Pharmaco-protéomique Vers l infini et au-delà! Manon Carré INSERM UMR911 Centre de Recherche en Oncologie biologique et Oncopharmacologie (CRO2) manon.carre@univmed.fr
Protéines, protéomique & co Protéome humain = + d 1,2 million de protéines Protéomique = «Analyse des protéines exprimées par une cellule / tissu / organisme àun moment donné» Très variable : reflète l état de fonctionnement d une cellule dans un contexte (environnement, pathologie, traitement )
la protéomique globale permet d identifier toutes les protéines présentes dans un environnement donné (établissement de la cartographie protéique). la protéomique fonctionnelle permet l analyse des complexes protéiques et la recherche de biomarqueurs. la protéomique qualitative permet l identification des modifications post-traductionnelles, et la protéomique quantitative permet l analyse des variations de l abondance des protéines. Protéines, protéomique & co Pourquoi s ints intéresser àla protéomique omique???
Acteurs de la protéomique Protéome : «the PROTEin complement of a genome» 2001, formation de l'organisation du Protéome Humain But : développer l'importance de la protéomique dans le diagnostic, le pronostic et la thérapeutique au travers du Projet du Protéome Humain (HPP) depuis 2009.
Acteurs de la protéomique Oral Sessions (Boston 2012) The Business of Biology:BioPharma / Biotherapeutics Beyond Genomics: Proteomics of Cancers Clinical Insights: Disease Proteomics Personal Proteomics: Diagnostics and Targets
Acteurs de la protéomique Société Française d'electrophorèse et d'analyse Protéomique But : favoriser le développement des techniques et méthodes permettant l'analyse à grande échelle des protéines.
Acteurs de la protéomique Plateau protéomique MaP(Marseille Protéomique). Protéomique clinique (cancer), protéomique quantitative, pharmaco-protéomique, recherche de biomarqueurs Faculté de Pharmacie (Timone) Faculté de Médecine (Nord) Campus CNRS (Joseph Aiguier) CRCM (IPC) CIML (Luminy)
Synopsis
Outils en protéomique : échantillon protéique LYSE : -Mortier -Ultrasons - Lyse enzymatique - Détergents (urée ) - Choc osmotique - Congélation/décongélation ELIMINATION des agrégats (ultracentrifugation), des acides nucléiques (DNAses/RNAses), des protéases (inhibiteurs) et des sels (micro-colonnes)
Outils en protéomique : électrophorèse 2D 1 ère dimension = Iso-Electro Focusing (IEF) Séparation en fonction du point isoélectrique (pi)
Outils en protéomique : électrophorèse 2D
Outils en protéomique : électrophorèse 2D 2 ème dimension = SDS-PAGE Séparation en fonction du poids moléculaire
Outils en protéomique : électrophorèse 2D
Outils en protéomique : électrophorèse 2D Révélation = diverses colorations Sensibilité et linéarité variables Bleu de Coomassie colloïdal (limite 50 ng) Nitrate d argent (limite 0.02 ng)
Outils en protéomique : électrophorèse 2D Fluorescence (limite 1 ng)
Outils en protéomique : digestion in gel Excision des spots et digestion protéique
Outils en protéomique : spectrométrie de masse Technologies MALDIet ESIconnues depuis plusieurs 10aines d années
Outils en protéomique : spectrométrie de masse
Outils en protéomique : spectrométrie de masse SOURCE MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
Outils en protéomique : spectrométrie de masse SOURCE ESI = ElectroSpray Ionization
Outils en protéomique : spectrométrie de masse ANALYSEUR(séparateur d ions) TOF = Time Of Flight
Outils en protéomique : spectrométrie de masse Identification de la protéine par obtention d une empreinte peptidique (MS)
Outils en protéomique : spectrométrie de masse Identification de la protéine par obtention d une empreinte peptidique (MS)
Outils en protéomique : spectrométrie de masse Identification de la protéine par séquençage (MS/MS)
Outils en protéomique : spectrométrie de masse
Le plus lourd du travail! Outils en protéomique : moteurs de recherche
Outils en protéomique : moteurs de recherche Identification des peptides (entiers ou fragmentés) par comparaison avec des banques de données
Application : identification de biomarqueurs 1 gel / condition
Application : identification de biomarqueurs Ex : Cancer de l oesophage Zhou G et al. Mol Cell Proteomics 2002.
