (séq. palidromique imparfaite) - ~22 bp sont protégées des nucléases lors d une expérience d empreinte - l affinité du répresseur pour l opérateur est 4x10 6 plus forte que pour une séquence d ADN quelconque Séquence de l opérateur 30

opérateur Interactions entre l opérateur et le répresseur Opéron lactose La séquence des bases de l opérateur lac 31

Opéron lactose résumé Séquence nucléotidique de la région promoteur lac-opérateur lac d E. coli, depuis la région C-terminale de laci (à gauche) à la région N-terminale de lacz. Les séquences palindromiques de l opérateur et le site de liaison de CAP sont surlignées ou soulignées (d après Dickson RC et al., Science 1975 187, 32) Le répresseur et l ARN polymérase se fixent sur des sites qui se chevauchent au niveau du point de départ de l opéron lac. 32

opérateur Opéron lactose L opéron lac comprend 3 sites de fixation pour le répresseur lac. 33

Répression catabolique : mis en évidence Opéron lactose Phénomène de diauxie Le colibacille (E. coli) utilise le glucose du milieu comme source d énergie. Si on remplace le glucose par du lactose, la croissance cesse. La croissance reprend rapidement lorsque les cellules ont produit les enzymes nécessaires à la conversion du lactose en glucose. Quand deux sources de carbone particulière sont présentes ensembles dans le milieu de culture, la courbe de croissance est biphasique : phénomène de diauxie. 34

Répression catabolique Opéron lactose Cinétique de synthèse de l ARNm de l opéron lac suite à l induction par l IPTG puis après addition de glucose. Glucose : métabolite de choix d E. coli 35

Entrée du glucose dans la cellule bactérienne Opéron lactose Glucose Glucose-6-phosphate EN PRESENCE DE GLUCOSE Production d AMPc ACTIVATION de GENES 36

Répression catabolique Opéron lactose CRP (cyclic AMP [camp] receptor protein), également appelée CAP (catabolite activator protein) L AMPc s accumule quand le glucose est absent. Quand le glucose est présent - l adénylate cyclase est inhibée - AMPc phosphodiestérase est activée. glucose - Adénylcyclase AMPc ATP AMPc phosphodiestérase + glucose AMP 37

Répression catabolique Opéron lactose Sucre(s) dans le milieu de culture Quantité relative de β- galactosidase Glucose 1 induction répression Glucose + lactose 50 Lactose 2500 38

Opéron lactose CAP est un régulateur positif et l AMPc la molécule inductrice Le produit du gène I (répresseur lac) est un régulateur négatif; le lactose ou l IPTG la molécule inductrice. 39

CRP Opéron lactose CAP : ce qu il faut retenir 1- active la transcription de plus de 100 promoteurs (facteur de transcription global). 2- protéine d environ 45 kda qui se fixe à l ADN sous la forme d un dimère (2 sousunités identiques. 3- le 1 er des activateurs transcriptionnels a avoir été isolé (1970) et le 1 er pour lequel la structure 3D a été déterminée. 4- en présence d AMPc, forme un complexe (CRP-AMPc) qui se fixe à une séquence cible de 22pb, située près ou au sein du promoteur qu il contrôle 5- active la transcription du fait de contacts protéine-protéine avec l ARN polymérase 40

La protéine CRP : organisation structurale Opéron lactose 41

Opéron lactose La fixation coopérative du répresseur lac entraîne la formation d une boucle sur l ARN. Lac Repressor = tetramer O 1 O 2 42

CRP Opéron lactose Site de fixation de l AMPc-CAP Mutations rendant le promoteur indifférent à CAP A T T A -70-60 -50 5 ATGTGAGTTAGCTCACACATT 3 TACACTCAATCGAGTGTGTAA Axe de symétrie Nucléotides aux contacts de l AMPc-CAP Promoteur 43

Opéron lactose Positions et séquences des 3 opérateurs Effets de mutations sur chacun des 3 opérateurs 44

Opéron lactose Le répresseur lac inhibe la transcription en formant une boucle dans l ADN Différents modèles 1- région promotrice de l opéron lac 2- transcription 3- répression : modèle 1 : fixation du répresseur en O 1 & O 3, promoteur libre, site CAP toujours occupé ARN pol. pas fixée au promoteur 4- répression : modèle 2 : fixation du répresseur lac en O 1 & O 2, site CAP toujours occupé, ARN pol fixée au promoteur mais pas de synthèse d ARN car blocage de l ARN pol. par le répresseur 45

Pour résumer Opéron lactose -en l absence de lactose, une protéine tétramérique, possédant deux sites de fixation à l ADN se fixe, en premier lieu, sur le principal opérateur O 1 puis soit sur O 2 soit sur O 3. Deux des quatre sous-unités du répresseur reconnaissent O 1 ; les deux restantes reconnaissant soit O 2 soit O 3. - en général le répresseur se fixe en O 1 & O 3 provoquant la formation d une structure en boucle de l ADN entre les deux sites ce qui empêche l ARN polymérase de se fixer au promoteur et donc d initier la transcription. - en fait la transcription n est pas complètement bloquée : une faible transcription a lieu même en la présence du répresseur fixé en ses opérateurs. -en présence de lactose, la lactose perméase permet, dans un premier temps, l entrée d une petite quantité de lactose, lequel est transformé en allolactose (un isomère structural du lactose) par la β-galactosidase. - l allolactose se fixe alors en des sites de la protéine répresseur provoquant un changement de conformation de celle-ci ce qui la rend incapable de se fixer aux séquences opérateur. - ainsi, avec l opérateur «libéré» du répresseur, l ARN polymérase peut se fixer à la région promotrice et initier la transcription. 46

α-peptide site actif α-peptide site actif lacz délétion de 90pb lacz ( M15) lacz Protéine dimérique INACTIVE α-complémentation α-peptide Protéine tétramérique ACTIVE Protéine ACTIVE 47