MUSEUM NATIONAL D HISTOIRE NATURELLE Ecole doctorale Sciences de la Nature et de l Homme - Muséum THESE DE DOCTORAT Discipline : Biologie Moléculaire et Cellulaire des protozoaires Laboratoire de Biologie Fonctionnelle des protozoaires, USM504 Département Régulations, Développement, Diversité Moléculaire, MNHN Approches moléculaires des mécanismes mis en jeu en fin de schizogonie intraérythrocytaire de Plasmodium falciparum (agent du paludisme) par Hybridation soustractive suppressive et Puce à ADN Sébastien CHARNEAU Soutenue le 07 janvier 2005 Composition du Jury : Philippe GRELLIER Directeur de thèse Catherine BRAUN BRETON Rapporteur Vincent ROBERT Rapporteur Stan TOMAVO Examinateur Peter DAVID Examinateur Joseph SCHREVEL Examinateur 1
REMERCIEMENTS Je remercie Mme DEBAY pour avoir répondu à mon désir de DEAtiste d intégrer le laboratoire pour travailler sur le paludisme. Je remercie le Professeur Joseph SCHREVEL, de m avoir accepté comme stagiaire de DEA en janvier 2001 puis comme thésard, et pour avoir défendu la cause des étudiants du MNHN au poste de Directeur de l Enseignement. Je remercie très sincèrement le Professeur Philippe GRELLIER, pour la confiance qu il m a accordé dès le DEA jusqu à aujourd hui, pour avoir favorisé mon autonomie tout en répondant présent quand il le fallait, pour avoir dirigé mon travail de thèse, et pour m avoir permis d aller au Brésil pendant 6 mois sans oublier les vacations dont il m a fait bénéficiées. Mais surtout Philippe, je te remercie d aimer autant ce que tu fais et aussi pour les bons moments partagés en dehors du labo. Je remercie le Docteur Isabelle FLORENT pour avoir tout d abord co-dirigé mon stage de DEA (prémices de ma thèse) puis par la suite pour son sens critique, sa participation à ce travail et la relecture de mon manuscrit et à ses encouragements continus. Je remercie tous les membres du Jury d avoir accepté d évaluer ma thèse, j en suis honoré. Je remercie le Professeur Jaime SANTANA de m avoir permis d effectuer une mission de 6 mois au Brésil dans 3 laboratoires différents de l Université de Brasília, et pour m avoir supervisé ainsi que pour son amitié. Je remercie Antonio TEIXEIRA, Directeur du Laboratorio multidiciplinario de pesquisa da doença de Chagas, pour son accueil. Je remercie le Professeur Bergman RIBEIRO, Directeur du Departamento de Biologia Celular de m avoir enseigner l expression de protéine recombinante dans le système baculovirus/cellules d insecte, et le Professeur Fernando TORRES du Laboratorio de Biologia Molecular de m avoir enseigner l expression de protéine recombinante chez la levure. Je remercie tous les membres de ces équipes que j ai côtoyés. Abraço para tudo mundo, todos meus amigos brasileiros e a família de Izabela. Je remercie la plate-forme Puce à ADN-Plasmodium de l Institut Pasteur où j ai toujours été très bien reçu, dont Peter DAVID et surtout MAnu BISCHOFF pour son travail de qualité, sa persévérance, sa gentillesse et sa disponibilité. Je remercie vivement tous les membres du laboratoire et particulièrement tous ceux de l équipe de Biologie Fonctionnelle des Protozoaires, pour le soutien dont ils m ont fait preuve chaque jour : le Docteur Christiane DEREGNAUCOURT pour nos discussions en salle de culture, Jimmy CASSONE pour sa sincérité, notre précieuse et adorable animalière Nathalie DOGNA, Doanh BACCAM monsieur «Photoshop», Linda KOHL. Je remercie le Docteur Elisabeth MOURAY indispensable au laboratoire, pour sa douceur et pour m avoir aidé à la paillasse dans les moments intenses (immunofluorescence, culture en masse ), Claudine DECUREY surnommée Clo, pour son implication dans ma thèse dont elle a fait preuve lors de son stage de DEST, ainsi que Isabelle BARBOSA, Aïcha IMJAHAD et Rodolphe SUSPENE lors de précédents stages. 2
Enfin je remercie tous les doctorants qui sont très vite devenus de «vrais» amis, ceux sur qui l on peut toujours compter : ma compère depuis le DEA, l irrésistible Carole, ma grande sœur de cœur Cécile, l incontournable Mehdi, mon pote et le docteur Laurent PALKA, le philosophe, toujours prêt à passer un bon moment. Je remercie tous mes proches et ma famille, milles mercis à Camille pour m avoir montré l exemple de ne jamais baisser les bras et pour ses conseils. Merci Papi et Mamie, j aurais tant souhaité que vous soyez présents aujourd hui après tout ce que vous avez fait pour moi, vous me manquez ; Merci Sandrine, grande sœur rêvée, pour ton soutien et ton amour, et toi Esther pour le bonheur que ta naissance m a procuré ; Merci papa pour m avoir encouragé et pour ta fierté à mon égard ; Merci maman pour tout, tout et tout, pour m avoir toujours fait passé en premier encore aujourd hui ; Merci Izabela d être venue me trouver en France, de faire partie intégrante de ma vie, tu as donné un sens à ma vie. 3
SOMMAIRE REMERCIEMENTS...2 SOMMAIRE...4 INTRODUCTION...10 I. LE PALUDISME... 10 II. LA LUTTE ANTIPALUDIQUE, UNE SITUATION D URGENCE... 11 II.1. Les symptômes cliniques du paludisme et physiopathologie :... 11 II.2. Eradiquer le paludisme :... 11 II.2.1. La lutte anti-vectorielle :... 11 II.2.2. Les traitements antipaludiques :... 12 II.2.3. L élaboration de vaccins antipaludiques?... 15 III. BIOLOGIE DU PALUDISME... 16 III.1. Classification phylogénétique de Plasmodium dans le règne animal :... 16 III.2. Cycle biologique de Plasmodium falciparum :... 18 III.2.1. La phase sexuée (gamogonie et sporogonie) chez le moustique :... 18 III.2.2. la phase hépatique (pré- ou exo-érythrocytaire) chez l homme :... 20 III.2.3. la phase intraérythrocytaire chez l homme :... 20 III.2.3.1. L invasion du globule rouge par le mérozoïte :... 20 III.2.3.2. Le stade anneau :... 23 III.2.3.3. Le stade trophozoïte :... 23 III.2.3.4. Le stade schizonte et la différenciation des mérozoïtes :... 25 III.2.3.5. Le mérozoïte :... 26 III.2.3.5.1. Les organites apicaux :... 26 III.2.3.5.2. Le cytosquelette des mérozoïtes :... 29 IV. Organisation génomique de P. falciparum :... 33 IV. Pourquoi étudier l expression des gènes de P. falciparum au cours du développement intraérythrocytaire?... 36 V. OBJECTIFS DE LA THESE :... 38 V.1. Identification de gènes différenciellement exprimés durant la morphogenèse des mérozoïtes intraérythrocytaires par la méthode d hybridation soustractive suppressive :... 38 4
