Page : 25/ 77 IV MOLECULES LUMIESCETES ET METHODES D AALYSE E RET Les techniques de transfert d énergie (RET) peuvent être mis en œuvre en évaluant différents paramètres : i) l intensité des signaux émis par le donneur et l accepteur d énergie, ii) le temps de désexcitation du donneur (durée de vie), iii) le degré de polarisation de la lumière émise (anisotropie de fluorescence). Les exemples présentés dans ce document sont uniquement basés sur la mesure des variations de l intensité de la fluorescence émise par l accepteur. On représente généralement les résultats obtenus sous la forme d un rapport (ou ratio) qui consiste à diviser la fluorescence de l accepteur par la fluorescence du donneur (Figure 17a). Ce mode ratiométrique permet d éliminer les variations de signal dues à des fluctuations de la lumière détectée (interférences optiques des milieux, variations du nombre de cellules, volume de l essai...). A B Figure 17a. Effet de filtre des milieux. A) Effet de filtre d un milieu contenant une concentration croissante de Rhodamine B (fluorophore) 12. B) Analyse du RET en mode ratiométrique. 12 D après Jameson et. al., Methods in Enzymology, 2002.
Page : 26/ 77 Différentes techniques de RET seront décrites dans ce chapitre (Figure 17b). Figure 17b. Techniques de RET présentées dans ce chapitre. A/ LES FLUOROPHORES ORGAIQUES CLASSIQUES 1) PROPRIETES DES FLUOROPHORES Les fluorophores organiques classiques ont déjà été mentionnés dans le chapitre précédent (voir choix des fluorophores et des couples de fluorophores). Il est important de retenir que les fluorophores organiques sont de très petites molécules synthétiques faisant autours de 1 KDa de poids moléculaire. Un grand nombre de molécules commerciales couvrant toute la palette spectrale, de l ultraviolet au proche infrarouge, sont disponibles. Les fluorophores organiques présentent des coefficients d extinction molaire élevés ( > 100,000 M -1.cm -1 ) et de bons rendements quantiques ( compris entre 0.1 et 0.9). En Annexe se trouve une liste non exhaustive des fluorophores les plus couramment utilisés (Cyanines, AlexaFluor et ATTOdyes) avec leurs principales propriétés.
Page : 27/ 77 2) UTILISATIO E FRET (FÖRSTER RESOACE EERGY TRASFER) Avantages des fluorophores organiques en FRET : La grande diversité des fluorophores organiques ainsi que leur petite taille rend ces molécules fluorescentes très attractives pour des analyses de FRET. Il est en effet très facile de choisir des couples de fluorophores avec différentes caractéristiques. Limites des fluorophores organiques en FRET : Pour être utilisés en biologie, les fluorophores organiques doivent être attachés aux protéines d intérêt. Or, il est très difficile in cellulo d attacher spécifiquement et de manière directe des fluorophores organiques au niveau de protéines cibles. Généralement, les fluorophores sont portés par des sondes qui permettent d amener à l aide d anticorps ou de fixer indirectement (pour exemple voir la technologie SAP-tag) les fluorophores au niveau des protéines d intérêt. La limite de la plupart de ces sondes fluorescentes vient de leur incapacité à traverser la membrane plasmique des cellules. Ces sondes sont donc très bien adaptées au marquage des protéines membranaires de surface mais nécessitent souvent d avoir recours à des méthodes invasives (perméabilisation, électroporation, fixation des cellules, etc.) pour cibler des protéines intracellulaires. B/ LES PROTEIES FLUORESCETES 1) PROPRIETES DES FLUOROPHORES Toutes les règles décrites dans le chapitre III pour les fluorophores organiques classiques s appliquent également aux protéines fluorescentes. La protéine fluorescence GFP (Green Fluorescent Protein) a été initialement identifiée chez la méduse Aequorea victoria. C est une protéine de 27 KDa de poids moléculaire qui se présente sous la forme d un cylindre composé de feuillets β qui entourent une hélice α contenant le chromophore (Figure 18). En changeant, entre autre, la structure des acides aminés formant le chromophore, il a été possible de
