HLBI608 Exploration structurale et fonctionnelle de la cellule, apport de la protéomique quantitative Audrey SIRVENT CRBM CNRS UMR5237 audrey.sirvent@crbm.cnrs.fr
Equipe «Tyrosine Kinases et Cancer» Comment SRC et ses substrats transmettent les signaux oncogéniques conduisant à la progression tumorale et à la formation de métastases? Cellule normale Cellule tumorale Facteur de croissance RTK Matrice extra-cellulaire Intégrines β Récepteurs à activité tyrosine kinase MET EPHA2 β Src FAK signalisation? Src FAK TyrK STAT3 Ras/MAPK PI3K/AKT STAT3 Ras/MAPK PI3K/AKT REPONSES CELLULAIRES -Prolifération/Différentiation -Motilité -Adhésion SIGNALISATION TUMORALE -Survie/Prolifération -Migration/Invasion -Angiogenèse?
I- Introduction à la protéomique II-Les grandes étapes et la préparation des échantillons III-Les différentes approches de protéomique quantitative -Electrophorèse bidimensionnelle quantitative -Marquages métaboliques et chimiques : SILAC, itraq, etc. -Quantification «Label Free» -Quantification ciblée de type MRM IV-L analyse des résultats et la validation V-Quelques exemples d application extraits de la littérature VI-QCM
I- Introduction à la protéomique II-Les grandes étapes et la préparation des échantillons III-Les différentes approches de protéomique quantitative -Electrophorèse bidimensionnelle quantitative -Marquages métaboliques et chimiques : SILAC, itraq, etc. -Quantification «Label Free» -Quantification ciblée de type MRM IV-L analyse des résultats et la validation V-Quelques exemples d application extraits de la littérature VI-QCM
Le protéome PROTEOME = ensemble des PROTEines exprimées par un génome Un seul génome différents protéomes Les protéomes sont dynamiques et changent en fonction : - du stade de développement - du cycle cellulaire - de la différenciation -de la réponse aux différents signaux extra- et intra-cellulaires -des conditions physio-pathologiques Le PROTEOME reflète les répercutions de ces différents évènements
La protéomique PROTEOMIQUE = étude des protéomes Basées sur la spectrométrie de masse (MS) Permet de donner une image globale et dynamique des systèmes biologiques dans leur complexité séparer, identifier et caractériser des protéines quantifier leur expression étudier des complexes décrypter leur fonction
De très nombreuses applications Analyse de protéomes complets Analyse des interactions (protéines-protéines, -ADN ou ARN, - substance chimique ) et des voies de signalisation Analyse des modifications post-traductionnelles (phosphorylation, ubiquitination, acétylation, glycosylation ) Etude de leur localisation spacio-temporelle et de leur dynamique Quantification de la variation de leur taux d expression entre différentes conditions Identification et dosage de biomarqueur etc.
Une évolution rapide vitesse, sensibilité et précision Bruce Thomson, Tutorials Nov 15, 2012 (Vol. 32, No. 20) Driving High Sensitivity in Biomolecular MS
Un nombre de publications croissant
I- Introduction à la protéomique II-Les grandes étapes et la préparation des échantillons III-Les différentes approches de protéomique quantitative -Electrophorèse bidimensionnelle quantitative -Marquages métaboliques et chimiques : SILAC, itraq, etc. -Quantification «Label Free» -Quantification ciblée de type MRM IV-L analyse des résultats et la validation V-Quelques exemples d application extraits de la littérature VI-QCM
Les grandes étapes Préparation des échantillons et choix de la stratégie de quantification Signification biologique Validation biochimique et fonctionnelle
Une grande variété d approches possible Question biologique? Marquage métabolique (SILAC, N15) Marquage chimique (ICAT, itraq, Marquage enzymatique (O18) Quantification absolue (Aqua, Qcon CAT) Label-free (Spectralcounting, ion abundancy) Single/multiple reaction monitoring SRM, MRM Logiciels d analyse: Maxquant, progenesis Organisme entier Biopsies/tissus/organes Fluides biologiques Culture de cellules primaires Culture de cellules stables Organites Cellules triées par FACS Quantification Echantillon Analyse Recherche dans les banques de données: Mascot, Sequest, X!Tamdem, Spectrum Mill, PEAKS, OMSSA, PepNovo, PTM Identification Fractionnement protéique Electrophorèse 1D ou 2D Isoélectrofocalisation (IEF) Chromatographie HPLC Immunoprécipitation Pull-down de protéines taguées Immunodépletion Préparation de échantillon Spectroscopie de masse Fractionnement peptidique Orbitrap MS Quadrupole TOF Triple quadrupole TOF-TOF MALDI (Ionisation laser assistée par matrice) Electrospray (ESI) Chromatographie liquide LC-MS Chromatographie Liquide à Interaction Hydrophile (HILIC) colonne d échange cationique fort (SCX) Colonne d échange anionique faible (WAX) Isoélectrofocalisation (IEF) Titanium dioxyde TiO2 Immobilized metal affinity IMAC Immunoprécipitation Biotinylation