V.2. Exploitation des données, caractérisation d une protéine identifiée, la dynamine 2 homologue de P. falciparum :... 39 V.2.1. la dynamine 2 homologue de P. falciparum :... 39 V.2.2. La famille des dynamines :... 39 V.2.2.1. Découverte :... 39 V.2.2.2. Dynamines conventionnelles :... 42 V.2.2.3. L émergence des protéines apparentées aux dynamines :... 45 V.3. Analyse moléculaire du transcriptome de Plasmodium falciparum modulé par la rottlérine, un inhibiteur de protéine kinase C δ, lors de la différenciation des mérozoïtes, à l aide de puces à ADN :.. 51 MATERIEL ET METHODES...53 I. CULTURE IN VITRO DE PLASMODIUM FALCIPARUM ET SYNCHRONISATION... 53 I.1. Culture in vitro de Plasmodium falciparum :... 53 I.2. Synchronisation des cultures in vitro de Plasmodium falciparum :... 53 II. IDENTIFICATION DE GENES DE PLASMODIUM FALCIPARUM EXPRIMES SPECIFIQUEMENT AU COURS DE LA DIFFERENCIATION DES MEROZOITES PAR LA METHODE D HYBRIDATION SOUSTRACTIVE SUPPRESSIVE... 54 II.1. Extraction des parasites par lyse sélective érythrocytaire et extraction de l ARN total par le «TRIzol LS Reagent» :... 55 II.2. Construction d une banque d ADNc soustraite, spécifique de stade :... 56 II.2.1. Synthèse d'adnc des ARN poly A+ à partir d'une solution d'arn total par «SMART PCR» (CLONTECH ) :... 56 II.2.2. Hybridation soustractive suppressive (SSH) des ADNc digérés :... 58 II.2.3. Analyses de l'efficacité des soustractions expérimentales sens et inverse :... 62 II.2.4. Clonage des produits PCR de la SSH correspondant aux fragments de gènes exprimés différenciellement, basé sur la méthode du «T/A cloning» (CLONTECH ) :... 62 II.2.5. Analyses des clones :... 63 II.2.6. Validation expérimentale de la procédure de SSH par Virtual Northern blot :... 64 III. IDENTIFICATION ET CLONAGE DU GENE DE LA PROTEINE DYNAMINE 2 HOMOLOGUE DE PLASMODIUM FALCIPARUM ET DE LA SEQUENCE 5 CORRESPONDANT A SON DOMAINE N-TERMINAL... 65 III.1. Identification in silico du gène de la protéine dynamine 2 homologue :... 65 III.2. Isolement et clonage du gène dynamine 2 homologue et de son domaine 5 GTPase :... 65 III.2.1. Extraction de l ADN génomique de la souche FcB-1 de P. falciparum :... 65 III.2.2. Amplification du gène dynamine 2 homologue et de son domaine 5 GTPase :... 66 III.3. Organisation génomique du gène dynamine 2 homologue de P. falciparum :... 67 5
IV. CLONAGE DANS LE VECTEUR pet-22b ET EXPRESSION DES PROTEINES RECOMBINANTES DYNAMINE 2 HOMOLOGUE DE P. FALCIPARUM ET DE SON DOMAINE N- TERMINAL CHEZ E. COLI... 67 IV.1. Clonage du gène de la protéine dynamine-2 homologue et de son domaine 5 dans le vecteur pet- 22b :... 67 IV.2. Expression des protéines recombinantes dynamine 2 homologue (rpfdyn2) et de son domaine N- terminal (rpfdyn2nter) chez E. coli :... 68 IV.3. Purification en conditions dénaturantes de H 6 rpfdyn2nter par affinité au nickel et production d antisérum :... 68 V. CLONAGE DANS LE VECTEUR pet-15b ET EXPRESSION DES PROTEINES RECOMBINANTES DYNAMINE 2 HOMOLOGUE DE P. FALCIPARUM ET DE SON DOMAINE C- TERMINAL CHEZ E. COLI... 69 IV.1. Clonage du gène de la protéine dynamine 2 homologue et de son domaine 3 GED dans le vecteur pet-15b :... 69 V.2. Expression des protéines recombinantes dynamine 2 homologue (rpfdyn2) et du domaine C- terminal GED (rpfdyn2cter) chez E. coli :... 70 V.3. Purification en conditions dénaturantes de la H 6 rpfdyn2 et de la H 6 rpfdyn2cter par affinité au nickel et production d antisérum :... 70 V.4. Purification en conditions natives de H 6 rpfdyn2 :... 71 VI. EXPRESSION DE LA PROTEINE RECOMBINANTE DYNAMINE 2 DE P. FALCIPARUM DANS LE SYSTEME BACULOVIRUS/CELLULES D INSECTE... 72 VI.1. Baculovirus Expression Vectors :... 73 VI.1.1. Clonage du gène Pfdyn2 dans le plasmide psynxiv VI + X3 :... 73 VI.1.2. Cotransfection des cellules d insecte (TN5B) par les ADN viral et plasmidique :... 73 VI.1.3. Clonage et amplification du stock viral :... 74 VI.2. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System :... 75 VI.2.1. Clonage du gène Pfdyn2 dans le plasmide pfast-hta :... 75 VI.2.2. Obtention du bacmide recombinant :... 75 VI.2.3. Transfection des cellules d insecte (TN5B) par le bacmide recombinant :... 76 VI.3. Optimisation de la production de H 6 rpfdyn2 dans les 2 systèmes d expression baculovirus/cellules d insecte :... 76 VI.3.1. Profil d expression au cours du temps :... 76 VI.3.2. Influence du MOI sur la production :... 76 VI.4. Purification en conditions natives de H 6 rpfdyn2 par affinité au nickel :... 77 VII. CARACTERISATION DE LA PROTEINE RECOMBINANTE DYNAMINE 2 DE P. FALCIPARUM... 77 VII.1. Test de sédimentation comme mesure de l auto-assemblage de H 6 rpfdyn2 :... 77 VII.2. Test d accrochage du GTP :... 78 6
VII.3. Test d activité enzymatique d hydrolyse du GTP :... 78 VIII. EXPRESSION DE PfDYN2 AU COURS DU CYCLE INTRA-ERYTHROCYTAIRE... 79 IX. LOCALISATION SUBCELLULAIRE DE PfDYN2... 79 IX.1. Immunolocalisation cellulaire au cours du cycle érythrocytaire :... 79 IX.2. Effets des inhibiteurs du trafic cellulaire :... 80 X. MODULATION DE L EXPRESSION DES GENES INDUITE PAR LA ROTTLERINE LORS DE LA DIFFERENCIATION DES MEROZOITES DE PLASMODIUM FALCIPARUM ANALYSEE À L AIDE DE PUCES À ADN... 80 X.1. Traitement in vitro des parasites par la rottlérine :... 81 X.2. Préparation des ARN pour l analyse par puces à ADN :... 82 X.3. Puces à ADN à la Génopole de l Institut Pasteur de Paris :... 82 X.3.1. Préparation des puces :... 82 X.3.2. Préparation des sondes d ADNc marquées aux cyanines Cy5 et Cy3 :... 83 X.3.3. Hybridation des puces par les sondes d ADNc marquées aux cyanines :... 83 X.3.4. Analyses statistiques des signaux fluorescents :... 85 X.3.5. Analyses bioinformatiques des gènes régulés dans cette étude :... 86 RESULTATS...87 I. IDENTIFICATION DE GENES DE PLASMODIUM FALCIPARUM EXPRIMES SPECIFIQUEMENT AU COURS DE LA DIFFERENCIATION DES MEROZOITES PAR LA METHODE D HYBRIDATION SOUSTRACTIVE SUPPRESSIVE... 87 I.1. Préparation de l ARN total issu des deux populations parasitaires :... 87 I.2. Synthèse des ADNc des ARN poly A+ des deux populations :... 90 I.3. Construction d une banque d ADNc soustraite, spécifique de stade :... 92 I.3.1. Digestion par l enzyme de restriction Rsa I :... 92 I.3.2. Ligation des adaptateurs :... 94 I.3.3. Hybridation soustractive :... 97 I.3.3.1. Première hybridation, enrichissement des séquences différenciellement exprimées :... 97 I.3.3.2. Deuxième hybridation, préparation des matrices d ADNc doubles brins des séquences exprimées différenciellement pour l amplification par PCR :... 97 I.3.4. Amplification des ADNc spécifiques de stade par PCR suppressive sélective :... 98 I.4. Obtention et exploitation d une banque d ADNc spécifiques de la différenciation des mérozoïtes :... 100... 101... 101 METABOLISME DES ACIDES NUCLEIQUES...101 7