Page : 28/ 77 modifier les longueurs d'onde d'absorption et d'émission de la GFP devenant alors, une BFP (Blue Fluorescent Protein), une YFP (Yellow Fluorescent Protein) ou la CFP (Cyan Fluorescent Protein) 13 (Figure 18). L organisation des feuillets β autours du chromophore 14 forme une véritable «cage» qui protège ce dernier de son environnement. Parmi les protéines fluorescentes développées 15, nous ne parlerons ici que des protéines CFP et YFP qui ont été largement utilisées dans des analyses de FRET. Figure 18. Structure de la GFP et de certains de ses mutants. a) Les feuillets sont représentés en jaune et le chromophore se trouve au centre du cylindre. b) Structures des acides aminés formant le chromophore de différents mutants de la GFP. 2) LE DOEUR D EERGIE CFP Caractéristiques photo-physiques : Fluorophores ε max (M -1.cm -1 ) ϕ Brillance (M -1.cm -1 ) Déplacement de Stokes (nm) ECFP 32,500 0.4 1.3 x 10 4 22 La CFP est une protéine fluorescente qui émet de la fluorescence dans des longueurs d ondes correspondant à la couleur Cyan. Son maximum d excitation est à 458 nm et son maximum d émission à 480 nm (Figure 19). 13 Liste non exhaustive. 14 Chromophore vient du Grec chroma : couleur et phoros : porter, avoir en soi. Ce terme s applique aux résidus d une protéine responsables de sa couleur par émission de photons ainsi qu aux pigments dont la couleur dépend des longueurs d ondes qui ne sont pas absorbées. 15 Voir la revue de Shaner C et al, J of Cell Science 2007.
Page : 29/ 77 Abs. CFP 350 400 450 500 550 600 650 Figure 19. Spectres d absorption et d émission de la CFP. 3) L ACCEPTEUR D EERGIE YFP Caractéristiques photo-physiques : Fluorophores ε max (M -1.cm -1 ) ϕ Brillance (M -1.cm -1 ) Déplacement de Stokes (nm) EYFP 83,400 0.61 5.1 x 10 4 16 La YFP est une protéine fluorescente qui émet de la fluorescence dans le jaune. Son maximum d excitation est à 508 nm et son maximum d émission à 524 nm (Figure 20). Abs. YFP 350 400 450 500 550 600 650 Figure 20. Spectres d absorption et d émission de la YFP. 4) UTILISATIO E FRET (FÖSTER RESOACE EERGY TRASFER) Avantages des protéines fluorescentes en FRET : Les protéines fluorescentes ont été très largement utilisées en biologie notamment pour des techniques de FRET. Ceci vient de la simplicité d utilisation de ces
Page : 30/ 77 protéines qui peuvent être fusionnées par biologie moléculaire aux protéines cibles et ainsi être exprimées directement dans les cellules (in vitro et in vivo). D autres part, leur bonne brillance permet leur utilisation en microscopie de fluorescence. Limites des protéines fluorescentes en FRET : La principale limitation du couple CFP/YFP vient du recouvrement des spectres d excitation et d émission des fluorophores (Figure 21). Ce manque de sélectivité spectrale est à l origine d un important bruit de fond qui diminue la sensibilité des mesures. Le bruit de fond correspond à la contamination du signal de FRET par des molécules émettant à la même longueur d onde que l accepteur : fluorescence du donneur (fuite spectrale Figure 21), auto-fluorescence des cellules, excitation directe de l accepteur à la longueur d onde du donneur (voir chapitre III-B). Tout ceci rend difficile l utilisation de ces protéines fluorescentes dans des analyses de FRET avec des lecteurs de fluorescence (fluorimètres). Abs. CFP 350 400 450 500 550 600 650 Abs. CFP + YFP YFP 350 400 450 500 550 600 650 350 400 450 500 550 600 650 Figure 21. Couple CFP/YFP et fuites spectrales. C/ LES EZYMES La particularité du transfert d énergie de type BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) vient de la nature du donneur d énergie. En effet, l émission de lumière excitatrice provient d une réaction enzymatique entre une enzyme et son