La qualité de l échantillon est primordiale Plus propre sera l échantillon, meilleurs seront les résultats!!! Eliminer les molécules interférentes (sels, lipides, acides nucléiques, etc.) et les débris cellulaires Attention aux protéases et aux phosphatases (utilisation d inhibiteurs, travail à 4 C) Attention aux détergents (SDS, NP-40, Triton, Tween, etc.) Attention aux cryprotecteurs (DMSO, Glycerol, BSA, etc.) Rompre les interactions covalentes, ponts disulfures (Réduction/alkylation des échantillons) Attention à la contamination avec les kératines (blouse, gants, charlotte, hotte) Attention à la contamination avec les PEG (relargage du plastique des tubes et pointes)
Quelques exemples de contamination de spectre Spectre normal Contamination PEG Contamination détergent Contamination imidazole https://www.oppf.rcharwell.ac.uk/oppf/msuser/services/standard.jsp
Fractionnement, séparation, enrichissement Il faut la complexité du protéome!!! -Fractionnement de l échantillon : organes, cellules, compartiment subcellulaire - Séparation physicochimiques (électrophorèse, HPLC, ) - Sélection par activité/affinité (immunoprécipitation) - Immunodépletion
Fractionnement de l échantillon Fractionnement sub-cellulaire ou tissulaire Ultra-centrifugation Gradient de sucrose Tri de cellules par FACS Microdissection laser http://cfim.ku.dk/equipment/light_microscopy/palm/
Séparation physico-chimique des protéines Gels 2D Gel 1D SDS-PAGE Chromatographie HPLC
La digestion En protéomique on ne travaille pas sur des protéines entières mais sur des peptides!!! Protéine Peptides Digestion Principales enzymes utilisées : Trypsine Chymotrypsine Lys C Lys N CNBr XXX[KR]--[!P]XXX XX[FYW]--[!P]XXX XXXXXK--XXXXX XXXXXX KXXXX XXXXXM--XXXXX Nb : La digestion peut être réalisée -avant ou après le fractionnement/l enrichissement - «in gel» ou en liquide
Immunoprécipitation (IP) de protéines Il faudra faire attention aux IgG qui peuvent masquer le signal! Utilisation d anticorps couplés, élution, anticorps de Camelidae, migration sur gel SDS-PAGE -IP de protéines endogènes, anticorps spécifique -IP de protéines taguées, ex anti-flag, anti-ha, anti-gfp couplés -IP de protéines phosphorylées avec un anti-ptyr conjugué à des billes d agarose -Système Streptavidine/biotine http://www.chromotek.com/products/nano-traps/gfp-trap/
Les principales modifications post-traductionnelles Mann and Jensen, Nature Biotech. 21, 255 (2003)
Quelques outils utilisés pour l enrichissement -Anticorps spécifiques Phosphorylation sur tyrosine anti-ptyr Y P Acétylation sur lysine anti-acétyl Lysine Ac K Ubiquitination anti-k- -GG G G K -Enrichissement par chromatographie d affinité Phosphorylations oxyde de Titane TiO2 Fe 3+ IMAC-Fe 3+
La phospho-protéomique Phospho-protéomique identifier les sites de phosphorylation et quantifier le différentiel de phosphorylation. entre différentes conditions La phosphorylation = modification post-traductionnelle capitale des protéines qui permet de moduler : leur fonction / activité leur localisation sub-cellulaire leur stabilité leur capacité d interaction La phosphorylation permet une régulation fine des voies de signalisation et des processus cellulaires clés(différenciation, division, prolifération, apoptose, etc.) La proportion de phosphorylation sur sérine, thréonine et tyrosine est respectivement d environ 1800/200/1 (Gronborg et al., 2002; Mann et al., 2002)
En pratique Préparation des échantillons et choix de la stratégie de quantification Lyse et digestion trypsique (Fractionnement) Enrichissement IMAC, TiO2 anti-ptyr Analyse LC MS/MS
I- Introduction à la protéomique II-Les grandes étapes et la préparation des échantillons III-Les différentes approches de protéomique quantitative -Electrophorèse bidimensionnelle quantitative -Marquages métaboliques et chimiques : SILAC, itraq, etc. -Quantification «Label Free» -Quantification ciblée de type MRM IV-L analyse des résultats et la validation V-Quelques exemples d application extraits de la littérature VI-QCM
Electrophorèse bidimensionnelle quantitative (2D-DIGE) C est une approche de moins en moins utilisée http://icim.marseille.inserm.fr/spip.php?article35
