Travaux pratiques d Immunologie : Allergie et Compatibilité V. Garlatti 2016
I. Instructions Ces travaux pratiques vous vous permettre de réaliser différentes techniques immunologiques à travers deux problématiques pathologiques différentes. Vous devez avant de venir en Travaux Pratiques prévoir les témoins pour chaque expérience voire les échantillons que vous voulez tester. Vous réaliserez un compte-rendu par thème. II. Analyse de l allergie au blanc d oeuf La blanc d oeuf provoque souvent de l urticaire et de l eczéma chez les enfants en bas âge. Les symptômes qui ont été le plus souvent observés au cours d une étude sur 84 enfants allergiques aux oeufs sont prurits et dermatites atopiques. Une étude de suivi réalisée sur des nourrissons a montré que ceux qui présentaient une allergie au blanc d oeuf était les plus susceptibles de développer une allergie respiratoire à partir de l âge de sept ans. En général, le blanc d oeuf cuit est moins allergisant que le blanc d oeuf cru. Les principales protéines allergisantes du blanc d oeuf sont la conalbumine (ovotransferrine), l ovomucoïde, l ovalbumine et le lysosyme. L ovomucoïde résiste à la chaleur à l acide et aux enzymes protéolytiques. En terme de composition, le blanc d oeuf contient de l ovalbumine (58 pour cent, 46000 Da), de la conalbumine (14 pour cent, 82000 Da), de l ovomucoïde (11 pour cent, 28000 Da), des ovoglobulines (8 pour cent, 36-45000 Da) et du lysosyme (3,5 pour cent, 14300 Da). Le sérum d un patient a été prélevé afin d analyser les anticorps présents. Il s agit ici de déterminer la présence ou non d anticorps impliqués dans l allergie au blanc d oeuf et, le cas échéant de trouver l antigène reconnu. Trois méthodes de détection vont être utilisées : une méthode directe appelée la méthode d Ouchterlony, deux méthodes indirectes : Western Blot et le Dot Blot. A. Recherche de l antigène cible par la méthode d Ouchterlony La méthode de double diffusion sur gel est une méthode d immunoprécipitation fondée sur la diffusion d antigènes et d anticorps en milieu solide (en général un gel d agarose) à partir de puits placés en vis à vis. Lorsque les molécules d anticorps 1
rencontrent les molécules d antigènes, la liaison antigène-anticorps conduit à la précipitation des complexes immuns dans la zone de rencontre. Le précipité se forme dans la zone où les concentrations des deux solutions sont comprises dans la zone d équivalence. La methode d Ouchterlony peut etre utilisee notamment pour detecter la presence d anticorps specifiques dans un serum, pour mettre en evidence un antigene donne dans un liquide biologique, pour determiner la zone d equivalence ou pour evaluer le degre d identite (nul, total ou partiel) entre differents antigenes. En effet, des antigenes possedant une identite partielle avec celui contre lequel ont ete produits les anticorps sont susceptibles de donner une reaction croisee conduisant a des arcs de precipitation d aspect particulier. On peut ainsi identifier des relations de parente entre les organismes dont proviennent les antigenes et celui ayant fourni les anticorps. En outre, la position du precipite dependant de la concentration relative des antigenes et des anticorps, il s agit d une methode semi-quantitative. Figure 1: Ouchterlony : Résultats attendus 2
1. Matériel a) Materiel biologique - anti-serum de patient : serum de patient suppose allergique au blanc d œuf dont les Immunoglobulines ont ete purifees. - Ovalbumine de poulet : Concentration : entre 250 g.ml-1 et 125 g.ml-1 (de BSA pour le test) - Conalbumine de poulet :. Concentation 250 g.ml-1 et 125 g.ml-1 - Lysosyme 20mg/mL dans de l eau - Œufs de poule : b) Solutions - Tampon phosphate sale (phosphate buffer saline PBS) NaCl : 8 g NaH2PO4, 2H2O : 0,4 g Na2HPO4, 12H2O : 2,7 g ou Na2HPO4 anhydre : 1,08 g Eau distillee : 1 000 ml c) Autre materiel - boites de petri - un emporte piece (pipette pasteur) 2. Préparation du gel et des échantillons a) Le gel Mélanger 1,5g d agarose dans 100mL de PBS dans erlenmeyer. Chauffer sur plaque jusqu à ce que la solution soit limpide. Laissez refroidir. Lorsque le flacon peut être 3