Page : 31/ 77 substrat. Il est indispensable d avoir ces deux entités associées pour qu une émission de photons (luminescence) soit possible. 1) LE DOEUR D EERGIE La Renilla luciferase (Rluc) est une enzyme de 36 KDa provenant d un organisme marin, Renilla reniformis (ou pensée de mer) (Figure 22). Caractéristiques photo-physiques de la Rluc : Fluorophores ε max (M -1.cm -1 )* ϕ Rluc - 0.05 * On ne définit pas de coefficient d extinction molaire pour la Rluc car son émission est déclenchée par une réaction enzymatique et non par une source lumineuse extérieure. Dans le cas de la Rluc l émission de photons provient de la réaction enzymatique déclenchée par l ajout de son substrat, la cœlenterazine H. La réaction enzymatique est une décarboxylation oxydative de la cœlenterazine H qui conduit à la production de cœlenteramide, de CO2 et de photons (Figure 22.b). Les photons émis ont des longueurs d ondes qui vont de 400 à 600 nm avec un pic à 480 nm (Figure 22.c).
Page : 32/ 77 A B C Rluc 350 400 450 500 550 600 650 Figure 22. La Renilla Luciferase. a) Structure de la Rluc (PDB : 2PSD) 16. b) Réaction enzymatique mis en œuvre par la Rluc. c) Spectre d émission. Ces dernières années, différents travaux de mutagenèse ont permis d améliorer les propriétés de la Rluc en augmentant notamment sa luminescence 17. En introduisant 8 mutations, un mutant nommé Rluc8, 4 fois plus luminescent que la Rluc, a pu être généré (Figure 23). Ceci améliore la sensibilité de la détection. Figure 23. La Rluc8. Les 8 mutations sont indiquées en jaune (PDB : 2PSD). 16 Protein Data Bank : http://www.rcsb.org 17 On parlera ici de luminescence plutôt que de brillance car le terme de brillance s applique aux fluorophores (cf. III-A). Ici l émission de photons provient d une réaction enzymatique et non d un fluorophore.
Page : 33/ 77 2) L ACCEPTEUR D EERGIE L accepteur généralement associé à la Rluc est la protéine fluorescente YFP (voir IV- B-3). Récemment, un mutant de la YFP appelé Venus, plus brillant et moins sensible au ph, a été obtenu et est couramment utilisé en BRET. Fluorophores ε (M -1.cm -1 ) ϕ Brillance (M -1.cm -1 ) Déplacement de Stokes (nm) EYFP 83,400 0.61 5.08 x 10 4 16 Venus 92,200 0.57 5.25 x 10 4 16 3) UTILISATIO E BRET (BIOLUMIESCECE RESOACE EERGY TRASFER) Avantages des enzymes en BRET : L utilisation d une enzyme Renilla Luciferase (Rluc) permet de s affranchir d une source lumineuse excitatrice extérieure ce qui évite différents problèmes : - Photo-blanchiment des YFP, - Effet de filtre des milieux à la longueur d onde d excitation du donneur. Il s agit de l absorption de l énergie des photons d excitation par le milieu (Figure 17), - Excitation directe de l accepteur par la source lumineuse. Tout cela contribue à améliorer considérablement la qualité des signaux mesurés. Un autre avantage du BRET est que la Rluc peut être exprimée directement par les cellules, comme le sont les protéines fluorescentes, ce qui facilite son utilisation. Limites des couples enzymes-protéines fluorescentes en BRET : Le ratio signal sur bruit en BRET est significativement affecté par le recouvrement des spectres d émission de la Rluc en présence de substrat et de la YFP (Figure 24).
