22 juin 2017 Page 1 de 7 1. Domaine et application L'ELISA/T.b.gambiense permet de détecter d anticorps dans le sang séché sur papier Whatman 4 contre les glycoprotéines de surface LiTat 1.3 et LiTat 1.5 de Trypanosoma brucei gambiense qu on utilise pour sensibiliser la plaque. La réalisation de ce testt requière une expertise et l équipement d un laboratoire de référence. 2. Responsabilités SOP Titre: ELISA/T.b.gambiense sur sang séché sur papier filtre Whatman 4 Étude: Outils diagnostiques pour l élimination et les essais cliniques dans la trypanosomiase humaine africaine (DiTECT-THA) Fonction Technicien de labo Activités Extraction des anticorps du sang séché sur papier filtre Whatman 4 Exécution du test ELISA Enregistrement et analyse des résultats 3. Procédures 3.1 Précautions Le port de gants à usage unique est obligatoire pendant toutes les manipulations. Le port d une blouse de laboratoire correctement ferméee est obligatoire. 3.2 Matériel et échantillons 3.2.1 Équipement et petit matériel Perforatricee 6 mm Balance de précision Vortex mixer Fioles jaugées de 250 ml, 1000 ml, 5 litres Cylindres gradués de 100 ml Bouteilles "Duran" de 250 ml et 1000 ml (stérilisable) Frigo (4-8 C) Congélateur (-20 C) Ultrafreezer (-80 C) Micropipette multicanaux de 300 µl, 8 canaux Micropipettes variables de 2-20 µl, de 200 µl et de 10000 µl Bidons 5 litres Lecteur ELISA avec filtre 414 ou 415 ou 405 (e.g. Multiskan RC) Ordinateur connecté avec lecteur ELISA Imprimante Cryoboxes (pour tubes Sarstedt 2 ml) pour congeler les antigènes, le conjugué et les contrôles positifs et négatifs (Sarstedt, réf. 950064981) Couvercles pour microplaques (Corning, VWR, réf 734-1538) Réservoir à réactifs (VWR, réf. 613-1185) Minuterie Portoir pour tubes d'élution (VWR, réf. CBSCGTR-096)
22 juin 2017 Page 2 de 7 Optionnel: Laveur ELISA (e.g. Biotek Instruments ELx50) 3.2.2 Matériel à usage unique Papier pour imprimante Feuille aluminium Microplaque 96 puits avec fond plat (Nunc Maxisorp F96, Thermo Scientific, ref. 442404) Feuille adhésive pour microplaque (Elscolab, réf COS4612) Nacelles à peser Marqueur indélébile Embouts pour micropipettes (bleu, jaune) Tubes Falcon 15 ml et 50 ml Microtube 0.5 (Sarstedt, 720609009 avec surface d'écriture et bouchon (pour conservation antigènes) Microtube 2 ml (Sarstedt, 720609001), avec surface d'écriture et bouchons rouges (Sarstedt, 650716003), verts (Sarstedt, 650716005)et( incolores (Sarstedt, 650716) (pour conservation conjugué et sérums de contrôle) Microtube 2 ml avec capuchon attaché (Sarstedt, 72691) pour élution papier filtre (tube d'élution) 3.2.3 Réactifs Contrôle positif: sérum humain de patient THA Contrôle négatif: sérum humain négatif pour THA Antigènes: glycoprotéines de surface variables (VSGs) LiTat 1.3 et LiTat 1.5 de T.b. gambiense, lyophilisées en quantités de 1 mg, produits par l'institut de Médecine Tropicale, Anvers. Conjugué: chèvre anti-igg humain (H+L)-peroxidase (Jackson, 109-035-003) Eau désionisée ou eau distillée NaH 2 PO 4.H 2 O (137.99 g/mol) Na 2 HPO 4.2H 2 O (177.99 g/mol) NaCl (58,44 g/mol) NaN 3 (65.01 g/mol) Lait écrémé (Sigma-Aldrich, réf. 70166-500G) Sucrose 1 kg (VWR, 1076511000) Glycérol 87%(VWR, réf. 1.04094.1000) Tampon substrat ABTS (Sigma-Aldrich, réf. 11112597001) Chromogène ABTS (Sigma-Aldrich, réf. 11112422001) 3.2.4 Échantillons Sang séché sur papier filtre Whatman 4 conservé dans des sachets en plastique avec du silicagel 3.3 Mode opératoire Noter que plusieurs microplaques ELISA peuvent être sensibilisées avec les antigènes de T.b. gambiense et gardées congelées avant usage. 3.3.1 Préparation des tampons PB 0.01 M ph 6.5 Quantité pour une plaque: 8 ml, ne pas conserver Substance Poids moléculaire par litre par 250 ml NaH 2 PO 4.H 2 O 137.99 g/mol 0.95 g 238 mg Na 2 HPO 4.2H 2 O 177.99 g/mol 0.55 g 138 mg