PF10_0368... 101 MAL6P1.147... 101 I.4.1. Les gènes connus :... 102 I.4.2. Les gènes non décrits :... 103 I.4.2.1. Les gènes «putatifs» :... 103 I.4.2.2. Les gènes «hypothétiques» :... 104 I.5. Validation expérimentale de la procédure de SSH par Virtual northern blot :... 104 I.6. Validation de notre approche par comparaison aux autres approches publiées :... 107 I.7. Localisations proposées des protéines connues et «putatives» identifiées :... 109 II. EXPLOITATION DES RESULTATS DE LA TECHNIQUE DE SSH : ETUDE DE LA PROTEINE DYNAMINE 2 HOMOLOGUE DE PLASMODIUM FALCIPARUM... 111 II.1. Caractérisation du gène complet de la dynamine 2 homologue de P. falciparum, Pfdyn2 :... 111 II.2. Organisation génomique du gène Pfdyn2 de P. falciparum :... 115 II.3. Production dans le vecteur pet-22b des protéines recombinantes de la dynamine 2 et de son domaine GTPase N-terminal chez E. coli :... 117 II.3.1. Clonage de Pfdyn2 et de son domaine 5 dans le vecteur d expression pet-22b :... 117 II.3.2. Expression des protéines recombinantes de la dynamine 2 (rpfdyn2) et de son domaine GTPase N-terminal (rpfdyn2nter) chez E. coli :... 117 II.4. Production dans le vecteur pet-15b des protéines recombinantes de la dynamine 2 et de son domaine C-terminal GED chez E. coli :... 119 II.4.1. Clonage de Pfdyn2 et de son domaine 3 dans le vecteur d expression pet-15b :... 119 II.4.2. Expression des protéines recombinantes de la dynamine 2 (H 6 rpfdyn2) et de son domaine C- terminal GED (H 6 rpfdyn2cter) chez E. coli :... 120 II.5. Expression soluble et purification en condition native de PfDYN2 recombinante :... 122 II.5.1. Expression soluble de H 6 rpfdyn2 chez E. coli :... 122 II.5.2. Expression de H 6 rpfdyn2 chez Pichia pastoris :... 123 II.5.3. Expression de H 6 rpfdyn2 par le système Baculovius/cellules d insecte :... 123 II.6. Caractérisation biochimique de la PfDYN2 recombinante purifiée :... 125 II.6.1. Etude de l auto-assemblage dépendant du NaCl de H 6 rpfdyn2 :... 125 II.6.2. Capacité de lier le GTP :... 126 II.6.3. Activité GTPasique :... 127 II.7. Expression de PfDYN2 au cours du cycle intraérythrocytaire :... 128 II.8. Localisation cellulaire de PfDYN2 :... 129 III. MODULATION DE L EXPRESSION DES GENES INDUITE PAR LA ROTTLERINE LORS DE LA DIFFERENCIATION DES MEROZOITES DE PLASMODIUM FALCIPARUM ANALYSEE À L AIDE DE PUCES À ADN... 131 III.1. Contexte scientifique, identification de la rottlérine comme inhibiteur de la morphogenèse des mérozoïtes :... 131 8
III.2. Analyse expérimentale de l effet de la rottlérine sur le transcriptome au moment de la différenciation des mérozoïtes à l aide de puces à ADN :... 134 III.2.1. Préparation de l ARN total issus de chaque population parasitaire :... 134 III.2.2. Analyses des gènes dont l expression est modulée par la rottlérine :... 135 III.2.2.1. Les gènes surexprimés en présence de rottlérine :... 138 III.2.3. Les gènes sous exprimés en présence de rottlérine :... 140 DISCUSSION ET PERSPECTIVES...141 I. LES GENES DE PLASMODIUM FALCIPARUM EXPRIMES AU COURS DE LA DIFFERENCIATION DES MEROZOITES...142 II. L ETUDE DE LA DYNAMINE 2 HOMOLOGUE DE PLASMODIUM FALCIPARUM PF10_0368. 148 II.1. Introduction :... 148 II.1. Analyse de la séquence protéique de PfDYN2 :... 148 II.2. Les protéines apparentées aux dynamines chez les Apicomplexa :... 149 II.2.1. Existe-t-il d autres protéines plasmodiales apparentées aux dynamines :... 149 II.2.2. Les protéines apparentées aux dynamines chez les autres Apicomplexa :... 151 II.3. Analyses phylogénétiques :... 151 II.4. Propriétés et rôle biologique de PFDYN2 :... 154 III. MODULATION DE L EXPRESSION DES GENES INDUITE PAR LA ROTTLERINE LORS DE LA DIFFERENCIATION DES MEROZOITES DE PLASMODIUM FALCIPARUM ANALYSEE À L AIDE DE PUCES À ADN... 158 BIBLIOGRAPHIE...161 ARTICLE...185 9
INTRODUCTION I. LE PALUDISME Le paludisme (ou malaria) est, de par le monde, la parasitose qui provoque la plus grande mortalité chez l homme. C est une endémie majeure dans plus de 90 pays, localisés principalement dans les régions tropicales et subtropicales, soit environ 40% de la population mondiale à risque d infection (Figure 1A). On pensait à l origine que cette maladie provenait des zones marécageuses, d où le nom dérivé de l ancien nom des marais, «palud». L agent pathogène, la véritable cause, est un protozoaire parasite du genre Plasmodium, transmis à l humain par le moustique femelle du genre Anopheles. Des quatre espèces parasites de l homme : P. falciparum, P. vivax, P. ovale et P. malariae, P. falciparum est celle qui cause la majorité des cas d infection (environ 250 millions sur les 300 à 500 millions de cas cliniques par an). Elle engendre à elle seule une forte mortalité annuelle avec 1,1 million de décès sur un total de 1,5 à 2,7 millions pour les quatre espèces, dont 90% en Afrique subsaharienne. Elle touche de plus majoritairement les enfants de moins de 5 ans (1997); Hwww.who.intH). Le paludisme affecte principalement les pays les plus démunis. Les fortes morbidité et mortalité observées peuvent être attribuées au manque d accès aux traitements efficaces. 60% des décés liés au paludisme ont lieu dans 20% de la population mondiale la plus démunie (Suh et al., 2004). En plus des enfants, les femmes enceintes (particulièrement les primipares) et les personnes non immunes (comme les voyageurs, les travailleurs étrangers) sont les plus atteints par la forme sévère de cette maladie. Cependant, tous les groupes d âge peuvent être à risque durant les épidémies du paludisme qui surviennent lors de changements physiques environnementaux, augmentant la transmission (variations climatiques, exploitations agricoles ou minières, par exemple) ou lors de déplacements de population, exposant les personnes non immunes aux infections (catastrophes naturelles, guerres ). La situation est d autant plus alarmante qu il y a, depuis les années 1970, d une part, une recrudescence de la chimiorésistance de P. falciparum à la plupart des antipaludéens actuellement disponibles (Peters, 1998; Rathod et al., 1997) (Figure 1B) et d autre part, une recrudescence de la chimiorésistance des moustiques vecteurs aux insecticides. Cette maladie est de plus une cause importante d incapacité de travail et de dégradation physique et morale ; les conséquences économiques se chiffrent par un manque à gagner de plusieurs milliards de 10