Page : 34/ 77 350 400 450 500 550 600 650 Abs. YFP Rluc 350 400 450 500 550 600 650 Rluc + YFP 350 400 450 500 550 600 650 Figure 24. BRET Rluc/YFP et fuite spectrale. Pour s affranchir de ce problème, des versions améliorées du BRET, nommées BRET2 et BRET3 ont été développées (Figure 25). SYSTÈME DOEUR SUBSTRAT Em max ACCEPTEUR Ex max Em max Déplacement de Stokes BRET1 Rluc8 Coelenterazine H 480 nm YFP 514 nm 527 nm 50 nm BRET2 Rluc8 Coelenterazine400 (DeepBlueC) 400 nm GFP2 400 nm 511 nm 115 nm BRET3 Rluc8 Coelenterazine H 480 nm morange 548 nm 564 nm 85 nm Signal normalisée 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 Rluc8 CLZ400 Rluc8 CLZ GFP2 () YFP morange () () 0 350 400 450 500 550 600 Longueurs d ondes (nm) Figure 25. Différents systèmes de BRET. Les spectres sont uniquement des spectres d émission. CLZ = cœlenterazine, CLZ400 = DeepBlue C
Page : 35/ 77 Dans la version BRET2, un analogue de la cœlenterazine, le DeepBlueC (400A), est utilisé comme substrat de la Rluc. Ce substrat se caractérise par une émission de fluorescence significativement décalée de 480 à 400 nm. Un accepteur nommé GFP2 a été spécialement développé afin de présenter un pic d excitation à 400 nm et un pic d émission à 510 nm. La résolution spectrale du BRET2 est significativement améliorée par rapport au BRET classique avec une séparation presque complète des spectres d émission (115 nm en BRET2 contre 50 nm de décalage en BRET1). éanmoins, l utilisation du DeepBlueC comme substrat de la Rluc donne un «rendement quantique» 18 beaucoup plus faible que celui de la coelenterazine : coel.h = 0,05 et DeepBlueC = 0,004 La nécessité d avoir un lecteur de fluorescence sensible pour le BRET2 est également une limite à l utilisation de cette technologie. Une alternative au BRET2 est le BRET3 (Figure 25). Le BRET3 est basé sur l utilisation d un accepteur, le morange, dont le spectre d émission est décalé vers des plus grandes longueurs d ondes ce qui augmente l écart entre les pics d émission de la Rluc et de l accepteur. D/ LES CRYPTATES DE TERRES RARES La principale limite d utilisation en RET des protéines fluorescentes et des fluorophores organiques classiques est principalement liée au manque de sélectivité spectrale (voir chapitre III). Le développement de molécules luminescentes avec des propriétés singulières a permis d améliorer considérablement la sélectivité spectrale des couples de fluorophores organiques. Comme nous le verrons dans ce chapitre, les propriétés de ces fluorophores permettent d effectuer des mesures de FRET dans des intervalles de temps longs (de plusieurs microsecondes à la milliseconde contre quelques nanosecondes pour des fluorophores classiques). C est pourquoi on utilise le terme de temps résolu (Time-Resolved, TR) ou sélectivité temporelle pour les techniques de RET utilisant ces molécules. 18 On ne devrait pas parler de rendement quantique ici car l émission de photons par la Rluc ne fait pas suite à une excitation lumineuse.