22 juin 2017 Page 3 de 7 PBS-Blotto 0.01 M, ph 7.4 Quantité pour 1 plaque: 40 ml Substance Poids moléculaire par litre par 250 ml NaH 2 PO 4.H 2 O 137.99 g/mol 0.2 g 50 mg Na 2 HPO 4.2H 2 O 177.99 g/mol 1.44 g 360 mg NaCl 58,44 g/mol 11.7 g 2930 mg NaN 3 65.01 g/mol 0.5 g 125 mg Lait écrémé 10 g 2500 mg Mélanger 30 min, laisser sédimenter pendant une nuit à 4 C. Décanter. Conserver à 4 C dans une bouteille Duran. PBS-sucrose 0.01M, ph 7.4 Quantité pour une plaque: 40 ml, ne pas conserver Substance Poids moléculaire par litre par 250 ml NaH 2 PO 4.H 2 O 137.99 g/mol 0.2 g 50 mg Na 2 HPO 4.2H 2 O 177.99 g/mol 1.44 g 360 mg NaCl 58,44 g/mol 8.2 g 2050 mg Sucrose 342,30 g/mol 50 g 12500 mg PBS-Tween 0.01 M, ph 7.4 Quantité pour une plaque: 500 ml, conserver jusque une semaine Substance Poids moléculaire par 5 litres par litre NaH 2 PO 4.H 2 O 137.99 g/mol 1.0 g 200 mg Na 2 HPO 4.2H 2 O 177.99 g/mol 7.2 g 1440 mg NaCl 58,44 g/mol 41.0 g 8200 mg Tween-20 2.5 ml 0.5 ml PBS-Blotto-Tween Quantité pour une plaque: 20 ml, conserver jusque une semaine PBS-Blotto + Tween 2 Substance par litre par 250 ml PBS-Blotto 1 l 250 ml Tween 20 500 µl 125 µl Tampon substrat ABTS Dissoudre 16.7 g poudre (Roche 12604400) dans 1 litre d'eau distillée. Conserver à 4 C pour maximum 3 mois Solution chromogène Dissoudre 1 comprimé ABTS (Roche 12740000, 50 mg/comprimé) dans 100 ml de tampon ABTS. Utiliser un cylindre gradué. Fermer avec du Parafilm et emballer avec une feuille d'aluminium pour protéger contre la lumière. Conserver à 4 C pour maximum une semaine 3.3.2 Préparation des antigènes
22 juin 2017 Page 4 de 7 REMARQUE: il est possible de sensibiliser plusieurs microplaques à la fois et de les conserver dans le congélateur à -80 C. Pour ceci, il faut inclure une étape après la saturation avec PBS-Blotto, c.à.d. une incubation avec le tampon PBS-Sucrose qui va protéger les antigènes lors de la congélation. Reconstituer les antigènes lyophilisés avec 1 ml d'eau distillée pour obtenir une concentration de 1 mg/ml. Vérifier si l'antigène est bien dissous. Diviser les solutions d'antigènes en volumes de 100 µl dans des microtubes Sarstedt de 0.5 ou 2 ml avec bouchon. Marquer le contenu et la date et conserver à -80 C 3.3.3 Sensibilisation des microplaques avec les antigènes Décongeler un tube de 100 µl de chaque antigène Par microplaque à sensibiliser, mesurer un volume de 8 ml de PB 0.01M, ph 6.5 dans un tube Falcon de 15 ml. Ajouter 8 µl dans de LiTAT 1.3 (solution 1 mg/ml) et 8 µl de LiTAT 1.5 (solution 1 mg/ml) dans 8 ml de tampon PB (dilution de 1/1000 de chaque antigène. Mélanger sur le vortex. Recongeler sans tarder le reste des antigènes. Avec un marqueur, tirer un ligne verticale entre la colonne 6 et 7 pour diviser la microplaque en deux. Seul le côté gauche sera sensibilisé (figure 1) Marquer sur le côté de la plaque le contenu et la date de sensibilisation (LiTat 1.3 + 1.5 dd/mm/yyyy) Verser la solution d'antigènes dans un réservoir à réactif et avec une micropipette