dollars par an pour les pays où règne cette épizootie. 12 milliards de dollars ($ USA) des revenus économiques sont estimés être annuellement perdus en Afrique à cause du paludisme. II. LA LUTTE ANTIPALUDIQUE, UNE SITUATION D URGENCE II.1. Les symptômes cliniques du paludisme et physiopathologie : Les symptômes du paludisme apparaissent une dizaine de jours après infection lors d un repas sanguin d un moustique vecteur infecté par le Plasmodium. En général, le paludisme s accompagne dans un premier temps de fièvres, vomissements, céphalées et autres symptômes de type «grippaux». Le parasite lors de son développement intraérythrocytaire lyse les globules rouges provoquant des anémies et de l ictère (coloration jaunâtre de la peau due à un taux élevé de bilirubine dans le sang, substance pyrogène). L obstruction par les globules rouges parasités des capillaires sanguins qui alimentent des organes vitaux tel que le cerveau, conduit au paludisme cérébral, neuroméningite pour P. falciparum, pouvant conduire à la mort. Des perturbations métaboliques et hydroélectrolytiques ainsi que des modifications de l'immunité sont également observées. P. malariae, quant à lui, peut également entraîner des néphroses dues au dépôt glomérulaire de complexes immuns. Dans la rate et parfois le foie, une hyperplasie des cellules macrophagiques destinées à la phagocytose des hématies parasitées est observée, aboutissant à une hépato-splénomégalie clinique. Chez la femme enceinte, le paludisme est grave tant pour la mère que pour le fœtus provoquant avortement, mort néonatale ou naissance prématurée. II.2. Eradiquer le paludisme : L un des principaux problèmes que pose la lutte antipaludique est la pharmacorésistance tant du parasite que de son vecteur. II.2.1. La lutte anti-vectorielle : Le contrôle des moustiques vecteurs par l utilisation d insecticides, s avère être la plus populaire et la moins onéreuse des approches (White, 1999). Cependant, les vecteurs Anopheles montrent une remarquable capacité à développer une forte et rapide résistance aux 11
insecticides utilisés. Il existe plus de 55 espèces d Anopheles résistantes. L exemple le plus marquant est sans nul doute l utilisation abusive et non rationnelle du DDT (dichlorodiphénil-trichloroéthane) en pulvérisation pendant les années 1950 et 1960, qui avait certes permis de quasiment éradiquer ce fléau dans certaines régions du monde mais qui a engendré des dérèglements écologiques considérables et surtout l émergence d espèces d Anopheles résistantes au DDT. Son emploi est désormais déconseillé (Collins et al., 2000). Toutefois l utilisation de moustiquaires imprégnées d insecticides, comme les dérivés pyréthroïdes qui ont une faible toxicité sur les mammifères et une rapidité d action, reste un moyen de contrôle efficace bien que des résistances à ces insecticides soient rencontrées (Collins et al., 2000). L assainissement des zones humides et l assèchement des terres marécageuses constituent des moyens de contrôle complémentaires pour l éradication des gîtes larvaires aquatiques (www.who.int). Le séquençage récent du génome d Anopheles gambiae (Holt et al., 2002) permet d espérer avoir une meilleure connaissance des mécanismes de résistances du moustique aux insecticides afin de pouvoir les contourner, de même qu une meilleure connaissance des interactions du Plasmodium avec son vecteur et ainsi, pourquoi pas, d envisager le développement de moustiques transgéniques réfractaires au parasite. II.2.2. Les traitements antipaludiques : De part son faible coût, sa forte efficacité et ses effets secondaires réduits, la chloroquine a été l antipaludique de première intention ces cinquante dernières années. Mais une utilisation abusive et non contrôlée a résulté, dès les années 60, à l émergence de souches de parasites résistantes à ce médicament (Olliaro et al., 1996). Cette situation a nécessité le développement de nouveaux antipaludiques. Quatre grands groupes de médicaments sont actuellement disponibles, pour la plupart desquels, malheureusement, l on observe une émergence progressive de résistances. 1- La chloroquine appartient à la famille des quinolines devant leur origine à la quinine (un ingrédient actif de l écorce de quinquina utilisé dès 1820 dans le traitement et la prévention des fièvres), avec la quinidine, l amodiaquine, la méfloquine, et l halofantrine. Ce sont des médicaments schizonticides puisqu ils ciblent les formes érythrocytaires asexuées. Classiquement ces molécules tuent les stades dégradant activement l hémoglobine. L hème, le produit d hydrolyse de l hémoglobine est toxique pour le parasite. Celui-ci a développé un processus original de détoxification par polymérisation de l hème sous la forme d un cristal 12
