Microscopies plein champs 3D & 3D n couleurs+temps

Microscopies plein champs 3D & 3D n couleurs+temps Dr Fabrice Cordelières, IR2 CNRS Institut Curie - Section de recherche/ CNRS UMR 146 Plateforme d'imagerie Cellulaire Bâtiment 112 - Centre universitaire 91405 Orsay Cedex Tél. : +33 1 69 86 31 30 E-mail: fabrice.cordelieres@curie.u-psud.fr

Microscopies plein champs 3D & 3D n couleurs+temps I-Formation de l image dans un microscope : ce que l on voit n est pas la réalité! A-Formation de la tâche d Airy. B-Aparté : «widefield vs confocal». C-L image obtenue est composite. D-Pinhole et résolution. II-Microscopies 3D : A-Microscopie 3D à déconvolution : 1-Microscopie 3D : pour quoi faire? Comment mettre en évidence les structures? 2-Illuminer la préparation : lampes et filtres. 3-Echantillonner le volume : le piezo. 4-Le résultat. B-La déconvolution : 1-Formation de l image, rappel. 2-Restaurer l image. 3-Comment ça marche? 4-Un exemple. C-Limites et alternatives : 1-Limites. 2-Un exemple d alternative : l apotome. III-Microscopies 4/5D : A-Microscopie 4/5D à déconvolution : 1-Microscopie 4/5D : pour quoi faire? Cahier des charges. 2-La microscopie de grand papa. 3-Remplir le cahier des charges : a) Visualiser les protéines d intérêt : la révolution des protéines fluorescentes. b) Changer rapidement de longueur d onde d excitation : 2 solutions. c) Acquisition à faible dynamique : pourquoi est-ce envisageable? d) Echantillonnage rapide du volume : le retour du piezo. e) Acquisition rapide d images et synchronisation des périphériques. 4-Un exemple de résultat B-Limites et alternatives : 1-Limites. 2-Un exemple d alternative : le spinning disc. IV-Exemples d applications : A-Suivi de vésicules. B-Fusion et mouvements en trois dimensions : le problème du suivi 3D. C-Visualisation 3D.

Formation de l image dans un microscope : Ce que l on voit n est pas la réalité!

Ce que l on voit n est pas la réalité! Formation de la tache d Airy En 2D Plan source xplan image Intensité

Ce que l on voit n est pas la réalité! Tache d Airy et résolution

Ce que l on voit n est pas la réalité! De la tache d Airy à la PSF En 3D XY YZ XZ

Microscopie Wide-Field Quelle différence avec la microscopie confocale à balayage? Laser Lampe Xe ou Hg Illumination z Plan Focal Microscopie Confocale Microscopie Wide-Field Détecteur

Microscopie Wide-Field Quelle différence avec la microscopie confocale à balayage? Microscopie confocale à balayage 1 coupe, 512x512px 4 passages moyennés Approx. 600ms Microscopie Wide-Field 1 coupe, 512x512px 100-500ms

Ce que l on voit n est pas la réalité! L image obtenue est composite Microscopie WF Objet 3D Lentille Détecteur Microsopie Confocale Pinhole

Ce que l on voit n est pas la réalité! De la tache d Airy à la PSF En 3D & au confocal Pouvoir séparateur Microscopie Widefield Microscopie Confocale d xy (latéral) d xy =0,61λ em /NA d xy =0,4λ em /NA XY YZ d z (axial) d z =2λ em /NA² d z =1,4λ em /NA² Gain de 30%! XZ α n Ouverture numérique: NA=n x sin α

Ce que l on voit n est pas la réalité! Le système optique modifie notre perception de l objet Formation de l image le long du chemin optique Objet Convolution PSF Bruit Image Comment estimer l objet à partir de l image? La déconvolution est un traitement mathématique permettant d approximer l objet.

Microscopies 3D

Immunodétection Immunofluorescence indirecte Fluorophore Anticorps secondaire Anticorps primaire Antigène cible

Spectres lampes

Microscopie à fluorescence : Différencier excitation et émission Lumière d excitation Fluorophore Emission de fluorescence Protéine d intérêt Détecteur: Oeil ou Camera Filtre d émission Miroir dichroïque Source Filtre d illumination d excitation Filtre d excitation Miroir dichroïque Filtre d émission

Echantillonner le volume Principe de fonctionnement du piezo Perovskite-type lead zirconate titanate (PZT) http://www.physikinstrumente.de/ Plomb Oxygène Zirconium/Titane

Echantillonner le volume Principe de fonctionnement du piezo V

Préparations multi-marquées Un moyen d analyser la co-localization DAPI (ADN) FITC (Tubuline) Rhodamine (Arp1) Overlay

Ce que l on voit n est pas la réalité! Le système optique modifie notre perception de l objet Formation de l image le long du chemin optique Objet Convolution PSF Bruit Image Comment estimer l objet à partir de l image? La déconvolution est un traitement mathématique permettant d approximer l objet.

La déconvolution Un moyen de restaurer l image Equation de formation de l image: i= h o Equation simple de restauration de l image: o= h -1 i Avec i: image, h: PSF et o: object observé

La déconvolution Un moyen de restaurer l image Et si on compliquait un peu Equation de formation de l image avec du bruit: i= (h o)+n Equation de restauration de l image avec du bruit : o= h -1 (i-n) Avec i: image, h: PSF, o: object observé et n: bruit.

La déconvolution Un moyen de restaurer l image Résoudre l équation par touches successive Méthodes itératives et contraintes Principe: améliorer par touches successives (=itération) un estimateur de l objet: ô k+1 = ô k w k Avec ô k+1 : estimateur courant, ô k : estimateur précédent et w k : vecteur de correction. Contrainte: les valeurs d intensité des pixels doivent être positives ou nulles.

