La géné'que médicale et les applica'ons du séquençage à haut- débit Dr. Marco Belfiore FAMH en énétique Médicale Division de énétique et Infertilité ML-Laboratoires Médicaux / enesupport ARL, 02.10.2014 (Associa'on des Responsables de Laboratoire de la Suisse Romande)
Plan de la présenta'on Ø La géné(que médicale q Le génome humain q La maladie géné'que q Les anomalies géné'ques Ø Le séquençage à haut- débit q L évolu'on q La technique q Les applica'ons
Le génome humain Le génome humain: l'ensemble du matériel génétique d'un indivi Lors de la division cellulaire: - L ADN est condensé en 23 paires de chromosomes. - 22 paires d autosomes et 1 paire de gonosomes. De quoi le génome est-il constitué?
Le génome humain AAA 3 milliards de bases par génome, 4 bases (A). Quelle structure pour l ADN?
La double hélice d ADN A A A A A Protéine Fonction gène hromosome (23 paires) env. 25 000 gènes
Variations dans l ADN Le lien génotype/phénotype énotype AAA Manifestations cliniques Phénotype
Phénotype Quelle prescription en génétique médicale pour décrypter le génotype et expliquer le phénotype (la maladie génétique)? énotype
Deux lignées cellulaires Zygote/oeuf Développement embryonnaire Muta'ons héréditaires Maladies,tu,onnelles La lignée germinale amètes La lignée somatique Muta'ons non héréditaires Maladies soma,ques o acquises
Quelques exemples concrets Maladies géné'ques cons'tu'onnelles Maladies géné'ques soma'ques Mucoviscidose Hémochromatose Syndrome du X- Fragile horée de Hun'ngton Syndrome Prader- Willi Drépanocytose Leucémies Neuroblastomes Mélanomes
Les événements géné'ques 1 Remaniements chromosomiques ü ransloca<on ü Inversion ü Fusion ü Délé<on et Duplica<on ü Inser<on Muta(on ponctuelle ü Subs<tu<on ü Délé<on et inser<on Séquence répétée en tandem ü Répé<<on de triplet Env. 6000 maladies géné'ques rares
SEQUENAE NS (Next OU enera,on AURE Sequencing) (1 bp) PUE (50 Kbp) 1 FISH (300 Kbp) ARYOYPE (5 Mbp) 21 21 21 Nombreuses méthodes à résolutions variables, souvent pour des applications différentes, parfois qui se complètent.
Evolu'on du séquençage 1 Innovation Rendement oût (nbre de base/jour) (coût/génome)
Evolu'on du rendement 1 énome humain (3 b) Kilobase / jour année 100-1000 milliards de bases par jour
Evolu'on du séquençage 1 Innovation Rendement oût (nbre de bp/jour) (coût/génome)
hute des coûts 1 100 000 000 $ Nov-11 15 000 $ 2-5000 $ ca 1000 $ par génome
Evolu'on du séquençage 1 Innovation Rendement oût (nbre de bp/jour) (coût/génome)
L information dans quelques gouttes de 1 sang Innovation Extraction Préparations Séquençage «Reads» AA AA AA AA AA AA AA AA variation pathologique Filtration rouver les variations onstruction de la séquence
Séquençage massif en parallèle 1 Amplification 1 à quelques unités de séquençage AA n unités de séquençage Amplification AA AA AA
Séquençage à molécules uniques 1 Amplification omment ça marche?
Le séquençage et l innova'on 2 produire plus plus rapidement moins cher meilleure qualité
Système de bases modifiées 2 A A - Marquées - erminées A A
Système de bases modifiées 2 A A A A DEEION
Système de bases modifiées 2 A A A A DEEION
Système de bases modifiées 2 A A A A DEEION
Système de bases modifiées 2 A A A A
Variation du ph 2 A A A A A A
2 A A A A A A H + Modification du ph
2 A A A A A A H + Modification du ph
Nanopore et champ électrique 2 2 complexes protéiques Exonuclease (clivage des bases) Nanopore (séquençage) Processus Varia<on du champ électrique est spécifique à la base qui traverse le pore
L information dans quelques gouttes de sang 3 Extraction Préparations Séquençage «Reads» AA AA AA AA AA AA AA AA variation pathologique filtration rouver les variations construction de la séquence
Le montage des séquences 3 me ain plet «Read» AAAA varia<on pathologique Assemblage Alignement 2 000 000 variations Seq. Ref. A Identifier les variations
Après le séquençage la route est encore longue 3 Variations de prédispositions énom e humain omplet Variations bénignes 2 000 000 Variations de signification incertaine variation pathologique Faux positifs omment réduire la mplexité? variation pathologique
Réduire la complexité: l exome 3 «85% des mutations qui causent des maladies génétiques sont situées dans les exons (régions codantes des gènes) M M Protéine Pas d effet Région génique Région intergénique Fonction Effet pathologique
Le séquençage de l exome 3 ca 3 milliards de bases Séquençage du génome 2 000 000 variations énome humain complet apture des exons ca 50 millions de bases Séquençage des exons 20 000 variations
La détec'on des varia'ons 3 NextENe (softgenetics) Séquence de Référence Un programme informa<que permet de visualiser l alignement des «reads» sur génome de référence. Il permet égalemen d automa(ser la détec(on des muta(on La référence est. L analyse des «read montre deux popula<ons: l une avec une l autre avec un. Le pa<ent est donc hétérozygote pou ceqe posi(on (1 chromosome porte une l autre chromosome porte un ).