Les nouvelles approches de protéomique quantitative Protéomique quantitative Approches globales Marquage Sans marquage LABEL-FREE Approches ciblées MRM ou SRM Multiple Reaction Monitoring Selected Reaction Monitoring Spectral count Intensité des pics Métabolique Chimique 14 N/ 15 18 N SILAC itraq ICAT O, TMT, Diméthyl Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation Isotope Coded Affinity Tag
Les approches de protéomique quantitative Asara et al., Proteomics 2008 Ong et al., MCP 2002 (ICAT) (itraq) Ross et al., MCP 2004 (SRM, MRM)
https://www.broadinstitute.org/scientific-community/science/platforms/proteomics/itraq Ross PL, Huang YN, et al. (2004) "Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents". Mol. Cell. Proteomics 3: 1154 69. L itraq = Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification
Le SILAC = «Stable Isotope Labelling by Amino acids in Cell culture» 2002 Condition 1 légère Condition 2 lourde «Légers» «Lourds» [ 12 C, 14 N]-Lys + [ 12 C, 14 N]-Arg [ 13 C, 15 N]-Lys +[ 13 C, 15 N]-Arg Cellules «légères» Cellules «lourdes» Mix des lysats 1:1 Fractionnement cellulaire/extraction protéique/purification Gel d électrophorèse SDS-PAGE Lys0 Lys6 Lys8 Digestion des bandes à la Trypsine LC/MS-MS Quantification l L ratio r = L/l m/z Arg0 Arg6 Arg10
Le triple marquage léger médium lourd
Le SILAC, pas uniquement pour les cellules en culture SILAC in vivo Animaux entiers (souris, vers, mouches, poisson zèbre, triton) Super-SILAC Pour les tissus/biopsies Geiger T et al., Nat Methods. 2010 2173-83, 2010 Oct. 1157-66, 2010 Jun.
2008 La technologie «Label Free» 2 grandes méthodes de traitement du signal : -le «spectral counting» -la mesure des intensités de pics (Neilson et al., 2011; Zhu et al., 2010) une très grande reproductibilité est nécessaire!!! - nanohplc robuste - appareil de masse précis et résolutif - nombreux réplicas techniques et biologiques
Avantages/ inconvénients des différentes méthodes Préparation des échantillons Nombre de comparaisons Précision de la quantification Profondeur d'analyse Label-free Marquage Chimique Super-SILAC SILAC SILAX SILAC in vivo simple, pas de marquage protocole multi-étape marquage sur culture cellulaire marquage en animalerie multiple jusqu'à 8 2 à 2 2 à 2 (3 pour le triple) faible faible haute haute haute haute bonne bonne Coût faible moyen moyen élevé
Approche quantitative ciblée de type MRM Les technologies SRM (Selected Reaction Monitoring) ou MRM (Multiple Reaction Monitoring) permettent de quantifier une ou plusieurs molécules cibles dans un échantillon biologique complexe http://www.cgfb.u-bordeaux2.fr/fr/content/la-prot%c3%a9omique-quantitative-cibl%c3%a9e Liebler D. C. and Lisa J. Zimmerman L. J. Targeted Quantitation of Proteins by Mass Spectrometry. Biochemistry (2013)
Permet une quantification absolue Peptide AQUA
Recherche et validation de biomarqueurs Phase Candidats Echantillons Découverte identification de candidats biomarqueurs 2D, LC MS/MS 1000 s <10 Vérification Vérification de la validité des candidats MRM, Elisa, immunoblot 10-100 10-100 Validation Spécificité et sensibilité avec un test optimisé MRM,Elisa, immunoblot <10 1000 s Visée diagnostique, pronostique, suivi thérapeutique
I- Introduction à la protéomique II-Les grandes étapes et la préparation des échantillons III-Les différentes approches de protéomique quantitative -Electrophorèse bidimensionnelle quantitative -Marquages métaboliques et chimiques : SILAC, itraq, etc. -Quantification «Label Free» -Quantification ciblée de type MRM IV-L analyse des résultats et la validation V-Quelques exemples d application extraits de la littérature VI-QCM
Interprétation des résultats Compte tenu du grand nombre de données générées il peut être parfois difficile d interpréter/de valider les résultats Combien de réplicas techniques et biologiques? SILAC : 2 réplicas biologiques peuvent être suffisants Label-free : 2 réplicas techniques et 3 réplicas biologiques Validation biochimique et fonctionnelle (Western-blots, shrna, etc.) Signification biologique? Clustering, analyse de pathway
Analyse des voies et réseaux en protéomique Un intérêt croissant De nombreux outils Fig. 1. Trends of pathway and network analysis in Proteomics from decade publications Xiaogang Wu, Mohammad Al Hasan, Jake Yue Chen Pathway and network analysis in proteomics Journal of Theoretical Biology, Volume 362, 2014, 44 52
Exemples
Toute approche de protéomique quantitative à ses limites On ne voit pas tout!!!