saisi sans se brûler, couler l agarose dans des boîtes de pétri sur une épaisseur de 0,5 à 1cm sans faire de bulles. Laissez refroidir jusqu à durcissement. Pour préparer les puits, percez l agarose à l aide d une pipette pasteur : un puit au centre pour le sérum et 6 puits concentriques pour les antigènes potentiels. Attention la distance entre le puit central et les puits alentour est essentielle. Il peut être important de tester plusieurs distances (entre 0,5cm et 1cm). Figure 2: Ouchterlony : préparation du gel b) Les échantillons Vous disposez de poudre l ovalbumine et de conalbumine, d une solution à 20 mg/ml de lysosyme et d oeuf. Afin d extraire et de diluer les protéines du blanc d oeuf, diluer celui-ci dix fois dans du PBS. Agiter à l aide d un barreau aimanté puis filtrer sur gaze. L ovalbumine, la conalbumine et le lysosyme devront être utilisés à des concentrations comprises entre 125 et 250 µg/ml. Les échantillons peuvent être cuits. 4
c) Préparation des dépots Vous déposerez 10 µl de sérum au centre t 20 µl d antigènes potentiels autours. Il faut penser aux témoins positifs et négatifs et s assurer d avoir couvert suffisamment de conditions pour en avoir au moins une qui fonctionne. De plus, La position des échantillons les uns par rapport aux autres peuvent vous donner ou non des informations quant à une identité partielle ou totale entre les antigènes. Chaque étudiant dispose d une boîte, ce qui est peu, il est donc essentiel de vous répartir les conditions et de mettre en commun les résultats. Vous devez arriver en Travaux Pratiques avec des propositions de plans. Les boîtes seront incubées 24 à 48h dans une chambre humide. B. Recherche de l antigène cible par Western Blot et Dot Blot 1. Préparation des membranes pour les Western Blot et le Dot Blot a) Migration des échantillons sur des gels 12,5 pour cent Vous allez préparer des échantillons en les diluant dans du Laemli 2X (100 µl d échantillon plus 100 µl de Laemli) puis en les faisant bouillir pendant 1mn : - Blanc d oeuf au 10ème dans du PBS (dépot : 5 µl et 2,5µL) - Conalbumine 1 mg/ml ( dépot : 30 µl et 15µL ) - Ovalbumine 1mg/mL (dépot : 30 µl 15µL) - Lysosyme 1mg/mL (dépot : 30 µl 15µL) Déposer les échantillons dans les puits d un gel 12,5 pour cent ainsi qu un puit contenant 10 µl de marqueur (pink prestained protein Ladder, Genetics, 175 kda/130 kda/90 kda/70 kda/60 kda/50 kda/40 kda/30 kda/20 kda/15 kda). Mettre à migrer pendant environ 1h (80 ma par gel). b) Transfert sur membrane de nitrocellulose La membrane de nitrocellulose fixe fortement les protéines. Pour éviter de contaminer celle-ci vous devez porter des gants et utiliser une pince pour la manipu- 5
Figure 3: Principe du Western-Blot ler. Mettre à équilibrer 4 feuilles de papier Watmann ainsi que la membrane dans du tampon de transfert (Thermoscientific) pendant 10 à 15 mn. Mettre le gel à rincer dans de l eau distillée pendant 5 à 10 minutes puis le mettre à équilibrer dans du tampon de transfert pendant 5 à 10 minutes. Monter directement le sandwich dans l appareil de transfert en posant d abord sur la cathode deux feuilles de papier Watmann puis la membrane que vous inciserez en bas à droite puis le gel en le mettant bien aligné sur la membrane (vous ne pouvez plus le déplacer quoi qu il arrive) et enfin deux feuilles de papier watmann. Enlever les bulles en roulant une pipette. Refermez avec l anode. 6
Transférez les protéines sur la membrane pendant 20 minutes à 25V. Rincez la membrane et les électrodes à l eau distillée. c) Vérification du transfert Mettre la membrane dans du rouge ponceau 0,2 pour cent jusqu à apparition des bandes de protéines. Prenez une photographie au transilluminateur. Enlever le rouge ponceau à lavant à l eau distillée. 2. Préparation des membranes pour le Dot Blot Le Dot Blot consiste à déposer des protéines sur une membrane à l aide d une pipette puis à réaliser une détection avec un anticorps pour savoir quelle protéine se comporte comme un antigène. ici les protéines sont dans leur forme native. Découpez une bande de membrane de nitrocellulose (1cm sur 10 cm). Déposez une goutte de 2µL de protéine (antigène potentiel) tous les centimètres environ. Laissez sécher 10mn. Avant de venir en travaux pratiques, prévoyez un plan de dépôt pour savoir quelle protéine ou mélange vous voudriez tester et éventuellement si vous voulez traiter la protéine en amont (chaleur ou autre) 3. Marquage des membranes Mettre les membranes dans un tampon de blocage : 0,5 pour cent (m/v) de lait dans du TNT low (Tris 10mM ph 7,2, NaCl 200mM Tween 0,5 pourcent (v/v)). Incuber sous agitation 1h à température ambiante. Transférer les membranes dans 10 ml de tampon de blocage contenant le sérum du patient au 1/10000 ème. Laisser la nuit sous agitation à 4C. Laver la membrane trois fois 10 mn dans du tampon TNT low sous agitation. Ajouter 10 ml de tampon de blocage contenant l anticorps secondaire couplé à la HRP (Horse Radish péroxydase) dirigé contre les anticorps humains au 1/5000 ème. Incuber 1h30 à température ambiante. 7