Page : 36/ 77 1) LES PROPRIETES DES CRYPTATES DE TERRE RARE Les cryptates de terre rare sont des complexes formés d un macrocycle (cryptate) qui forme une cage autour d un cation lanthanide 19 (terres rares d europium ou de terbium) (Figure 26). Plusieurs types de cages ont été développées mais nous ne parlerons ici que des cryptates d europium (Eu-K) et de terbium (Lumi4-Tb) commercialisés par la société Cisbio Bioassays 20. R 1 R 2 R 1 R 2 + Cryptand (macrocycle) Ion lanthanide europium (Eu 3+ ) Cryptate d europium Figure 26. Structure d un cryptate d europium. R1 et R2 sont des groupements réactifs qui permettent de greffer le complexe à des biomolécules (anticorps, antigènes...). Caractéristiques photo-physiques des fluorophores donneurs d énergie utilisés en TR-FRET : ε max. (M -1 cm -1 ) Φ Brillance (M -1.cm -1 ) Déplacement de Stokes (nm) Eu-K 10,000 0.1 0.1 x 10 4 250 350 * Lumi4-Tb 20,000 0.5 1 x 10 4 150 300 * * selon les pics d émission considérés (voir ci-après) Le coefficient d extinction molaire (ε) : Une propriété intéressante des cryptates vient de leur capacité à collecter l énergie des photons provenant d une source lumineuse excitatrice et à la transférer sur le cation lanthanide (europium, terbium) : c est l effet d antenne. Il y a donc au niveau 19 Lanthanide est le nom générique des éléments des terres rares. 20 www.htrf.com
Page : 37/ 77 des cryptates de terres rares un transfert d énergie intramoléculaire entre le cryptate (l antenne) et lanthanide (l émetteur) (Figure 27). L antenne est nécessaire car les terres rares ont des coefficients d extinction molaire bien inférieurs aux fluorophores organiques conventionnels (< 3 M -1 cm -1 ) ce qui rend leur excitation directe difficile. Transfert d énergie intracomplexe Excitation du cryptate dans l UV R 1 R 2 Emission de l europium dans le rouge Figure 27. Transfert d énergie au sein du complexe cryptate d europium. Une source lumineuse émettant dans l ultraviolet est utilisée pour exciter la cage formée par le cryptate. Un transfert d énergie se produit alors au sein du complexe du cryptate vers le lanthanide europium. Le rendement quantique et la brillance : Par rapport à des fluorophores organiques classiques, le cryptate d europium présente une faible brillance 21. Le cryptate de terbium, dix fois plus brillant que le cryptate d europium (voir tableau ci-dessus), est ainsi mieux adapté à des mesures sur lecteur de fluorescence et sur microscope en temps résolu 22. Expérimentalement, cette différence de brillance entre les deux cryptates s explique par deux raisons : 1 - les lasers utilisés pour le TR-FRET émettent des photons à 337 nm or l absorbance du cryptate de Terbium (ε) à cette longueur d onde est plus grande que celle du cryptate d europium. En effet, son pic d absorption se trouve autours de 330 nm tandis que celui de l europium se trouve vers 300 nm (Figure 28). 2 - le cryptate de terbium a un plus grand rendement quantique (Φ) que le cryptate d europium (voir tableau précédent). 21 Bien qu adapté à la lecture sur fluorimètre, le cryptate d europium n émet pas suffisamment de photons pour permettre une bonne résolution en microscopie. 22 Mohandessi S. et al., Chemistry 2012.
Page : 38/ 77 Le grand déplacement de Stokes : Les cryptates de terres rares se caractérisent par un grand déplacement de Stokes qui permet de s affranchir de la contamination due à la source d excitation (Figure 28). Ce décalage entre le spectre d absorption et d émission est la conséquence de la séparation au sein du complexe de la fonction d absorption réalisée par le chromophore cryptate de la fonction d émission réalisée par le lanthanide. Ainsi, les cryptates absorbent majoritairement dans l ultraviolet et la partie bleue du spectre visible alors que les terres rares réémettent dans le vert rouge. Intensité normalisée 300 350 500 550 600 650 700 Figure 28. Le déplacement de Stokes des cryptates de terres rares. En bleu clair sont représentés les spectres d absorption (trait en pointillé) et d émission (trait plein) du cryptate d europium et en bleu foncé les spectres d absorption (trait en pointillé) et d émission du cryptate de terbium (trait plein). La durée de vie d émission : Une des particularités des cryptates de terres rares est leur capacité à émettre de la fluorescence pendant un temps long (microsecondes millisecondes) à l inverse des fluorophores classiques (nanosecondes) (Figure 29). La longue durée de vie de cette émission est principalement la conséquence des transitions électroniques particulières qui interviennent au niveau des terres rares. C est cette caractéristique qui permet leur utilisation dans des applications en temps résolu (TR-FRET, voir IV- D-3).