inerte et non toxique, l hémozoïne. Ce processus a lieu dans la vacuole digestive et est inhibé par les dérivés des quinolines (Slater, 1993; Sullivan et al., 1998). Il est à noter que la primaquine possède de plus une activité gamétocytocide et tue les formes hépatiques chroniques de P. vivax et P. ovale dues aux formes latentes des parasites de ces deux espèces (les hypnozoïtes) (Dollery, 1999). La résistance à la chloroquine est principalement liée à des mutations sur un transporteur de la membrane de la vacuole digestive (PfCRT, Chloroquine Resistance Transporter) dont on ne connaît pas pour l instant le rôle biologique (Martin and Kirk, 2004). Des mutations sur le gène Pfmdr1 (MultiDrug Resistance) dont le produit est un transporteur de la vacuole digestive impliqué dans l efflux de xénobiotiques, ont également été impliquées, mais ne semblent pas être la cause principale de la résistance à la chloroquine (Reed et al., 2000). La méfloquine et l halofantrine sont encore actives contre les souches résistantes à la chloroquine bien que des résistances apparaissent pour chacune d entre elles. Cette résistance est clairement associée à des mutations du gène Pfmdr1 (Kim et al., 2001). 2- L artémisinine et dérivés (artéméther, artééther, artésunate ) appartiennent à la classe chimique des sesquiterpènes lactones possédant un pont endopéroxyde très réactif, responsable de l activité antipaludique par génération, dans la vacuole digestive, de radicaux libres, et par alkylation de l hème et de protéines parasitaires. L artémisinine est un produit naturel issu de la plante Artemisia annua utilisée dans la pharmacopée chinoise depuis plusieurs siècles sous le nom de Qin Ghao. L artémisinine présente une action rapide sur les souches résistantes à la chloroquine et est de plus en plus utilisée depuis une vingtaine d années (Li and Wu, 1998). Elle présente également une activité gamétocytocide. Elle est cependant peu stable et possède une courte durée de vie plasmatique ainsi qu une faible solubilité, ce qui limite son utilisation. Cependant, des dérivés plus stables et solubles ont été produits comme l artéméther, l artééther et l artésunate qui gardent la forte efficacité antipaludique de l artémisinine. Il ne semble pas y avoir encore de résistance «vraie» à cette famille de molécules. Les échecs thérapeutiques observés résulteraient plutôt d une posologie inadaptée ou d un suivi incorrect du traitement, ou encore d une métabolisation plus importante chez certains individus. 3- Les antifoliques (sulphadoxine et dapsone), les antifoliniques (pyriméthamine et proguanil) et l atovaquone forment un groupe de médicaments dont le mode d action est mieux connu, ce sont des médicaments anti-métaboliques. Ces composés ont été générés à partir des connaissances acquises sur le métabolisme du Plasmodium. Ils tuent diverses 13
formes plasmodiales, formes érythrocytaires asexuées, formes hépatiques, voire les gamétocytes pour la pyriméthamine. Les antifoliques sont des analogues de substrats qui inhibent l enzyme dihydroptéroate synthétase impliquée dans la première étape de synthèse de l acide folique. Cette voie métabolique est essentielle pour la synthèse de l ADN parasitaire. Les antifoliniques inhibent l enzyme dihydrofolate réductase, impliquée dans la deuxième étape de biosynthèse de l acide folique. L atovaquone interfère avec le transport mitochondrial d électrons en mimant l ubiquinone (CoQ), un intermédiaire redox du complexe mitochondrial cytochrome B-C1 (Fry and Pudney, 1992). L émergence de résistances à ces molécules a été observée très rapidement et résulte de mutations sur les gènes dont les produits sont ciblés par ces molécules (dihydrofolate réductase, dihydroptéroate synthase et cytochrome B). 4- Les antibiotiques agissant sur la synthèse de protéines bactériennes tels que la tétracycline, la doxycycline et la clindamycine, inhibent la croissance du parasite et sont de plus en plus utilisés en combinaison avec d autres traitements antipaludiques pour augmenter leur activité. Ces antibiotiques auraient pour cibles, chez Plasmodium, la mitochondrie ou l apicoplaste, un organite d origine algale qui résulterait d un processus d endosymbiose secondaire (Fichera and Roos, 1997). Afin d éviter l émergence de nouvelles souches résistantes à toutes ces molécules, les traitements sont actuellement administrés par combinaison de deux molécules comme les couples atovaquone/proguanil ou sulphadoxine/pyrimethamine (Looareesuwan et al., 1999). De même, afin de limiter l émergence de résistances aux dérivés de l artémisinine, ceux-ci ne sont pas utilisés seuls mais en combinaison. Par exemple, la combinaison artésunate et méfloquine est recommandée dans une grande partie de la Thaïlande (Brockman et al., 2000). Comme les résistances n ont cesse d augmenter, il faut sans relâche renouveler la panoplie de médicaments antipaludiques, ce qui n est pas sans difficultés. Plusieurs voies de développement de nouvelles molécules antipaludiques sont actuellement explorées par : 1- Synthèse d inhibiteurs spécifiques de cibles thérapeutiques potentielles identifiées par l avancement des connaissances sur la biologie du parasite ; 2- Criblage «empirique» de molécules naturelles ou de synthèses (chimie combinatoire) ou par criblage orienté (approche éthnopharmacologique) ; 14
3- Modification de molécules antipaludiques déjà connues afin d améliorer leurs activités antipaludiques, leurs biodisponibilités (dérivés de l artémisinine) ou de diminuer leurs toxicités pour l homme (dérivés de l amodiaquine). II.2.3. L élaboration de vaccins antipaludiques? La vaccination reste la solution idéale pour lutter contre le paludisme. Cependant, il n existe pas à ce jour de vaccin efficace contre le Plasmodium. La conception d un vaccin antipaludique se heurte à de nombreuses complications liées à la complexité du cycle biologique du parasite et au fait que le parasite a développé de nombreux mécanismes d échappement au système immunitaire de l hôte. En effet, durant la quasi-totalité de son cycle de vie, le parasite a un développement intracellulaire évitant ainsi une exposition prolongée au système immunitaire. Les formes libres, sporozoïtes et mérozoïtes, ne sont présentes dans la circulation sanguine que quelques minutes. De surcroît, il existe un polymorphisme génétique important pour les antigènes de surface (au niveau de la membrane de l hématie parasitée) entre différents isolats mais également au sein d un même isolat. Une diversité antigénique est également observée selon les stades de développement du parasite. Des réponses immunitaires efficaces ont été obtenues contre des antigènes spécifiques de stade, mais malheureusement ces réponses sont restreintes au complexe majeur d histocompatibilité (Doolan and Hoffman, 2000; Richie and Saul, 2002). Plusieurs observations sont cependant encourageantes : 1) des immunisations avec des sporozoïtes irradiés protègent partiellement des mammifères de la maladie (Clyde, 1990) (Egan et al., 1993) ; 2) des personnes infectées de façon répétée peuvent développer une immunité partielle acquise naturellement, mais celle-ci n est pas conservée si l individu n est pas soumis à une infection récurrente (Hoffman et al., 1987); 3) des essais chez les mammifères de vaccins anti-sporozoïtes ou contre les stades sanguins asexués ont montré des signes de protection, bien que partielle (Kester et al., 2001; Stowers et al., 2001). Au vu de ces difficultés, le vaccin idéal serait un vaccin multivalent dirigé contre des antigènes invariants des différentes formes du parasite (stade hépatique, stade intraérythrocytaire et gamétocyte) afin de limiter la transmission et les rechutes observées pour P. vivax et P. ovale. Ce vaccin idéal devrait de surcroît être efficace contre les différentes espèces de Plasmodium infectant l homme. Pour cela, des approches alternatives de vaccins multivalents basés sur de l ADN sont à l étude (Doolan et al., 1998; Richie and Saul, 2002). 15