I- Introduction à la protéomique II-Les grandes étapes et la préparation des échantillons III-Les différentes approches de protéomique quantitative -Electrophorèse bidimensionnelle quantitative -Marquages métaboliques et chimiques : SILAC, itraq, etc. -Quantification «Label Free» -Quantification ciblée de type MRM IV-L analyse des résultats et la validation V-Quelques exemples d application extraits de la littérature VI-QCM
Etude de la signalisation EGFR par SILAC
Comparaison de la signalisation SRC in vitro et in vivo par SILAC SW620-Src MS analysis SW620 Diète «légère» [ 12 C]-Lys SW620-Src Diète «lourde» [ 13 C]-Lys xenograft 1 2 3 13 C-Lys diet Sacrifice 4 weeks 1 2 3 Tumeur «légère» Tumeur «lourde» Mix des lysats 1:1 Ratio 7.31:1 (88%) Immunopurification anti-ptyr Gel d électrophorèse 1D Digestion des bandes à la Lysine-C LC/MS-MS U3000_LTQ Orbitrap XL Analyses MaxQuant via Andromeda a b ratio r = b/a m/z
Identification de cibles additionnelles d inhibiteurs de kinase par protéomique chimique
Identification de biomarqueurs par une approche itraq et validation par SRM
I- Introduction à la protéomique II-Les grandes étapes et la préparation des échantillons III-Les différentes approches de protéomique quantitative -Electrophorèse bidimensionnelle quantitative -Marquages métaboliques et chimiques : SILAC, itraq, etc. -Quantification «Label Free» -Quantification ciblée de type MRM IV-L analyse des résultats et la validation V-Quelques exemples d application extraits de la littérature VI-QCM
QCM 1- Quelle(s)technologie(s) puis-je envisager pour réaliser une approche de protéomique quantitative sur des biopsies de tumeurs de patients? A-SILAC B-Label-FREE C-iTRAQ 2- J ai 4 conditions à comparer en parallèle, quelle(s) technologie(s) vais-je pouvoir utiliser? A-SILAC B-Label-FREE C-iTRAQ 3- La technologie Label-FREE est plus précise en terme de quantification que la technologie SILAC? A-Vrai B-Faux 4- Mon but est d identifier des sites de phosphorylation, il est préférable que je réalise mon enrichissement sur: A-Protéines? B-Peptides? 5- Je prévois de réaliser une approche de phospho-protéomique pour identifier de nouvelles cibles d une sérine/thréonine kinase, je peux réaliser mon enrichissement avec : A-des billes IMAC? B-des billes TiO2? C-un anticorps anti-ptyr? D-un anticorps anti-pser/thr?
QCM corrigé 1- Quelle(s)technologie(s) puis-je envisager pour réaliser une approche de protéomique quantitative sur des biopsies de tumeurs de patients? A-SILAC non, car on ne pourra pas marquer les tumeurs de patients avec les AA lourds B-Label-FREE C-iTRAQ 2- J ai 4 conditions à comparer en parallèle, quelle(s) technologie(s) vais-je pouvoir utiliser? A-SILAC B-Label-FREE C-iTRAQ non, le SILAC permet la comparaison simultanée de 2 échantillons, voir 3 maximum avec le triple marquage 3- La technologie Label-FREE est plus précise en terme de quantification que la technologie SILAC? A-Vrai B-Faux 4- Mon but est d identifier des sites de phosphorylation, il est préférable que je réalise mon enrichissement sur: A-Protéines? B-Peptides? 5- Je prévois de réaliser une approche de phospho-protéomique pour identifier de nouvelles cibles d une sérine/thréonine kinase, je peux réaliser mon enrichissement avec : A-des billes IMAC? B-des billes TiO2? C-un anticorps anti-ptyr? non, car ici on veut identifier des substrats d une S/T kinase D-un anticorps anti-pser/thr? attention c est un piège! En théorie oui, mais malheureusement il n existe pas d anticorps anti-ps/t génériques