multicanaux, ajouter 150 µl de la solution d'antigènes LiTat 1.3 et LiTat 1.5 dans chaque cupule des colonnes 1 à 6 de la microplaque. Laisser vides les colonnes 7 à 12 (sans antigène). Couvrir la microplaque avec un couvercle et laisser incuber pendant une nuit à 4 C. 3.3.4 Saturation Sortir la microplaque du frigo et jeter la solution d'antigènes en renversant la plaque Remplir chaque cupule de la microplaque avec 350 µl de PBS-Blotto et laisser incuber pendant une heure à température ambiante OPTIONNEL: Jeter le PBS-Blotto et remplir chaque cupule de la microplaque avec 350 µl de PBS- Sucrose et laisser incuber pendant 30 minutes à température ambiante Jeter le PBS-Sucrose, couvrir la microplaque avec une feuille adhésive et conserver à -80 C 3.3.5 Préparation des échantillons Imprimer ou copier la feuille "Echantillons" du fichier Excel "ELISA_Tbg_confetti.xlsx" comme feuille de paillasse Remplir la feuille de paillasse avec la date, le nom de l'opérateur, et le numéro de série d'échantillons si vous préparez plusieurs séries à la fois (le nombre d'échantillons à tester par série est 20) Préparer les tubes d'élution dans un portoir. Identifier le portoir avec le numéro de série si vous préparez plusieurs séries à la fois. Sortir un échantillon de sang séché sur papier filtre Whatman 4 de son enveloppe et noter le code de l'échantillon sur la feuille de paillasse et sur le tube d'élution Avec la perforatrice, couper un confetti de 6 mm de l échantillon de sang sur papier filtre dans le tube élution Remettre le filtre avec le reste de l'échantillon dans son enveloppe et vérifier si le silicagel est bien sec; sinon, remplacer le silicagel Après avoir découpé les confettis de tous les échantillons, ajouter 720 µl de tampon PBS-Blotto-Tween dans les tubes d'élution et éluer pendant une nuit à 4 C
22 juin 2017 Page 5 de 7 3.3.6 Exécution du test ELISA Sortir les échantillons du frigo et sortir la microplaque du frigo ou du congélateur; mélanger les échantillons sur le vortex Sérums de contrôle positif et négatif: préparer une dilution 1/150 des sérums de contrôle (10 µl dans 1.5 ml) dans du PBS-Blotto-Tween Lavage: laver la microplaque 3 fois avec 350 µl PBS-Tween par cupule pendant minimum 1 seconde; vider la plaque après le dernier lavage Incubation des contrôles et des échantillons: o déposer 150 µl de contrôle positif dans les cupules A1, A2, B1, B2, A7, A8, B7, B8; o déposer 150 µl de contrôle négatif dans les cupules C1, C2, C7, C8; déposer 150 µl de PBS-Blotto-Tween (contrôle conjugué) dans les cupules D1, D2, D7, D8 (voir schéma ci-dessous) o déposer 150 µl d'éluat du premier échantillon dans les cupules E1 et E2 (avec antigène) et les cupules E7 et E8 (sans antigène); répéter pour les autres échantillons selon le schéma ci-dessous et laisser incuber pendant 30 minutes Antigènes = LiTat 1.3 + LiTat 1.5 VSG Sans antigènes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C + C + 5 5 13 13 C + C + 5 5 13 13 B C + C + 6 6 14 14 C + C + 6 6 14 14 C C C 7 7 15 15 C C 7 7 15 15 D CC CC 8 8 16 16 CC CC 8 8 16 16 E 1 1 9 9 17 17 1 1 9 9 17 17 F 2 2 10 10 18 18 2 2 10 10 18 18 G 3 3 11 11 19 19 3 3 11 11 19 19 H 4 4 12 12 20 20 4 4 12 12 20 20 Lavage: laver la microplaque 3 fois 1 sec avec 350 µl PBS-Tween par cupule; vider la plaque après le dernier lavage Incubation du conjugué o diluer le conjugué 1:40,000 dans PBS-Tween en deux étapes: d'abord 5 µl dans 