L émergence dramatique de résistances aux antipaludiques disponibles et les difficultés de mise au point de procédés immunoprophylatiques efficaces, nécessitent un développement urgent de nouveaux moyens de lutte. La définition de nouvelles stratégies thérapeutiques ne peut se faire que par une meilleure connaissance de la biologie du parasite et des interactions qu il développe avec son hôte. III. BIOLOGIE DU PALUDISME III.1. Classification phylogénétique de Plasmodium dans le règne animal : Il y a des dizaines d espèces identifiées de Plasmodium qui infectent différentes espèces de vertébrés (mammifères, rongeurs, sauriens, oiseaux). P. falciparum a été découvert par Welch en 1897 (Mohan, 1955). Dans le règne animal, le genre Plasmodium est classifié de la sorte : - HEucaryoteH Chatton, 1925 Présence d un noyau «vrai» dans la cellule - Phylum des HAlveolatHa Cavalier-Smith, 1992 Présence d un système de structure en forme de sacs (alveoli) à la surface interne de leur membrane plasmique - Sous phylum des HApicomplexaH (Sporozoan) Levine, 1970 Caractérisé par un complexe apical dans la cellule : anneaux polaires, rhoptries, micronèmes, granules denses microtubules subpelliculaires - Classe des HAconoidasidaH (Aconoidina, Haematozoea) Vivier, 1982 Absence de conoïde, excepté dans l ookinète de quelques espèces. - Ordre des HaemosporidaH Danilewsky, 1885 Développement indépendant du macrogamonte et du microgamonte - Famille des HPlasmodiidaeH Agent du paludisme et de maladies similaires - Genre Plasmodium Laveran, 1882 agent du paludisme 16
Zones de transmission palustre Zones Zones à risques à risques limités de limités transmission de transmission Zones Zones sans paludisme sans paludisme Figure 1A. Répartition du paludisme dans le monde (2001 ; Hwww.who.intH) Figure 1B. Zones de résistance aux antipaludéens (2001 ; Hwww.who.intH) 17
III.2. Cycle biologique de Plasmodium falciparum : P. falciparum est un sporozoaire hématozoaire dixène endoparasite d un mammifère réservoir : l homme, pour la phase de reproduction asexuée, l hôte intermédiaire (organisme dans lequel le parasite effectue obligatoirement une partie de son développement) ; et d un insecte hématophage vecteur : le moustique femelle du genre Anopheles (Diptère), pour la phase de reproduction sexuée, l hôte définitif (organisme hébergeant le parasite adulte où se produit la reproduction sexuée). Le cycle de vie de ce parasite est composé de trois grandes phases représentées Figure 2 : III.2.1. La phase sexuée (gamogonie et sporogonie) chez le moustique : Il existe environ 400 espèces du genre Anopheles (Meigen, 1818), dont seule une soixantaine est vecteur du paludisme. Ces diptères sont fortement anthropophiles, localisés dans les zones humides et chaudes, et dont la répartition dépasse largement les zones d endémie palustre. Seule la femelle hématophage qui pique la nuit, peut transmettre le parasite. Suite à l ingestion des formes sexuées du parasite (gamétocytes) par le moustique lors de son repas sanguin, le Plasmodium passe en 24 heures par des étapes de production rapide de gamètes, de fécondation, et de transition du zygote en ookinète libre (gamogonie). Les ookinètes échappent à l environnement hostile du tube digestif en traversant l épithélium intestinal. Logés sous la lame basale, à l extérieur du tube digestif du côté de l hémolymphe, les ookinètes maturent en oocystes. Ceux-ci, après méiose et mitoses multiples, vont produire des milliers de sporozoïtes mobiles (cellules effilées de 10 à 11 µm de long pour un diamètre de 1 µm) qui vont gagner les glandes salivaires par un tropisme encore inconnu (sporogonie). La durée de cette phase chez le moustique est d une quinzaine de jours. Un moustique infesté le reste toute sa vie. 18
ANOPHELES FEMELLE 1. Phase sexuée Gamogonie Sporogonie 2. Phase hépatique HUMAIN Schizogonie 3. Phase intraérythrocytaire Figure 2. Cycle biologique de Plasmodium falciparum (d après Schrével et al.) 1. Reproduction sexuée chez le vecteur : l Anophèle femelle 1. Gamétogenèse femelle ; 2. Microgamétogenèse mâle ; 3-4. Fécondation ; 5. Zygote mobile (ookinète) ; 6-9. Schizogonie dans l ookinète ; 10. Libération et migration des sporozoïtes vers les glandes salivaires de l Anophèle ; 11-12. Libération des sporozoïtes des glandes salivaires, lors de la piqûre du vecteur. Reproduction asexuée chez l homme - 2. Phase hépatique : 12. Migration du sporozoïte de la circulation sanguine vers l hépatocyte ; 13. Transformation du sporozoïte en croissance, le trophozoïte ; 14-15. Schizogonie exo-érythrocytaire ; 16-17. Libération des 20 à 30000 mérozoïtes exoérythrocytaires dans la circulation sanguine. - 3. Phase intra-érythrocytaire : 17. Invasion du globule rouge par un mérozoïte ; 18-20. Croissance du trophozoïte ; 21-24. Schizogonie érythrocytaire ; 24. Stade schizonte mature (rosace) ; 25. Différenciation d un microgamonte mâle ; 26. Différenciation d un macrogamonte femelle. 19