Laver trois fois avec du tampon TNT (low) pendant 10mn sous agitation. Poser la membrane sur un film alimentaire. Ajouter 0,5 ml du substrat TMB. Attendez de voir apparaitre des bandes. Enlever le trop plein de substrat par capillarité à l aide de papier filtre et rincer. Le substrat donne un produit bleu en présence de peroxydase qui a tendance à virer au jaune lorsque que la quantité de peroxydase et trop forte. Emballer la membrane dans du film alimentaire sans faire de pli et prendre une photographie au transilluminateur. 8
III. Analyse de compatibilite sanguine et recherche de pathogene Le serum d un mouton a ete injecte a un autre mouton blesse afin de rectifier son volume total. Une heure plus tard le mouton receveur etait mort. L analyse de son sang a montre un fort taux d hemoglobuline dans le serum et une chute de l hematocrite revelant une hemolyse du sang. Deux choses peuvent etre a l origine d une hemolyse sanguine : un pathogene, par exemple des streptocoques, ou l activation du systeme du complement. L objectif est de comprendre ce qui est arrive au mouton receveur. Pour cela, des globules rouges du mouton receveur ont ete separes du serum et du serum du mouton donneur a ete preleve. Ce serum a ete chauffe pendant 30mn a 70C de facon a detruire les composants thermolabiles du complement. A partir de ces prelevements, nous allons tester l activation du complement et rechercher la presence de strepctocoques hemolytiques. Pour cela, nous allons realiser trois manipulations : - Tests de sero-compatibilite : par une technique d hemaglutination nous allons tester la presence d anticorps diriges contre les GR du receveur dans le serum du donneur. Nous allons ensuite utiliser du complement purifie pour tester la capacite du serum du donneur a activer le complement sur les GR du receveur - Test ASL : le test ASL permet de detecter la presence d anticorps anti-streptolysin O dans le serum du receveur. Ces anticorps sont produits de facon systematique lors d une infection par un streptocoque hemolytique. 1. Materiel a) Materiel biologique. - GR du mouton receveur pour sero-compatibilite a 50 pour cent (GRs) - GR du mouton receveur a 50 pour cent pour test ASL (GRa) - Serum du receveur (SerR) - Serum decomplemente du donneur (SerD) - Complement purifie dilue au 20eme (Comp) - Serum contenant des Ac-anti streptolysine O : 400UI/mL 9
b) Solutions - Tampon pour sero-compatibilite : Note R1 - Tampon PBS pour test ASL (Phosphate-NaCl ph 6,6) : Note R2 c) Autres - Microscope - Lames - Barrettes pour kit ASl et support de barrette : les barrettes possedent des puits avec des quantites croissantes de streptolysine O. 2. Hémagglutination a) Principe En presence d anticorps anti-hematies, les hematies forment un complexe immun avec ces anticorps. b) Manipulation Pour tester la presence d anticorps anti-hematies dans un serum, on melange 20 µl d hematies de mouton a 10 pour cent avec 20 µl de serum a tester dilue au 5eme. Melanger avec un cure dent. Observer au bout de 30mn a l œil nu et au microscope. Pensez a prevoir des temoins. 3. Activation du complément Si les anticorps anti-gr sont presents dans le serum, il est interessant de tester leur capacite a activer le complement. 10
