SESSION 2007 CAPET externe et CAFEP Section : Biotechnologie Option : Biochimie-génie biologique TRAVAUX PRATIQUES Première partie : Techniques de Biochimie MANIPULATION Durée : 4 heures Documents personnels non autorisés Page 1 sur 7
Recherche d optimisation de culture de micro algues en vue d augmenter leur activité anti-oxydante Arthrospira platensis est une cyanobactérie, algue procaryote, connue aussi sous le nom de spiruline en raison de sa morphologie. Elle est facilement cultivable et capable de s adapter à des milieux environnementaux peu favorables (salinité élevée, ph alcalin ). Ces contraintes environnementales induisent une production accrue de molécules toxiques (radicaux libres, peroxyde d hydrogène) dont l élimination nécessite l activation de mécanismes antioxydants. On s intéressera à la possibilité d augmentation : - des activités d enzymes «détoxifiantes», - de synthèse de pigments antioxydants. L optimisation de production de ces enzymes et de ces pigments présente à terme, un réel intérêt économique. La salinité étant un paramètre peu coûteux et facile à modifier, on se propose de rechercher son influence sur l activité peroxydase et sur la synthèse de pigments chlorophylliens. Une souche d Arthrospira platensis est cultivée dans trois milieux de culture de salinité différente. Toutes les autres conditions de culture sont par ailleurs identiques (luminosité, ph, température, composition ). 1 Détermination de la salinité d une eau de mer Les micro-algues sont cultivées en eau de mer. Cette eau sera utilisée pour préparer deux autres milieux, de salinité plus élevée. 1.1 Principes des méthodes utilisées 1.1.1 Méthode de Mohr Réactions mise en jeu Ag + + Cl - = AgCl (s) précipité blanc Le chromate de potassium est utilisé comme indicateur de fin de réaction, pour déceler l excès d ions Ag + : 2Ag + 2- + CrO 4 = Ag 2 CrO 4 (s) précipité rouge 1.1.2 Dosage potentiométrique des ions chlorures La différence de potentiel est mesurée entre : une électrode d'argent dont le potentiel est fonction de la concentration en ions Ag +, A 20 C E = E Ag+ + 0,06 log [Ag + ] et une électrode au sulfate mercureux (Hg 2 SO 4 ) de potentiel fixe E = 0,65 V. Page 2 sur 7
1.2 Mode opératoire 1.2.1 Matériels et réactifs o Solution de nitrate d'argent de concentration voisine de 100 mmol.l -1 100 ml o Echantillon d eau de mer 30 ml o KCl pur et anhydre o Pissette d eau permutée o Flacon compte goutte de chromate de potassium o Matériels de pesée o Potentiomètre, électrode d'argent, électrode au sulfate mercureux o 2 fioles d Erlenmeyer o 1 pipette jaugée de 10 ml o 1 pipette jaugée de 20 ml o 1 fiole jaugée de 100 ml 1.2.2 Etalonnage de la solution de nitrate d'argent par pesée de KCl Réaliser l étalonnage en présence de quelques gouttes de chromate de potassium. 1.2.3 Dosage des chlorures de l eau de mer par potentiométrie (un essai) Réaliser le dosage potentiométrique sur 20 ml d eau de mer diluée au 1/10. 