III.2.2. la phase hépatique (pré- ou exo-érythrocytaire) chez l homme : Plusieurs centaines de sporozoïtes sont inoculés à l homme avec la salive du moustique femelle lors de la piqûre. Du sang, ils envahissent en moins d une heure les cellules hépatiques, perdent leur complexe apical, se différencient en trophozoïtes (forme de croissance), puis en schizontes qui subissent plusieurs cycles de réplication de l'adn pour générer en deux semaines environ 30 000 nouvelles formes infectantes, les mérozoïtes exoérythrocytaires (cellules ovoïdes de 1,5 à 2 µm de long pour un diamètre de 1 µm), libérés dans la circulation sanguine. III.2.3. la phase intraérythrocytaire chez l homme : Les mérozoïtes libérés des hépatocytes envahissent les hématies. Le parasite se multiplie pour donner naissance de 16 à 24 nouveaux mérozoïtes en 48 heures, qui, après lyse de l'hématie, peuvent initier un nouveau cycle intra-érythrocytaire. Ce cycle peut être divisé en stades distincts selon des critères morphologiques, biochimiques et moléculaires (Arnot and Gull, 1998; Bannister et al., 2000; De Rojas and Wasserman, 1985). III.2.3.1. L invasion du globule rouge par le mérozoïte : L invasion du globule rouge par un mérozoïte, décrite pour la première fois au niveau ultrastructural par (Ladda et al., 1969), se déroule en une trentaine de secondes (Dvorak et al., 1975), impliquant une reconnaissance cellulaire, une réorientation, l attachement du mérozoïte et enfin une internationalisation par glissement du mérozoïte à l intérieur du globule rouge accompagnée de la formation d une vacuole parasitophore (Figure 3). 1- Reconnaissance, réorientation et attachement du mérozoïte : Le contact mérozoïte/globule rouge s effectue par n importe quel point de la surface du mérozoïte et implique le manteau filamenteux de surface (Dvorak et al., 1975). Cette adhésion initiale est réversible (Bannister and Dluzewski, 1990). Puis, le mérozoïte se réoriente perpendiculairement à la surface du globule rouge afin de présenter son complexe apical en contact avec la membrane de l érythrocyte formant un accolement irréversible (Aikawa et al., 1978). Le parasite peut ainsi sécréter le contenu des micronèmes et des 20
rhoptries et former une jonction annulaire mobile avec la membrane du globule et rouge (Bannister and Mitchell, 1989). D un point de vu moléculaire, il est aujourd hui clair que le parasite établit de multiples interactions du type ligand-récepteur dont certains déterminants commencent à être identifiés comme les protéines de surface du mérozoïte (la famille des protéines MSP) qui sont synthétisées sous forme de précurseurs maturés par protéolyse et dont les produits peptidiques sont localisés à la surface du mérozoïte. De même, le mérozoïte exprime plusieurs protéines de micronèmes, membres de la famille ebl (erythrocyte-binding-like), qui lient des glycoprotéines spécifiques sur la surface de l érythrocyte, telles que EBA-175 versus glycophorine A (Pandey et al., 2002), EBA-140 (ou Bael) versus glycophorine C (Maier et al., 2003) et EBA-181 (ou Jesbl) versus un récepteur résistant à la trypsine, sensible à la neuraminidase (Gilberger et al., 2003) et peut être la glycophorine B (Gaur et al., 2003). Une autre famille de protéines qui semble être impliquée dans la réorientation, est la famille de protéines PfRBP (P. falciparum reticulocyte-binding-like), qui proviendrait des rhoptries (Rayner et al., 2000). 2- Internationalisation du mérozoïte : Contrairement aux réticulocytes, les hématies n effectuent pas d endocytose, et les mécanismes d internationalisation du mérozoïte sont d un autre ordre, c est une entrée active. La pénétration du parasite dans la cellule hôte a lieu après initiation de la jonction serrée. Cette jonction est mobile. Elle apparaît entre le pôle antérieur du mérozoïte et l érythrocyte sous la forme d un anneau qui se déplace dans le sens opposé à la pénétration le long du parasite (Aikawa et al., 1978). En parallèle, la libération des protéines des organites du complexe apical et l altération localisée de l architecture de la membrane érythrocytaire, sont essentielles aux phénomènes d invagination de cette dernière et à la création de la membrane de la vacuole parasitophore (PVM) (Bannister and Mitchell, 1989; Bannister et al., 1986; Sam-Yellowe et al., 1988). Le mouvement de pénétration est actif et serait régi par le système moteur acto-myosine (Pinder et al., 1998). Une fois complètement internationalisé, environ une minute après l adhésion initiale, le mérozoïte est entièrement entouré de la PVM. C est alors que les granules denses fusionnent avec la membrane plasmique du parasite et déversent leurs contenus déployant la PVM (Torii et al., 1989). 21
Figure 3. Représentation schématique des événements morphologiques de l invasion d un globule rouge par un mérozoïte. A. Attachement ; B. Réorientation apicale ; C. Formation de la jonction et début de libération du contenu des rohptries ; D et E. Pénétration du mérozoïte à travers la jonction mobile et formation de la membrane parasitophore ; F et G. Fermeture de la jonction et de la membrane de l érythrocyte résultant en une internationalisation du mérozoïte dans la vacuole parasitophore ; D à F. Décapage progressif du manteau cellulaire du mérozoïte associé à la mobilité de la jonction (Cowman et al., 2000). 22
III.2.3.2. Le stade anneau : Après l invasion d un globule rouge, le mérozoïte est enfermé dans une vacuole parasitophore, l isolant du cytoplasme érythrocytaire. C est le stade anneau qui dure jusqu à la 20-24 ème heure après l invasion (Figure 4). Il est caractérisé par la perte du complexe apical, une faible activité métabolique, la synthèse des ARNm spécifiques de ce stade (Spielmann and Beck, 2000) et des modifications de la membrane et du cytosquelette du globule rouge liées à la sécrétion de protéines parasitaires. Lors de son développement, l anneau commence à ingérer l hémoglobine de l hématie par pinocytose. Il se déploie en un disque fin biconcave (forme restreinte par la forme biconcave aplatie de sa cellule hôte), dans lequel le noyau s allonge pour former une altère donnant une apparence d anneau sur frottis coloré (Aikawa et al., 1967; Langreth et al., 1978). III.2.3.3. Le stade trophozoïte : Après 20-24 h, l anneau subit une forte croissance, c est le stade trophozoïte (Figure 5). Pendant cette période, le parasite met en place un système cytostomal pour augmenter l ingestion du cytoplasme érythrocytaire (Slomianny, 1990). Le pigment noir insoluble formé de cristaux d hémozoïne, produit de la digestion de l hémoglobine (Olliaro and Goldberg, 1995), devient visible en microscopie optique dans la vacuole digestive. Le stade trophozoïte est caractérisé par une