TABLE DES MATIERES OBJECTIFS 1 PARTIE I : INTRODUCTION 2

TABLE DES MATIERES OBJECTIFS 1 PARTIE I : INTRODUCTION 2 CHAPITRE 1 LE FACTEUR TISSULAIRE ET LES SERINES PROTEASES DE LA COAGULATION 3 Avant-propos 4 1. Le facteur tissulaire 5 1.1. La dénomination 5 1.2. Les données génétiques 5 1.2.1. Gène Chromosome 5 1.2.2. ARN messager ADN complémentaire 5 1.2.3. Le peptide signal 6 1.3. La structure de la protéine 6 1.3.1. Le poids moléculaire 7 1.3.2. Le facteur tissulaire sous sa forme complète 7 1.3.2.1. Le domaine extracellulaire 7 1.3.2.2. La queue intracytoplasmique 8 1.3.3. Le facteur tissulaire alternativement épissé 9 1.4. L expression du facteur tissulaire 9 1.4.1. Le facteur tissulaire dans le tissu interstitiel 9 1.4.2. Le facteur tissulaire dans le sang 10 2. Les sérines protéases d intérêt 12 2.1. Introduction 12 2.2. Structure générale des sérines protéases d intérêt 12 2.3. Synthèse générale 14 2.4. Le facteur VII(a) 14 2.4.1. La dénomination 14 2.4.2. Gène Chromosome 14 2.4.3. La structure de la protéine 15 2.4.4. La concentration sanguine 16 I

2.4.5. Le complexe facteur tissulaire facteur VIIa 16 2.6. Le facteur X(a) 17 2.6.1. L historique 17 2.6.2. La dénomination 17 2.6.3. Gène Chromosome 17 2.6.4. ARN messager ADN complémentaire 18 2.6.5. La structure de la protéine 18 2.6.6. La concentration sanguine 19 2.6.7. L activation du facteur X 19 2.7. La thrombine 20 2.7.1. L historique 20 2.7.2. La dénomination 20 2.7.3. Gène Chromosome 20 2.7.4. ARN messager ADN complémentaire 20 2.7.5. La structure de la protéine 21 2.7.6. La prothrombine 22 2.7.7. L activation de la prothrombine 23 2.7.8. D-Phe-Pro-Arg-chloromethylketon (PPACK) 24 3. La coagulation 25 3.1. Introduction 25 3.2. La voie extrinsèque de la coagulation 25 3.3. Les complexes 27 3.3.1. Le complexe tenase extrinsèque 27 3.3.2. Le complexe prothrombinase 27 CHAPITRE 2 LES RECEPTEURS AUX SERINES PROTEASES D INTERET 29 1. Introduction 30 2. Protease-activated receptor-1 (PAR-1) 31 2.1. La dénomination 31 2.2. Gène Chromosome 31 2.3. ARN messager ADN complémentaire 32 2.4. La structure du récepteur 32 2.5. Le mécanisme d activation du récepteur 32 II

2.6. L expression du récepteur 35 3. Protease-activated receptor-2 (PAR-2) 36 3.1. La dénomination 36 3.2. Gène Chromosome 36 3.3. ARN messager ADN complémentaire 36 3.4. La structure du récepteur 36 3.5. L activation du récepteur 37 3.6. L expression du récepteur 37 4. Protéases et peptides activateurs des récepteurs PAR 39 4.1. Introduction 39 4.2. Les protéases activant le récepteur PAR-1 39 4.3. Les protéases activant le récepteur PAR-2 41 4.4. Remarques sur les agonistes et activateurs des récepteurs PAR 41 4.5. Les peptides agonistes 42 4.6. Le tableau récapitulatif 43 5. La transmission du signal 44 5.1. La relation entre la concentration en ligand et la réponse cellulaire 44 5.2. La signalisation induite par PAR-1 44 5.2.1. La voie Gα o 45 5.2.2. La voie Gα 12 45 5.2.3. La voie Gα I/0 46 5.2.4. Les sous-unités βγ 46 5.3. La signalisation induite par PAR-2 46 6. La terminaison du signal 48 6.1. Introduction 48 6.2. Protease-activated receptor-1 48 6.2.1. La phosphorylation du récepteur 48 6.2.2. L internalisation du récepteur 49 6.2.3. L internalisation constitutive du récepteur 50 6.3. Protease-activated receptor-2 50 7. Réponses fonctionnelles à l activation des récepteurs PAR 52 7.1. Introduction 52 7.2. Protease-activated receptor-1 52 III