1.3 Compte rendu 1.3.1 Etalonnage de la solution de nitrate d argent Calculer la concentration molaire de la solution de nitrate d argent. Données : écart maximal toléré entre deux essais : 0,2 mmol.l -1 incertitude sur le dosage : 0,1 mmol.l -1 1.3.2 Dosage des chlorures de l eau de mer Tracer E = f (v AgNO3 ) Déterminer le volume équivalent en justifiant sa détermination. Calculer la concentration massique de l eau de mer en chlorure de sodium (CV = 3%) La culture de Arthrospira platensis est réalisée dans des bioréacteurs de 5 L. Calculer les masses de chlorure de sodium à introduire dans l eau de mer pour préparer les milieux 2 et 3. (L augmentation de volume due à l addition de sel est négligée). Milieux r NaCl en g.l -1 masse de NaCl à ajouter en g Eau de mer milieu 1 ρ 1 valeur du dosage 0 Milieu 2 Milieu 3 ρ 2 = 45 ρ 3 = 70 Données : K : 39,1 Cl : 35.5 Na : 23 2 Détermination des activités spécifiques peroxydasiques Les activités spécifiques d extraits de spiruline cultivée dans des conditions de salinité standard (ρ 1 ), moyenne (ρ 2 = 45 g.l -1 ) et élevée (ρ 3 = 70 g.l -1 ), sont comparées. Page 3 sur 7
2.1 Réaction catalysée La peroxydase catalyse l oxydation de biomolécules en présence de peroxyde d hydrogène. Dans la méthode choisie, le peroxyde d'hydrogène oxyde un mélange de phénol et de 4 amino antipyrine en quinonéimine, rose. 2.2 Détermination du coefficient d absorbance molaire de la quinonéimine 2.2.1 Réactifs et matériels o Solution de quinonéimine à 0,1 mmol.l -1 (5 ml) o Eau permutée o 6 semi-microcuves de spectrophomètre, visibles o P1000 2.2.2 Mode opératoire Dans une série de 6 cuves, préparer une gamme aqueuse de pas régulier de quinonéimine entre 0 et 0,1 mmol.l -1 sous un volume final de 1 ml. Mesurer les absorbances à 505 nm. 2.2.3 Compte-rendu Donner le tableau de préparation de la gamme. Présenter les résultats expérimentaux. Etablir la formule littérale donnant la valeur du coefficient d absorbance molaire en m 2.mol -1 et la calculer. 2.3 Préparation de la solution de peroxyde d hydrogène La solution de peroxyde d hydrogène est préparée à partir d une solution du commerce dont le titre annoncé est 30 volumes. Pour réaliser la mesure d activité, il est nécessaire de préparer une solution de peroxyde d hydrogène à 100 mmol.l -1. Présenter le mode opératoire de préparation de cette solution. Données - Le titre en volume correspond au volume de dioxygène que peut libérer un litre de solution de peroxyde d'hydrogène selon l'équation de décomposition H 2 O 2 = H 2 O + ½ O 2. - V molaire gaz parfait = 22,4 L.mol -1 Page 4 sur 7
2.4 Détermination de l activité spécifique peroxydasique des extraits de spiruline 2.4.1 Réactifs et matériels o Tampon phosphate ph 6,6 8 ml o Solution de 4 amino antipyrine 150 mmol.l -1 2 ml o Solution de peroxyde d hydrogène 100 mmol.l -1 1 ml o Solution de phénol 100 mmol.l -1 2 ml o extraits de spiruline : o E 1 (témoin), 600 µl o E 2 (spiruline cultivée dans le milieu 2) 600 µl o E 3 (spiruline cultivée dans le milieu 3). 600 µl o Réactif cupro-alcalin en distributeur réglé sur 2 ml o Solution standard de SAB à 10 g.l -1 4 ml o Eau physiologique 6 ml o 16 macrocuves visibles o 4 microcuves visibles o Flacon pour préincuber la solution de travail o P1000, P100 et pipette graduée de 5 ml 2.4.2 Mesure d activité des extraits E1, E2 et E3 Préparer 5 ml de solution de travail de la façon suivante : - 1 ml de 4 amino antipyrine, 150 mmol.l -1-0,5 ml de peroxyde d hydrogène, 100 mmol.l -1-1 ml de phénol, 100 mmol.l -1 - q.s.p. 5mL tampon phosphate ph 6,6 Dans une microcuve visible, introduire 1 ml de solution de travail préincubée à 30 C. Ajouter 50 µl d extrait enzymatique et suivre l absorbance pendant 2 minutes à 505 nm, à 30 C. Réaliser les tests en simple sur chaque extrait. Page 5 sur 7
