Introduction à la microscopie confocale Sylvette CHASSEROT-GOLAZ Unité CNRS UPR 2356, Strasbourg Principe de la microscopie confocale La microscopie confocale est l'une des percées les plus notables de ce siècle en microscopie optique. Elle est aujourd'hui une architecture élaborée comprenant des lasers, des éléments optiques, des dispositifs de balayage rapide et des ordinateurs qui traitent numériquement les images. Cette synthèse a donné aux utilisateurs les moyens d'analyser l'intérieur des objets microscopiques et de les visualiser en trois dimensions. L'inconvénient majeur de la microscopie à fluorescence conventionnelle est une perte de résolution due à l'émission de fluorescence défocalisée qui se superpose à l'image du plan focal. La microscopie confocale a permis de pallier ces inconvénients puisque son principe est de pratiquer des coupes optiques virtuelles dans l'objet observé et de n'enregistrer que l'image de la fluorescence émise dans le plan. Le principe de la microscopie confocale est résumé dans l'image suivante : Le rayon laser excitateur pénètre dans l'échantillon marqué avec des fluorochromes. Il y a alors émission des rayons fluorescents provenant de différents plans de la préparation. Grâce à un diaphragme variable ou "pinhole" qui élimine le signal fluorescent provenant d'autres plans, il est possible de sélectionner les rayons émis par un seul plan de la préparation. Ces rayons passent alors à travers un bloc de filtrage des longueurs d'onde, puis arrivent à un sytème de détection par photomultiplicateurs. La microscopie confocale offre différents avantages par rapport à la microscopie conventionnelle pour la localisation in situ d'une sonde fluorescente dans des cellules et plus particulièrement dans des coupes de tissus épais : élimination du signal fluorescent provenant d'autres plans (out of focus) grâce au pinhole, augmentation de la résolution latérale (0,2µm) et axiale (0,4µm), réglages électroniques du contraste, de la luminosité et de l'agrandissement, observation simultanée de différentes sondes fluorescentes, acquisition de séries de sections optiques permettant la reconstruction 3D.
Pour une présentation plus complète de la microscopie confocale, cliquez ici pour vous connecter à la présentation de Lance Ladic. Applications sur cellules et tissus fixés Localisation subcellulaire d'une protéine La détection simultanée de plusieurs structures intracellulaires marquées par des sondes fluorescentes spécifiques est absolument indispensable pour appréhender l'organisation fonctionnelle de cellules eucaryotes, sachant que la distribution intracellulaire de nouvelles molécules nécessite toujours d'être comparée avec celles de structure bien connues. L'imagerie de multifluorescence en microscopie confocale fournit une solution rapide et quantitative pour visualiser et analyser la distribution spatiale de plusieurs structures cellulaires, à l'échelle submicrométrique. Cette image montre le marquage obtenu avec un anticorps dirigé contre une protéine des granules de sécrétion. Le marquage est présenté à l'aide d'une palette de couleur en dégradé de rouge allant du noir au jaune. Une possibilité donnée par le confocal est de pouvoir agrandir certaines zones de l'échantillon, nous avons donc sélectionné un prolongement riche en granules afin de mieux visualiser le marquage. Ainsi la microscopie confocale améliore considérablement le pouvoir de résolution des marquages par fluorochromes. On obtient couramment une résolution latérale de 0,3 µm et une résolution verticale de 0,5 µm. Il devient donc possible d'individualiser de très petites structures marquées, par exemple des vésicules synaptiques ou des granules de sécrétion, dans le cytoplasme des cellules entières. Il est également possible de visualiser dans le même plan focal, le cytosquelette d'une cellule (en rouge) et les granules de sécrétion (en vert), Observation simultanée de différentes sondes fluorescentes L'observation simultanée de différentes sondes fluorescentes permet d'effectuer des études de colocalisation très précise de deux protéines en analysant le cytofluorogramme de quantification dérivé de la superposition de 2 images obtenues dans le même plan focal.
Pour étudier la distribution de 2 sous-unités p11 et p36 d'une protéine. Les cellules sont marquées à l'aide d'un anticorps anti-p36 fait chez le lapin et révélé par un deuxième anticorps anti-lapin couplé à la fluoresceine, et par un anticorps anti-p11 fait chez la souris et révélé par un anticorps anti-souris couplé à la rhodamine. Dans la cellule au repos (A), p36 décorée en fluoresceine est présente dans l'ensemble du cytoplasme, p11 décorée en rhodamine n'est présente qu'au niveau de la membrane plasmique. le cytofluorogramme représente la distribution des couples d'intensité de fluorescence fluorescéine et rhodamine provenant de l'image. On peut voir que les points sont marqués soit en rouge (abscisse), soit en vert (ordonnée) ceci sugère qu'il n'y a pas d'endroit ou p11 et p36 sont colocalisées. Dans les cellules stimulées (B) il se produit une translocation de le p36 vers la membrane plasmique c'est à dire vers la sous-unité p11. Dans ce cas tous les points du cytofluorogramme sont localisés sur la diagonale traduisant la colocalisation de p11 et p36. Reconstruction tridimensionnelle d'une cellule Pour obtenir une information 3D d'un spécimen, il est possible: de réaliser des sections optiques d'un échantillon à différents niveaux dans l'axe de XY dans l'axe XZ d'acquérir une série de sections optiques dans l'axe vertical Z. Réalisation des sections optiques Étude du cytosquelette dans une cellule, on observe 3 sections différentes: 2 plans XY réalisées à la base de la cellule (A) et au milieu de la cellule (B), et une coupe perpendiculaire (XZ) (C) Dans des coupes de tissus épais : on peut observer la répartition d'une protéine dans des coupes optiques XZ réalisées sur 3 types d'artères différentes, l'aorte(a), une artère fémorale (B), et une artère mésentérique (C)(épaisseur de la coupe >50µm)
Dans des échantillons de granite on peut suivre la répartition des fissures. Sur l'image A (plan XY) le trait blanc représente l'axe de coupe choisi pour la section XZ (B). Acquisition d'une série de sections optiques dans l'axe vertical Z Représentation d'une série de coupes optiques qui confirme qu'une protéine est concentrée au niveau de la membrane plasmique. Après exploitation des différentes images grâce à des programmes informatiques, il est possible d'avoir de nombreuses représentations : sections orthogonales représentation du marquage en fonction de sa répartition dans l'axe des Z "depht coding": sur une cellule (8µm) on observe que le cytosquelette de la cellule est concentré à la base de la cellule pour facilité son attachement;
dans un morceau de granite (150µm), on observe la répartition des fissures. images stereos représentation animée de la structure 3D. Physiologie confocale sur cellules et tissus vivants La microscopie confocale couplée avec des colorants sensibles au voltage ou indicateurs d'ions, ou avec des sondes fluorescentes lipidiques peut être utilisée pour étudier des changements dans la physiologie de la cellule. Dans cette technique, des images du même plan focal sont acquises à différents temps. Il est même possible de faire de la représentation en 4D (3D en fonction du temps) c'est à dire qu'une série d'images en z est prise à chaque temps. Bibliographie White, J.G., Amos, W.B. and Fordham, M. (1987) An evaluation of confocal versus conventional imaging of biological structures by fluorescence light microscopy. J. Cell Biol., 105 : 41-48. Lichtman J. (1994). La microscopie confocale. Pour la science, N 204, 62-67. Cell Biological Application of Confocal Microscopy. Methods in Cell Biology.(1993). Vol 38. Édité par Brian Matsumoto. Academic Press Inc.