7.2.1. L agrégation plaquettaire 52 7.2.2. La barrière endothéliale et l inflammation 52 7.2.3. La croissance cellulaire et la division 53 7.2.4. Le système nerveux 53 7.2.5. Le système cardiovasculaire 54 7.3. Protease-activated receptor-2 54 7.3.1. La barrière endothéliale et l inflammation 54 7.3.2. Le système nerveux 54 7.3.3. Le système cardiovasculaire 54 7.3.4. Le tractus intestinal 54 7.3.5. Le tractus respiratoire 55 CHAPITRE 3 LA SIGNALISATION CALCIUM 56 1. Introduction et bref historique 57 2. Les composants cellulaires participant à la signalisation calcium 60 2.1. Les réserves de Ca 2+ 60 2.2. Les éléments participant à la sécrétion du Ca 2+ intracellulaire 61 2.2.1. Description générale 61 2.2.2. L inositol trisphosphate 1,4,5 (IP 3 ) 63 2.2.3. Le récepteur InsP 3 R 65 2.3. Les canaux d entrée du Ca 2+ extracellulaire 66 2.4. Les composants de terminaison du signal Ca 2+ 68 2.5. Le "Ca 2+ signaling toolkit" 68 3. Les mécanismes de la signalisation Ca 2+ 70 3.1. L augmentation élémentaire du Ca 2+ intracellulaire 70 3.2. Les événements nécessaires au démarrage du signal Ca 2+ 71 3.3. Les vagues de Ca 2+ 72 3.4. Les oscillations de Ca 2+ 73 3.5. La fin de la signalisation 74 4. Les effets induits par un signal Ca 2+ 76 4.1. Les senseurs au Ca 2+ 76 4.2. Quelques exemples de processus induits par le calcium 76 IV

PARTIE II : MATERIELS ET METHODES 78 1. La culture cellulaire 79 1.1. Le matériel 79 1.2. La culture des cellules endothéliales 79 1.3. La culture des cellules de la lignée SaOS-2 80 1.4. La culture des cellules de la lignée U87 80 2. La mesure du temps de coagulation 80 3. Les mesures du [Ca 2+ ] i 81 3.1. Le matériel 81 3.2. Principe et instrumentation 82 3.2.1. Les sondes fluorescentes 82 3.2.2. Le principe 83 3.2.3. L instrumentation 84 3.3. La mesure du [Ca 2+ ] i dans les HUVEC stimulées par les sérines protéases 86 3.4. La mesure du [Ca 2+ ] i dans les HUVEC stimulées par du plasma en coagulation 87 3.5. La mesure du [Ca 2+ ] i dans les cellules SaOS-2 stimulées par les sérines protéases 87 4. La mesure de la sécrétion des cytokines par ELISA 88 5. L immunohistochimie 89 6. La transcription inverse (RT) et la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 89 6.1. Le matériel 89 6.2. L extraction de l ARN total 90 6.3. La transcription inverse (RT) 90 6.4. La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 90 7. La PCR quantitative 91 8. La mesure de survie cellulaire 91 9. La mesure d apoptose 91 10. La mesure de prolifération cellulaire 92 11. Les statistiques 92 V

PARTIE III : RESULTATS 93 I. REPONSES DES CELLULES ENDOTHELIALES SOUMISES A DES CONDITIONS DE COAGULATION 94 1. Introduction 95 2. Stimulation des HUVEC par le complexe TF FVIIa 96 3. Stimulation des HUVEC par le facteur Xa 98 3.1. Caractérisation du signal 98 3.2. Délai de réponse 101 3.3. Activité catalytique de facteur Xa dans la signalisation 102 3.4. Effet du complexe TF-FVIIa sur la signalisation induite par le facteur Xa 105 4. Stimulation des HUVEC par la thrombine 107 5. Induction de signaux calciques distincts par le facteur Xa et la thrombine 108 5.1. Distinction des mobilisations de calcium intracellulaire 108 5.2. Récepteur engagé dans la signalisation induite par le facteur Xa 109 6. Signalisation induite par la génération in situ des sérines protéases facteur Xa et thrombine 111 6.1. Mesure du temps de coagulation du plasma appauvri en plaquettes par le facteur tissulaire humain recombinant 111 6.2. Activation in situ du facteur X 112 6.3. Activation in situ de la thrombine 114 7. Sécrétions de cytokines induites par le facteur Xa et la thrombine 116 8. Réponses des cellules endothéliales traitées avec du plasma en coagulation 118 II. EFFETS DE SERINES PROTEASES SUR UNE LIGNEE CELLULAIRE D OSTEOSARCOMES (SA-OS-2) 121 1. Introduction 122 2. Signal calcium induit par la thrombine 123 2.1. Caractérisation du signal 123 2.2. La signalisation calcium induite par la thrombine fait intervenir le récepteur PAR-1 125 2.3. Rôle du site actif de la thrombine dans la signalisation 127 2.4. Activation unique et irréversible de PAR-1 par la thrombine 127 VI