Application : identification de biomarqueurs Ex : Leucémies résistantes aux agents anti-microtubules Alterations de la γ-actine Verrills NM et al., J. Nat. Cancer Inst. 2006
Application : identification de biomarqueurs Difficulté: matching des gels entre eux et normalisation par rapport à une référence pour quantifier les variations
Application : identification de biomarqueurs Solution : DIGE= Differential In-Gel Electrophoresis Cy 3 image mix Cy 5 image Cy 2 image
Application : identification de biomarqueurs Solution : DIGE= Differential In-Gel Electrophoresis
Application : identification de biomarqueurs Ex : Leucémies résistantes aux agents anti-microtubules Vert = cellules sensibles Rouge = cellules résistantes Identification de 19 protéines altérées (11 en rapport avec actine) Verrills NM et al., J. Nat. Cancer Inst. 2006
Et en clinique : aussi facile? Protéomes cliniques - Séquences génomiques partielles - Protéomes «contaminés» Déplétion des IgG et albumine Plasma humain non déplété Reproductibilitéindispensable Standards établis par HUPO (2010) après une étude de contrôle-qualité par 27 laboratoires internationaux (échantillons inconnus)
Et en clinique : aussi facile? Etape limitante: validation des biomarqueurs Validation clinique sur des cohortes de population Sur fluides Sur tissus (IHC) Obtention d anticorps spécifiques
Application : établir un diagnostic Diagnostiquer la pathologie le plus tôt possible, de façon sensible (avant même toute modification visuelle?) Diagnostic possible à partir de profils de peptides non identifiés
Application : établir un diagnostic A partir de biopsies Ex : identification de cas de cancers pulmonaires et cérébraux Yanagisawa K et al., Lancet. 2003 Schwartz SA et al., Clin Cancer Res 2004 Moreira JM et al., Mol Oncol 2010 A partir d urine Ex : diagnostic de cancers de l estomac et du rein Rogers MA et al., Cancer Res 2003 Mischak H et al., Adv Chronic Kidney Dis 2010 A partir de sérum Ex : diagnostic de stades I de cancer de l ovaire / sein / prostate Ornstein DK et al., J Urol 2004 Kulasingam V et al., Int j Cancer 2008
Application : établir un diagnostic Lancet 2002 Panel de biomarqueursdéfini sur 50 femmes avec un cancer de l ovaire et 50 femmes non touchées. Utilisation de ce profil protéique pour classifier 116 échantillons en aveugle : 95% de succès dans la discrimination entre cas sains et cancéreux (dont 20 cas de stade I)
Application : personnaliser le traitement Classification fine pour une optimisation du traitement Ex: identification des différents grades de cancers cérébraux et de la prostate Schwartz SA et al. Clin Cancer Res 2004 Skvortsov S et al, J Proteome Res 2010 Ex : classification de cancers du poumon et sein de bons et mauvais pronostics Yanagisawa K et al. Lancet. 2003 Lai TC et al. J Proteome Res. 2010. et suivi des effets du traitement au cours du temps Michlmayr A et al. Br J Cancer. 2010. Thoenes L et al. J Proteomics 2010.
Application : recherche de nouvelles cibles thérapeutiques Biomarqueurs menant au développement de nouveaux médicaments, avec l aide de techniques de biologie structurale et de physicochimie (détermination des domaines d interaction de la protéine cible avec le médicament potentiel )
Application : recherche de nouvelles cibles thérapeutiques
Et maintenant? Puce SELDI-Tof = surface-enhanced
Et maintenant? LC-MS/MS = chromatographie liquide
Et maintenant? DTP = direct tissue proteomics Normal Tumeur Hwang SI et al. Oncogene 2007
Et maintenant? Imagerie MALDI Image MALDI de la tête d un épididyme de rat. Expression différentielle in situ de 3 protéines.
Et maintenant? Imagerie MALDI Coupes de tissus (congelés) Observation au microscope Application de la matrice Balayage MALDI-Tof
Et maintenant? Imagerie MALDI Revue: Wisztorski M et al. Medecine Sciences 2007 m/z 2028 m/z 2092 Images moléculaires reconstruites de la répartition de 2 protéines au sein d une coupe de cerveau de rat
Manon Carré INSERM UMR911 Centre de Recherche en Oncologie biologique et Oncopharmacologie (CRO2) manon.carre@univmed.fr