20 000 variations séparer le bon 3 grain de l ivraie Extraction Séquençage Préparations de l exome «Reads» AA AA AA AA AA AA AA AA variation pathologique Méthodes de filtration 20 000 variations construction de la séquence
Réduc'on de la complexité 3 Recoupement des données 20 000 variations Pertinence biologique Qualité Variations «bénignes» Bases de données dbsnp In house db variation pathologique
Filtra'on basée sur les apparentés méthode du trio 3 Parents sains varia<ons varia<ons Iden'fica'on des différences Enfant malade variation pathologique
Filtra'on basée sur les apparentés 3 plusieurs généra'ons varia<ons varia<ons Iden'fica'on des différences variation pathologique familiale
Filtra'on chez les non- apparentés 4 l intersec'on a<ents, de familles érentes, qui ont le me phénotype (le me tableau clinique) variations variations variations Variations dans le même gène ène impliqué dans une pathologie commune
onnaître la cible: le panel de gène 4 ca 3 milliards de bases Séquençage du génome 2 000 000 variations énome humain complet Sélection de gènes Quelques centaines de variations
Le panel de gènes 4 Quelques panels de la firme illumina 4813 gènes associés à des pathologies connues 46 gènes impliqués dans certaines pathologies cardiaques héréditaires 100 gènes impliqués dans l au(sme
onnaître la cible: le gène unique 4 ca 3 milliards de bases Séquençage du génome 2 000 000 variations énome humain complet Sélection d un gène Quelques dizaines de variations
Un seul gène 4 MiSeqDx ys(c Fibrosis linical Sequencing Assay Kit perme_ant le séquençage du gène FR impliqué dans la mucoviscidose Détec<on de 139 muta(ons connues (37 actuellement par hybrida<on inverse) Enorme couverture (haque base est lue 3000x) Système approuvé par la FDA
Détection des aneuploïdies en prénatal 4 neuploïdie: modifica<on du nombre de chromosomes (risomie 13, 18 et 21, monosomie X, ) Méthode conventionnelle: Dépistage du 1 er trimestre (11 ème et 14 ème SA) - l'âge maternel - mesure par échographie de la clarté nucale - dosage hormonal (β-h + PAPP-A) Evalua<on du risque Méthod invasiv Perte du fœ 0.5-1%
Le dépistage prénatal non-invasif 4 ertaines cellules du trophoblaste (placenta), par mort cellulaire, libèrent de l ADN fœtal dans la circula(on sanguine maternelle. et ADN fœtal libre (ffdna pour free fœtal DNA) cons<tue ca 3-5% de l ADN total libre présent dans le sang.
Un cas classique en prénatal 4 Situation: grossesse à 12 SA. Indications: - âge maternel > 35 ans. Recherche: aneuploïdie. - 1: 1/380 à 1/50 (risque intermédiaire) - pas de signe échographique Analyse: doit-on prendre le risque d une méthode invasive réduire le risque en effectuant un dépistage prénatal non-invasif
Le dépistage prénatal non-invasif 4 ertaines cellules du trophoblaste (placenta), par mort cellulaire, libèrent de l ADN fœtal dans la circula(on sanguine maternelle. et ADN fœtal libre (ffdna pour free fœtal DNA) cons<tue ca 3-5% de l ADN total libre présent dans le sang. Isola(on du plasma par centrifuga<on Extrac(on de l ADN libre (ADN fœtal et ADN maternel libres)
Le dépistage prénatal non-invasif 4 ADN libre Préparations Séquençage «Reads» AA AA AA AA AA AA AA AA ofil normal Résultat néga(f fil anormal obable 21) Résultat posi(f est invasif!!! La quantité de «reads» pour chaque chromosome est calculée
Si le résultat est posi'f 5 Liquide amniotique alors test invasif centrif. Amniocentèse 15-20 ml LA 14-18 semaines Risque 0.6% FISH RAPIDE (1) Obtenir un résultat sûr le plus rapidement possible ULURE ARYOYPE (2) onfirmer et compléter le résultat rapide et le DPNI
L analyse rapide par FISH 5 21 21 21 FISH: hybrida<on in situ en fluorescence. Sonde: s hybride à une région par<culière du chromosome 21. Matériel: amniocystes en interphase. Délai: résultat en 24 heures (pas de culture).
L analyse de la structure 5 On réalise le caryotype après la culture (Résultat: 10-14 jours) OU 47,XY,+21 3 chromosomes 21 libres Peu de risque de récurrence 46,XY,t(14;21),+21 Un chromosomes 21 supplémentaire est lié à un chromosome 14 Risque de récurrence élevé L analyse DPNI et le FISH n ont pas donné d informa(on sur la structure des chromosomes et ne permeqent donc pas d évaluer le risque de récurrence.
Les points à retenir 5 volu,on du séquençage à haut- débit. acilité à générer des données (100-1000 b/jours). ifficulté pour l analyse de données et l interpréta,on. énome en'er > Exome > Panel de gènes > ène unique: la juste mesu PNI par NS en rou'ne. PNI anormal, alors méthode invasive pour confirmer et compléter.
Des ques'ons? 5???????? erci pour votre Len,on Marco Belfiore H en énétique Médicale ision de énétique et Infertilité L-Laboratoires Médicaux / enesupport