2.5. Temps de recouvrement du récepteur PAR-1 128 3. Expression du facteur tissulaire dans les cellules de la lignée SaOS-2 132 4. Signalisation calcium induite par le complexe facteur tissulaire facteur VIIa 134 4.1. Caractérisation du signal 134 4.2. La signalisation induite par le complexe facteur tissulaire facteur VIIa passe par le récepteur PAR-2 135 5. Signalisation calcium induite par le facteur Xa 137 5.1. Caractérisation du signal 137 5.2. Rôle du site actif du facteur Xa 138 5.3. Récepteurs intervenant dans la signalisation induite par le facteur Xa 140 5.4. Effet du complexe TF-FVIIa sur la signalisation induite par le facteur Xa 141 6. Addition des effets du facteur Xa et de la thrombine 144 7. Effets des sérines protéases d intérêt sur l apoptose cellulaire 146 7.1. La thrombine et le facteur Xa augmentent la survie des SaOS-2 par l intermédiaire du récepteur PAR-1 146 7.2. L augmentation de la survie passe par une diminution de l apoptose 147 7.3. L augmentation de la survie cellulaire par la thrombine est maximale à 10nM 149 7.4. Les sites actifs de la thrombine et du facteur Xa sont requis pour diminuer l apoptose 150 7.5. En présence du facteur VIIa ou du complexe facteur tissulaire humain recombinant facteur VIIa, le facteur Xa ne diminue plus l apoptose cellulaire 151 7.6. La diminution de l apoptose suite à l activation de PAR-1 passe par l activation de la voie MAP kinase ERK/MEK 1/2 152 7.7. Le lien entre PAR-1 et la voie des MAP kinases ERK/MEK 1/2 est réalisé par la phosphatidylinositol-3 kinase 153 PARTIE IV : DISCUSSION 156 I. DE LA SIGNALISATION INDUITE PAR LA THROMBINE 157 1. De la forme du signal 158 2. Du récepteur en jeu 159 VII

3. Des ostéoblastes et des cellules endothéliales 163 4. De l amplitude de la réponse 164 5. De l étude de la dérivée première de la pente 166 6. De l activation de la prothrombine 166 7. En résumé 167 II. DE L ANALYSE DU SIGNAL INDUIT PAR LE FACTEUR XA DANS DEUX LIGNEES CELLULAIRES 168 1. De la description du signal 169 2. De la suspension des cellules endothéliales versus leur adhérence 169 3. De l amplitude de la réponse 171 4. Du délai de réponse 171 5. De l activation de PAR-2 par le facteur Xa 175 III. DE LA SIGNALISATION INDUITE PAR LE FACTEUR VIIA ET LE COMPLEXE QU IL FORME AVEC LE FACTEUR TISSULAIRE 176 1. De l expression du facteur tissulaire par les cellules de la lignée SaOS-2 177 2. De la signalisation calcium induite par le complexe facteur tissulaire facteur VIIa 178 3. Du rôle du complexe facteur tissulaire facteur VIIa dans la qualité de la signalisation induite par le facteur Xa 180 IV. DE L APOPTOSE DES OSTEOSARCOMES 181 1. De PAR-1, de l apoptose et des voies de signalisation 182 2. De l apoptose dans les ostéoblastes 184 3. De la prolifération cellulaire et de PAR-2 185 4. De la signification physiologique de l apoptose 186 CONCLUSION 187 ABREVIATIONS 189 REFERENCES 192 ANNEXES 223 THESE ANNEXE 272 VIII