Pour cela, mettre dans le nombre de tubes necessaires une heure avant 0,6 ml d hematies de mouton a 2 pour cent. Ajouter 0,6mL de serum du donneur dilue au 20eme et 0,3mL de complement dilue au 20eme. Prevoir des tubes controles avant de commencer l experience. Si besoin, le volume de ces tubes pourra etre complete avec du tampon. 4. Test ASL a) Principe Les streptocoques produisent une proteines : la streptolysine O qui a comme propriete de lyser les globules rouges. Si on met cette streptolysine en presence de globules rouges, on observe une hemolyse importante. Les anticorps anti-streptolysin produits lors d une infection a streptocoques neutralisent cet enzyme bloquant son activite hemolytique. b) Manipulation - dans des puits contenant des quantites croissantes de streptolysine O mettre : 75 µl de serum a tester dilue au 100eme dans un tampon R2. Melanger par tapotement lateral manuel lateral pendant 1mn. - Incuber 15 mn a T ambiante - Ajouter 75uL d hematies a 2 pàur cent (dilution de 50 pour cent a 2 pour cent dans tampon R2) - Agiter doucement pour homogeneiser - Incuber 1h15 a 1h30 a T ambiante. Prevoir un (des) controles avant de commencer la manipulation. 11
IV. Les compte-rendus Vous réaliserez un compte-rendu pour chaque partie (Analyse de l allergie et analyse de compatibilité). Nom et prénom du ou des auteurs ; Date de la manipulation Titre du TP I Introduction L introduction doit contenir trois paragraphes : - Amener le sujet : Replacer les travaux dans un contexte bibliographique plus général - Poser la problématique de l étude - Principe : vous devez expliquer comment les expériences vont vous aider à répondre à la problématique. II Matériel et Méthode La partie Matériel et Méthode consiste à décrire le matériel spécifique utilisé en travaux pratiques et en la description des protocoles utilisés. Vous devez rédiger et non établir des listes. A. Matériel La partie matériel n est pas indispensable, elle sert à décrire le matériel biologique utilisé (anticorps, lignées cellulaires, enzymes) quand celui-ci est conséquent. Elle ne doit en rien être une liste exhaustive de la verrerie utilisée et doit être rédigée sous forme de phrases. B. Méthodes Dans cette sous-partie vous décrivez vos manipulations en rédigeant. Vous devez impérativement indiquer les concentrations des solutions mères que vous utilisez et les temps d incubation. Si vous réalisez plusieurs fois le même type d expérience, ne la décrivez qu une fois et faites un tableau (en annexe) pour résumer les conditions particulières à chaque expérience. Vous devez être concis et nous devons être capables de refaire la manipulation à partir de votre compte rendu. III- Résultats Pensez dans ce TP à prendre des photographies de vos résultats et à bien justifier le choix de vos témoins ainsi que l organisation de vos tests. 12
Cette partie doit se suffire à elle-même sans avoir besoin de lire le matériel et méthode. Si le TP a donné lieu à plusieurs expériences, chacune d entre-elles doit être décrite de la façon suivante : Titre contenant le résultat obtenu et la méthode utilisée Introduction En une phrase ou deux vous devez présenter l objectif de l expérience et son principe. - Présentation des résultats : Les résultats doivent être présentés sous forme de figure, incluse dans le texte ou donnée en annexe. Pour les figures de résultat, vous devez : - Graphique : titre, échelle, équation voire coefficient de corrélation, légende - Tableau : titre - Figures imagée (photo, dessin ou autre) : titre, une légende qui permette de comprendre la figure Une figure doit se suffire à elle-même sans nécessiter de lire le texte à côté. Si vous avez fait des calculs pour obtenir votre figure vous devez donner un exemple de calcul. - Analyse des Résultats : Vous devez décrire vos résultats d un point de vue qualitatif (ce que vous observez) et d un point de vue quantitatif. Vous devez être rigoureux sur cette analyse. - Discussion : Partielle uniquement sur la qualité des résultats (coefficient de corrélation..) - Conclusion : Il faut absolument faire une phrase de conclusion sur vos résultats. Si vos résultats ne vous paraissent pas suffisamment clairs pour répondre à la problématique, vous devez le dire à ce stade. III Discussion Tout résultat obtenu doit être discuté : - en analysant la qualité générale de votre travail - en le comparant à la littérature. IV - Conclusion et Perspectives Pour cela, vous réalisez deux paragraphes distincts : - un paragraphe de synthèse des diverses expériences mises en œuvres et voir si vous avez répondu avec vos résultats à l objectif de départ des travaux pratiques. 13
- Un paragraphe d ouverture dans lequel vous proposerez des expériences complémentaires ou des expériences à réitérer. NB : Ce n est pas la peine de gâcher des kilomètres de papier. Soyez concis et précis, vous ne serez pas notés au poids. 14