Page : 39/ 77 Fluorophores classiques (ns) Cryptates de terres rares ( s ms) Intensité du signal 0 Durée de vie de fluorescence ms Figure 29. Les durées de vie des fluorophores. 2) LES DOEURS D EERGIE Les principaux fluorophores donneurs utilisés en TR-FRET sont les cryptates de terre rare et les chélates de terre rare. Cependant, dans les milieux biologiques, le complexe formé par le chélate et le lanthanide peut être dissocié en raison d une faible stabilité de l interaction (compétition entre l ion lanthanide et les ions Mn 2+, Mg 2+, Ca 2+ ou chélation du lanthanide par de l EDTA), ce qui peut constituer un inconvénient majeur. Dans le cas des cryptates de terre rare l inclusion de l europium et du terbium dans une cage tridimensionnelle empêche ces phénomènes de dissociation conférant au complexe une très haute stabilité. 3) LES ACCEPTEURS D EERGIE Le cryptate d europium peut être utilisé avec des fluorophores accepteurs d'énergie émettant dans le rouge comme le d2, DY647, le Cy5 ou l Alexa647 (voir annexe I) 23. Le spectre d émission du cryptate de terbium étant plus étalé que celui du cryptate d europium, il peut être utilisé soit avec des accepteurs émettant dans le rouge (d2) soit émettant dans le vert comme la fluoresceine et les protéines fluorescentes GFP (Figure 28, 30-32). 23 Le d2 est commercialisé par la société CisBio et l AlexaFluor647 par Invitrogen.
Page : 40/ 77 Caractéristiques photo-physiques des fluorophores accepteurs d énergie utilisés en TR-FRET : ε max. (M -1 cm -1 ) Φ Brillance (M -1.cm -1 ) Déplacement de Stokes (nm) d2 250,000 0.28 7 x 10 4 18 Fluoresceine 71,000 0.92 6.5 x 10 4 30 4) UTILISATIO E TR-FRET La grande sensibilité de détection de la technique de TR-FRET est la conséquence d une bonne séparation des spectres d émission des molécules donneur et accepteur (sélectivité spectrale) et de l analyse du signal de FRET en temps résolu (sélectivité temporelle). a) LA SELECTIVITE SPECTRALE L excellente sélectivité spectrale au niveau de l absorption est obtenue grâce au grand déplacement de Stokes des cryptates de terres rares : les fluorophores accepteurs d énergie ne sont pas excités à la longueur d onde d excitation des fluorophores donneurs d énergie (Figure 30). Eu-K Abs. d2 Abs. Lumi4-Tb Abs. FL Abs. d2 Abs. Absorption Absorption 300 350 500 550 600 650 700 excitation 300 350 400 450 500 550 600 650 700 excitation Figure 30. La sélectivité spectrale (absorption). Le grand déplacement de Stokes du cryptate d europium (Eu-K) et du cryptate de terbium (Lumi4-Tb) permet d exciter les fluorophores donneurs d énergie sans toutefois exciter les accepteurs. d excitation correspond à la longueur d onde de la source lumineuse d excitation à 337 nm.
Page : 41/ 77 L excellente sélectivité spectrale au niveau de l émission est la conséquence d une bonne séparation entre le pic d émission des accepteurs et les pics d émission du cryptate d europium et de terbium. Les accepteur d2 et fluoresceine émettent dans des zones où les cryptates n émettent quasiment pas (Figure 31). Eu-K d2 FL Lumi4-Tb d2 Emission Emission 500 550 600 650 700 500 550 600 650 700 émission émission émission Figure 31. La sélectivité spectrale (émission). Le signal de RET provenant de l accepteur est mesuré à une longueur ou l émission du donneur est très faible : 520 nm pour la fluoresceine et 665 nm pour le d2. Les pics d émission du cryptate d europium se situent à des longueurs d ondes où le d2 absorbe ce qui rend le transfert d énergie entre ces molécules possible. La répartition des pics d émission du cryptate de terbium permet son utilisation soit avec le d2 soit avec la fluoresceine comme accepteurs (Figure 32).