0.5 ml et puis 100 µl de cette dilution dans 40 ml REMARQUE: pour diluer le conjugué, ne jamais utiliser un tampon qui contient de l'azide (NaN 3 ) puisque l'azide bloque l activité de l enzyme peroxidase o déposer 150 µl du conjugué dilué dans chaque cupule de la microplaque et laisser incuber pendant 30 minutes Lavage: laver la plaque 5 fois 1 sec avec 350 µl de PBS-Tween par cupule, vider la plaque après le dernier lavage Incubation substrat/chromogène: déposer 150 µl de solution substrat/chromogène dans chaque cupule et laisser incuber pendant 1 heure Lecture: lire les O.D. à 415 nm (ou 405 ou 416 nm) et sauvegarder le fichier avec les données brutes. Noter le nom de ce fichier sur la feuille d'échantillons. 3.3.7 Calcul ses résultats REMARQUE: le calcul des résultats se fait avec le fichier Excel "ELISA_Tbg_confetti.xlsx". Ce fichier est protégé et ne peut être modifié. Pour
22 juin 2017 Page 6 de 7 garder les résultats en forme électronique, il faut sauvegarder le fichier sous un autre nom en ajoutant la date et le numéro de la plaque avant le nom du fichier (p.e. 2017-06-20-1-ELISA_Tbg_confetti.xlsx Ouvrir le fichier Excel "ELISA_Tbg_confetti.xlsx Sélectionner la feuille "Echantillons" et transcrire les données sur la feuille de paillasse dans les cases correspondantes du fichier électronique. Sélectionner la feuille "Données brutes" et remplir les cases grises en haut de la page (date, lot des antigènes etc.) Ouvrir le fichier avec les O.D. de la microplaque et copier les O.D.s sur la feuille "Données brutes" dans la zone indiquée "Densités optiques brutes" Imprimer cette feuille et la signer Ouvrir la feuille "Résultats" et l'imprimer et signer Sauvegarder le fichier "ELISA_Tbg_confetti.xlsx " sous un autre nom en ajoutant la date et le numéro de série devant le nom, p.e. "2017-06-20-1- ELISA_Tbg_confetti.xlsx" Fermer le fichier "ELISA_Tbg_confetti.xlsx" sans le sauvegarder (le fichier est protégé) 3.3.8 Interprétation des résultats Négatif: 0-30 Percent Positivity du contrôle positif Positif: >30 PP du contrôle positif Reject: quand la différence entre deux répétition d'un échantillon ou d'un sérum de contrôle est trop grande, le résultat est rejeté. Au cas où le résultat d'un échantillon est rejeté, il faut répéter le test pour cet échantillon. Au cas où le résultat d'un contrôle est rejeté, il faut répéter toute la microplaque. 3.3.9 Déchets, nettoyage Rincer le laveur ELISA avec de l'eau distillée Déposer tout le matériel à usage unique dans un conteneur pour déchets contaminés Nettoyer la paillasse avec une solution de 2% hypochlorite 4. Définitions & abréviations ABTS 2,2 -azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) C ++ Contrôle positif C - Contrôle négatif CC Contrôle conjugué ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay IMT Institut de Médecine Tropicale, Anvers O.D. Optical density PB Phosphate buffer PBS Phosphate buffered saline PO Peroxidase THA Trypanosomiase humaine africaine VSG Variant Surface Glycoprotein 5. Historique du document Révision SOP-LAB-24-ELISA/T.b.gambiense sur sang séché sur papier filtre, Version 1.0, 18 juin 2017 Version initiale
22 juin 2017 Page 7 de 7 SOP-LAB-24-ELISA/T.b.gambiense sur sang séché sur papier filtre, Version 1.1, 22 juin 2017 Erreur dans la composition de PBS Nom et fonction Date Signature Auteur Philippe Büscher 22/06/2017 Révision par Approuvé par Veerle Lejon 22/06/2017