2.4.3 Détermination de la concentration protéique des extraits E1, E2 et E3 Afin de s affranchir de l effet matrice, le dosage protéique sera réalisé par la méthode des ajouts dosés. Principe chimique du dosage En milieu alcalin, les ions Cu 2+, se complexent avec les groupements amides des liaisons peptidiques donnant un complexe coloré qui absorbe à 540 nm. Dosage sur chaque extrait Dans une série de cuves de spectrophotomètre : - introduire 0, 1, 2, 3 et 4 mg de SAB par cuve ; - compléter à 0,4 ml avec de l eau physiologique ; - ajouter 100 µl d extrait de spriruline dans chaque cuve ; - ajouter 2 ml de réactif cupro-alcalin ; - placer 30 minutes à l obscurité avant de lire l absorbance à 540 nm. Prévoir un seul blanc sans extrait pour les trois dosages. 2.4.4 Compte - rendu 2.4.4.1 Mesure des activités Déterminer la valeur DA.min -1 et calculer la concentration d activité catalytique en U.mL -1 pour chaque extrait. Donnée : Une unité d activité enzymatique (U) est définie comme la quantité d enzyme catalysant l apparition d une micromole de quinonéimine par minute, dans les conditions opératoires. Le CV est estimé à 8%. 2.4.4.2 Détermination des concentrations en protéines de chaque extrait Expliquer l effet matrice et préciser en quoi la méthode des ajouts dosés permet de s en s affranchir. Citer une autre contrainte justifiant l utilisation de cette méthode. Présenter le tableau de colorimétrie du dosage des protéines et les résultats expérimentaux. Calculer, à l aide de l outil informatique, la concentration protéique en g.l -1 de chaque extrait. Le CV est estimé à 4%. 2.4.4.3 Bilan Calculer les activités spécifiques peroxydasiques des trois extraits de spiruline. Comparer et conclure. Page 6 sur 7
3 Extraction et contrôle semi-quantitatif des pigments anti-oxydants 3.1 Traitement préalable L extraction est réalisée à partir de 300 ml de culture de spiruline dans l eau de mer standard (P 1 ), ou dans l eau de mer à 45 g.l -1 de NaCl (P 2 ), ou dans l eau de mer à 70 g.l -1 de NaCl (P 3 ). 3.2 Réactifs. Matériels o 1 plaque de gel de silice (5 cm sur 10 cm) o 1 cuve de développement o solvant de chromatographie : mélange éther de pétrole (8V) et acétone (1V) o extraits notés P 1, P 2 et P 3 ( dans la glace) o 1 tube Eppendorf vide o 1 ml d acétone (dans la glace) 3.3 Mode opératoire Les pigments sont séparés par c.c.m., les dépôts sont quantitatifs. Réaliser une dilution au ½ de P 1 dans l acétone. Sur la plaque gel de silice, par fractions successives de 0,5 µl, déposer 3 µl, 2 µl, 1 µl de P 1 et 1 µl de P 1 au ½. Déposer, de la même façon, 2 µl des extraits P 2 et P 3. Laisser migrer à l obscurité. Entourer rapidement les spots correspondant aux différents pigments. Remarque: Ne pas laisser trop longtemps les plaques exposées à la lumière. 3.4 Compte-rendu Identifier les pigments. Justifier la migration différentielle entre les xanthophylles et les carotènes. Comparer les résultats et en déduire l effet de la salinité sur la synthèse des pigments chez Arthrospira platensis. Dresser un bilan des résultats. Données Les pigments chlorophylliens sont aisément reconnaissables par leur couleur : chlorophylles : vert/bleu ; xanthophylles et carotènes: jaune/orange ; les xanthophylles sont des dérivés hydroxylés de carotènes. Page 7 sur 7