La déconvolution Comment ça marche? Démarrer une nouvelle itération Non Départ Estimateur de l objet ô k D Correction CxD Nouvel estimateur de l objet ô k+1 Réducteur de bruit Déconvolution terminée? Oui Image déconvoluée Image floue i Convolution PSF h Estimateur flou ô k h B A Comparer A/B C Vecteur de correction w k Pour la première itération, l estimateur de l objet est l image originale Adapté de: http://www-timc.imag.fr/yves.usson/deblur.algo.fr.html

La déconvolution Un processus itératif Image: Susanne Bolte (IFR87 Gif-sur-Yvette), réalisée sur le microscope 3D à déconvolution. Déconvolution: PSF mesurée, réalisée avec AutoDeblur 9.3.4

La déconvolution Un exemple de résultat Image brute Image déconvoluée Déconvolution

Une alternative aux microscopies 3D & confocale: Un exemple d illumination structurée

Un exemple d illumination structurée L apotome Source: http://www.zeiss.de/

Microscopies 4/5D

Structures Microscopie wide-field 3D+temps, n couleurs prenant la pause Cahier des charges Pouvoir marquer les protéines à observer; Echantillonage rapide du volume; Niveau d illumination faible; Changement rapide de longueur d onde; Acquisition rapide d images; Structure à Maintenir les cellules déplacement en vie!!! rapide

Maintenir les cellules en vie Contrôle de la température, de l humidité et de la teneur en CO 2

Maintenir les cellules en vie A B C D

Vidéomicroscopie 2D n positions En contraste interférentiel

Vidéomicroscopie 2D n positions En contraste de phase Position 1 Position 2 Position 4 Position 3

La révolution des protéines fluorescentes La GFP Aequorea Victoria

La révolution des protéines fluorescentes Les XFPs/DsRed: la palette du biologiste Discosoma Striata

Changement rapide de longueur d onde d excitation Filtres et illuminateurs adaptés

Changement rapide de longueur d onde : Et les filtres dans tout ça?! Transmission (%) 100% 90% 80% 70% 60% Détecteur: Oeil ou Camera Filtre d émission Miroir dichroïque Excitation Dichroïc Emission Source Filtre d illumination d excitation Détecteur: Oeil ou Camera Lampe Xenon 50% 40% 30% 20% Ex GFP Em GFP Ex DsRed Em DsRed DG4 10% 0% 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750 Longueur d'onde (nm) Une longueur d onde par cube filtre; Le changement de longueur d onde requiert un mouvement de roue de filtre au niveau du microscope. Cube filtre à double bande passante; Le changement de longueur d onde ne requiert aucun mouvement de roue de filtre au niveau du microscope.

Changement rapide de longueur d onde Comment fonctionne le DG4? Fibre optique Miroirs paraboliques Miroirs sur galvanomètres Lampe Xenon 175W Filtres en excitation

Changement rapide de longueur d onde La preuve par l image

Changement rapide de longueur d onde Comment fonctionne le monochromateur? Fibre optique Réseau mobile Fente de sortie Miroir parabolique Fente d entrée Miroir toroïdal

Changement rapide de longueur d onde La preuve par l image Lambda scan Changement rapide de longueur d onde

Acquisition à faible dynamique: Pourquoi est-ce envisageable? Object 24 32 128 1024 +bruit Acquisition Source: J-B. Sibarita, Institut Curie, Paris

Echantillonnage rapide du volume Utilisation du piezo

Acquisition rapide d images & Coordination des périphériques

Acquisition rapide d images: Comment fonctionne la caméra? Registre Image Registre de Stockage Registre Image Registre de Stockage Registre de lecture Mode séquentiel Mode simultanné!!! Penser à parler du binning!!!

Coordination des périphériques Exposition Transfert Lecture Exposition Transfert Lecture Exposition Transfert Lecture Mode séquentiel Temps Changement de l Changement de z Changement de l et de z Exposition Transfert Lecture Exposition Transfert Lecture Exposition Transfert Mode simultané Changement de l Changement de z Changement de l et de z Temps

Vert Vert déconvolué Microscopie 3D+temps, 2 Couleurs Déconvolution à haut débit Acquisition Overlay Rouge Rouge déconvolué

Une alternative à la microscopie 4/5D : Microscopie confocale multifocale monophoton Le spinning disc

Une technique de microscopie dérivée de la première forme de télévision?!!!

Microscopie confocale multifocale monophoton Le spinning disc

Exemples d applications

Vidéomicroscopie 3D+temps, n couleurs Extraire les données: suivre et quantifier Pile de Sections Optiques y x z WT Htt PolyQ Htt Projection d Intensité Maximale Laurent Gauthier & Frédéric Saudou, Institut Curie, Orsay

Vidéomicroscopie 3D+temps 2 couleurs Un moyen d étudier la dynamique de structures subcellulaires Images obtenues par vidéomicroscopie avec Jim Dompierre, Institut Curie, Orsay

Vidéomicroscopie 3D+temps, n couleurs Extraire les données: suivre et quantifier Intensité normalisée Time (min:sec) Dompierre J, Cordelières F, Coquelle F, Reiner O, Sibarita JB et De Mey J, still has to be resubmitted...

Exemple d application et de représentation des données Images obtenues par vidéomicroscopie avec Dominique Segretain, INSERM EMI

Pour aller plus loin: http://www.microscopy.fsu.edu/primer/index.html