augmentation de la taille de son cytoplasme, un allongement de la mitochondrie et de l apicoplaste, un accroissement de la surface du réticulum endoplasmique et du nombre de ribosomes (lié à l intensification de la synthèse protéique), et le développement d un appareil de Golgi atypique sous la forme de vésicules périnucléaires (Bannister et al., 2000; Van Wye et al., 1996). Des extensions de la PVM forment un réseau tubulo-vésiculaire qui semble être important pour le transport de solutés, ainsi que des formations membranaires d origine parasitaire (les clés de Maurer) qui seraient également importantes dans le transport de protéines (Sam-Yellowe et al., 2004). Ces structures apparaissent dans le cytoplasme érythrocytaire (Bannister et al., 2000; Przyborski et al., 2003). Ainsi, le parasite modifie le globule rouge en exportant un ensemble de protéines dans son cytoplasme et à sa surface formant des protubérances ou «knobs» (Atkinson and Aikawa, 1990) impliquées dans l adhérence du globule rouge à la paroi des vaisseaux sanguins. 23
Figure 4. Organisation tridimensionnelle d un anneau de Plasmodium falciparum dans un globule rouge (Bannister et al., 2000). Figure 5. Organisation tridimensionnelle d un trophozoïte de Plasmodium falciparum (extrait d un globule rouge) (Bannister et al., 2000). 24
Au niveau des acides nucléiques, c est autour de la 33 ème h du cycle que débute la synthèse d ADN alors que la synthèse d ARN est réalisée tout au long du cycle avec toutefois un pic à la 36 ème h suivi d une décroissance (Ben Mamoun et al., 2001; De Rojas and Wasserman, 1985). III.2.3.4. Le stade schizonte et la différenciation des mérozoïtes : A partir de la 36 ème heure du cycle, commence la phase de multiplication asexuée (la schizogonie), le parasite effectue plusieurs cycles de réplication de l ADN, aboutissant à la formation d'un syncytium. C est le stade schizonte (Figure 6). Le noyau subit au moins quatre divisions mitotiques pour produire environ 16 noyaux. La division nucléaire est endomitotique, caractère commun aux eucaryotes unicellulaires, et caractérisée par la persistance de l enveloppe nucléaire. Au cours de l avant dernière mitose (stade huit noyaux), chaque noyau se déplace vers la surface du parasite, avec les fuseaux mitotiques orientés tangentiellement au périmètre de la cellule (Bannister et al., 2000). Les dernières heures du cycle (44-48 ème h) sont caractérisées par la différenciation des mérozoïtes par bourgeonnement à la périphérie du schizonte. Chaque mérozoïte va être isolé par pincement du corps résiduel cytoplasmique (vestige de la vacuole digestive rempli de cristaux d hémozoïne). Ce pincement s accompagne d une scission de la mitochondrie et de l apicoplaste. Les divisions nucléaires sont accompagnées par de nombreux changements cytoplasmiques qui anticipent la formation des mérozoïtes : forte prolifération du réticulum endoplasmique, augmentation du nombre de ribosomes libres, de la taille de la mitochondrie et de l apicoplaste. Des complexes vésiculaires dérivés de l appareil de Golgi se mettent en place entre le noyau et la membrane du parasite dans l axe du bourgeonnement qui donneront naissance par fusion à la citerne pelliculaire (vésicule aplatie à deux faces, externe et interne, sous la membrane plasmique) et aux organites apicaux caractéristiques du groupe monophylétique des Apicomplexa (rhoptries, micronèmes, granules denses). Si le processus de différenciation est bien connu morphologiquement (Margos et al., 2004), les mécanismes moléculaires sous-jacents le sont beaucoup moins. Le mécanisme de libération des mérozoïtes n est pas élucidé. Il est traditionnellement suggéré que les membranes de la vacuole parasitophore et du globule rouge se rompent plus ou moins en même temps, ce qui résulte en la lyse de la cellule hôte et le largage des mérozoïtes libres et du corps résiduel. Cette libération fait intervenir des 25
protéases et une (des) activité(s) de type hémolysine (Roggwiller et al., 1998; Salmon et al., 2001). Cette vision est cependant controversée. Deux travaux récents suggèrent que la rupture de la membrane du globule rouge se ferait sans hémolyse immédiate et que les mérozoïtes seraient libérés dans la circulation sanguine en paquets entourés d une fine membrane (Clavijo et al., 1998; Winograd et al., 1999). III.2.3.5. Le mérozoïte : Le mérozoïte est une petite cellule polarisée, ellipsoïde de 1,2 à 1,8 µm de long par 0,7 à 1 µm d épaisseur, avec une proéminence apicale (Figure 7). En dépit de sa petitesse, chaque mérozoïte contient tout l équipement nécessaire à l échappement de sa cellule hôte, à la reconnaissance et à l invasion d un nouveau globule rouge. Le noyau du mérozoïte occupe le tiers basal de la cellule. L appareil de Golgi, proche du noyau, est réduit et ne semble être qu une seule citerne discoïdale. Il n y a qu une seule mitochondrie et un seul apicoplaste attaché aux microtubules sous pelliculaires. La membrane plasmique, doublée de membranes internes, est recouverte d un manteau cellulaire important. III.2.3.5.1. Les organites apicaux : Les plus grosses de ces vésicules sont les rhoptries, au nombre de deux par mérozoite, elles sont en connexion avec la membrane plasmique à l extrémité apicale de la cellule. Les rhoptries sont en forme de poire et constituées de deux parties, un bulbe basal granulaire de 650 nm de long et 300 nm de large, et un canal apical réticulaire étroit. Des complexes différents de protéines sont contenus dans le bulbe et le canal (Preiser et al., 2000). Les micronèmes sont des vésicules allongées, granulaires, en forme de sac fusiforme, au nombre d une quarantaine. Elles mesurent environ 160 nm de long et 60 nm de large, et apparaissent le plus souvent accrochées aux canaux des rhoptries. Il est supposé qu elles déverseraient leurs sécrétions au cours de l invasion par les canaux des rhoptries. Les micronèmes sont produites par bourgeonnement au niveau de l appareil de Golgi et sont ensuite acheminées à l apex du mérozoïte le long des microtubules sous pelliculaires (Bannister et al., 2003). Les dernières vésicules, les granules denses, sont extrêmement granulaires et sont les plus petits des trois organites, environ 80 nm de diamètre. Elles se situent plus en retrait par 26