Page : 42/ 77 Eu-K d2 Abs. FL Abs. Lumi4-Tb d2 Abs. Intensité Intensité 500 550 600 650 700 500 550 600 650 700 Figure 32. Intégrale de recouvrement des couples utilisés en TR-FRET. La surface de recouvrement est représentée en hachuré. Eu-K : cryptate d europium ; FL : fluoresceine ; Lumi4-Tb : cryptate de terbium. Les spectres d émission des donneurs sont représentés en traits pleins et les spectres d absorption des accepteurs en pointillés. b) LA SELECTIVITE TEMPORELLE Lors d un transfert d énergie entre un donneur possédant une durée de vie de fluorescence longue (cryptates de terres rares) et un accepteur fluorescent avec une durée de vie courte (d2, fluoresceine, etc.), ce dernier émettra un signal de fluorescence présentant une durée de vie apparente similaire à celle du donneur. Ainsi, l utilisation des cryptates de terres rares permet de mesurer l émission de fluorescence de l accepteur en temps résolu (intégration du signal après un délai de 50 µs pendant 400 µs). Cette propriété permet ainsi de distinguer la fluorescence de l accepteur engagé dans un FRET (durée de vie longue), des fluorescences parasites émises par les molécules présentes dans les milieux biologiques et dont la durée de vie de fluorescence est de l ordre de la nanoseconde (Figure 33).
Page : 43/ 77 Intensité de fluorescence Transfert d énergie Fluorescences parasites (milieu, cellules ) Pulse laser 0 Delai 50 400 Mesure Temps (µs) Donneur seul Figure 33. La sélectivité temporelle. Après un pulse laser à 337 nm pour exciter le donneur d énergie, un délai de 50 s est appliqué avant d effectuer la mesure de la fluorescence émise. Ce délai permet d éliminer les fluorescences parasites (milieu, autofluorescence des cellules, etc.) dont les durées de vie de fluorescence sont courtes (nanosecondes). Le signal de TR-FRET mesuré a donc seulement deux composantes : le signal de FRET et une petite contamination provenant du donneur d énergie qui n est pas engagé dans un FRET. c) LE FACTEUR D ORIETATIO Contrairement aux fluorophores organiques classiques et aux protéines fluorescentes, le facteur d orientation conditionne peu le transfert d énergie pour les cryptates de terres rares. En effet, le cation lanthanide (europium, terbium) est libre de toute rotation au sein de la cage formée par le cryptate et émet donc dans toutes les directions. L efficacité du transfert d énergie dépend donc principalement de la distance entre les fluorophores. Dans le cas du TR-FRET l absence de signal est donc bien révélatrice de l absence de proximité spatiale. Cela est une avancée majeure par rapport au FRET classique et au BRET (voir chapitre V) pour lesquels l absence de signal ne signifie pas nécessairement une absence d interaction.
Page : 44/ 77 Avantages des cryptates de lanthanide en TR-FRET : Les techniques de TR-FRET aussi appelées LRET pour Lanthanide-based Resonance Energy Transfer, présentent une plus grande sensibilité de détection que les méthodes de RET classiques et cela pour plusieurs raisons : - les cryptates de lanthanide ont un grand déplacement de Stokes. Les fluorophores accepteurs d énergie ne sont donc pas excités à la longueur d onde d excitation des fluorophores donneurs d énergie. - les accepteurs d énergie émettent dans des zones où les cryptates de lanthanide n émettent quasiment pas. - les cryptates de lanthanide ont des durées de vie d émission de fluorescence longues ce qui permet de s affranchir d une grande partie des signaux parasites grâce à la mesure en temps résolu. - le facteur d orientation affecte peu l efficacité du transfert d énergie. C est principalement le paramètre distance entre les fluorophores qui module l efficacité du RET. Limites des cryptates de lanthanide en TR-FRET : Ce sont les mêmes que pour les fluorophores organiques décrits précédemment.